：本發(fā)明涉及的是生物中，具體涉及的是一種高親水性、重組人源膠原蛋白片段串聯(lián)體的制備方法。

背景技術(shù)

0、
背景技術(shù)：

1、膠原蛋白ⅲ是構(gòu)成人體多種組織的重要成分，尤其在血管壁、內(nèi)臟和胚胎等組織中起到維持器官結(jié)構(gòu)和彈性的關(guān)鍵作用。膠原蛋白管主要用于人工血管、血管狹窄和栓塞治療用人工血管導(dǎo)管、神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管等。其藥用價(jià)值主要體現(xiàn)在創(chuàng)傷愈合、關(guān)節(jié)保健和骨骼健康方面；醫(yī)美價(jià)值則主要體現(xiàn)在美容護(hù)膚、抗衰老和填充塑形方面。

2、天然的膠原本身具有止血功能，能促進(jìn)血小板凝聚和血漿結(jié)塊。膠原蛋白可作為細(xì)胞生長(zhǎng)的依附和支架物，能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞等的增殖。膠原蛋白的生物降解性，使得膠原蛋白可作為器官移植材料而被利用。膠原具有一點(diǎn)的機(jī)械強(qiáng)度，目前被廣泛應(yīng)用到美容的填充。目前，膠原蛋白作為生物醫(yī)藥和生物醫(yī)用材料的新寵，其中膠原蛋白溶液主要用于修復(fù)皮膚組織、軟組織填充材料、骨組織再生填料等；膠原蛋白海綿主要用于外科止血、口腔再吸收性敷料、組織填充、組織工程支架等，膠原蛋白膜主要用于促牙周腔膜的再生、人造皮膚、燒傷燙傷的皮膚覆膜、促皮膚角膜上皮細(xì)胞愈合等；膠原蛋白顆粒主要用于骨折與骨缺損填料、藥物緩釋等；

3、目前，通過蛋白酶解法，利用動(dòng)物皮膚組織(豬皮、魚皮、驢皮等)來(lái)生成膠原蛋白是一種方法，生產(chǎn)的膠原蛋白組成穩(wěn)定，具有生物活性，但常常帶有組成的不均一性、明顯的抗原性和人獸共患病病毒的隱患，限制了它們?cè)谒幱煤歪t(yī)美領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。目前基因重組技術(shù)是生產(chǎn)重組人源膠原蛋白的主要方法，大腸桿菌表達(dá)膠原時(shí)易產(chǎn)生的致熱原致使表達(dá)產(chǎn)物難以應(yīng)用于臨床；同時(shí)，目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，致使產(chǎn)物純化困難；原核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工修飾體系不完善，而膠原本身具有較多的二硫鍵，這導(dǎo)致原核表達(dá)的產(chǎn)物其生物活性較低等。要得到性能更好的重組膠原蛋白必需要經(jīng)過真核生物足夠的翻譯后修飾，包括羥基化和糖基化等。1997年芬蘭奧盧大學(xué)膠原蛋白研究中心首先利用畢赤酵母表達(dá)人膠原蛋白，但表達(dá)量太低。經(jīng)過膠原蛋白結(jié)構(gòu)的解析和酵母表達(dá)嘗試，高效表達(dá)膠原蛋白片段成功可能。2012年劉斌等利用畢赤酵母，通過甲醇誘導(dǎo)，高效分泌了高親水性類人源重組膠原蛋白二聚體。從眾多報(bào)導(dǎo)來(lái)看，人膠原蛋白在酵母中的重組表達(dá)已然成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，使其產(chǎn)業(yè)化成為可能。由于膠原的多的藥用價(jià)值，膠原蛋白的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求一直很大。目前重組膠原由于產(chǎn)量低、純化分離耗資大，使其價(jià)格昂貴，因此，開發(fā)一種高效、提供穩(wěn)定來(lái)源，同時(shí)又能保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)完整性的膠原蛋白制備方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

0、
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、本發(fā)明的目的是提供一種重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體的制備方法，這種重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體的制備方法用于解決現(xiàn)有技術(shù)中重組膠原產(chǎn)量低、純化分離耗資大，價(jià)格昂貴的問題。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：這種重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體的制備方法包括以下步驟：

3、步驟一、構(gòu)建表達(dá)重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體的畢赤酵母工程菌，篩選獲得高效表達(dá)的畢赤酵母工程菌:

4、(1)根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性，以人膠原蛋白ⅲ串聯(lián)片段的氨基酸順序?yàn)榛A(chǔ)，利用畢赤酵母高頻密碼子對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，添加tga終止密碼，全長(zhǎng)1191bp，命名為396c,基因優(yōu)化結(jié)果如seq?no.3所示；

5、(2)將優(yōu)化后的基因通過無(wú)縫合成，插入到畢赤酵母組成型分泌表達(dá)載體pgapzaa中；然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，構(gòu)建和篩選含有pgapza-396的陽(yáng)性菌株；將線性化的pgapza-396cdna，轉(zhuǎn)化入巴氏畢赤酵母sdm1168中，進(jìn)行人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體的表達(dá)，篩選得的巴氏畢赤酵母基因工程菌；

6、步驟二、對(duì)重組酵母進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體高效表達(dá)；

7、步驟三、從發(fā)酵液中分離純化重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體蛋白。

8、上述方案中重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體基于人ⅲ型膠原蛋白α1鏈膠原域gly-x-y的三肽重復(fù)序列特征和強(qiáng)大的親水性，選取人源膠原蛋白iii第981位氨基酸至1079氨基酸的99個(gè)氨基酸片段并串聯(lián)4次，得到含396個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)，如seq?no.2所示，單體分子量為46kda，三聚體分子量為138kda；人源膠原蛋白iii第981位氨基酸至1079氨基酸的99個(gè)氨基酸片段如seq?no.1所示。

9、上述方案步驟二具體為：

10、采用高密度發(fā)酵技術(shù)，以ypd培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過間接補(bǔ)料分批培養(yǎng)，以提高巴氏畢赤酵母基因工程菌株的細(xì)胞密度和蛋白質(zhì)表達(dá)量；同時(shí)，種子培養(yǎng)基為ypd，三角瓶裝載量為容量的1/5，培養(yǎng)條件為30℃230rmp，當(dāng)od600＝1.3-1.5時(shí)4℃?zhèn)溆?；發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蛋白胨2％、酵母提取物1％、葡萄糖2.5％，泡敵0.02％，接種量為10％，最佳發(fā)酵條件為30℃、通氣量為1.3-1.5vvm，罐壓0.17-0.3mpa，攪拌轉(zhuǎn)速300-350r/min，使溶氧>30％，流加體積分?jǐn)?shù)為20％的氨水，使ph值維持在7.2～7.5；發(fā)酵18小時(shí)后，分別用20％的無(wú)菌葡萄糖、含有20％的蛋白胨和10％的酵母提取物的無(wú)菌混合液進(jìn)行流加補(bǔ)料，流加時(shí)間為36小時(shí)，維持發(fā)酵液含1％葡萄糖濃度，當(dāng)菌體質(zhì)量濃度達(dá)320g/l、od600達(dá)300時(shí)放罐，發(fā)酵時(shí)間為60-62小時(shí)。

11、上述方案步驟三具體為：

12、將發(fā)酵液4℃、8000-10000g離心10分鐘，取上清；攪拌中緩慢加入硫酸銨粉末，使溶液硫酸銨飽和度達(dá)到50％，然后4℃、9000-10000g離心15分鐘，取沉淀，使用50％硫酸銨溶液洗滌沉淀一次，9000-10000g離心15分鐘，沉淀用蒸餾水溶解沉淀后，4℃、9000-10000g離心15分鐘，取上清；用sephadex?g-50和溶液20mm?tris-cl?ph?7.5進(jìn)行對(duì)上清液進(jìn)行脫鹽，收集280nm紫外檢出峰溶液；再利用q?seplife?ff離子交換進(jìn)行柱層析，20mm?tris-clph?7.5緩沖液平衡柱體，上樣后，使用ph?7.5、20mm?tris-cl加1m?nacl線性洗脫，收集20mmtris-cl加0.15m?nacl的280nm紫外檢出的洗脫峰；然后使用sephadex?g-100凝膠柱層析分離純化，pbs溶液洗脫，收集最大峰的液體即為目的蛋白，溶液經(jīng)截留分子量30kda的超濾濃縮，再經(jīng)冷凍干燥得到重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體。

13、上述方案重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體產(chǎn)量達(dá)到6-7g/l。

14、本發(fā)明具有以下有益效果：

15、1、本發(fā)明提供了一種利用重組畢赤酵母進(jìn)行組成型、高效分泌表達(dá)重組人膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體的方法及其發(fā)酵和提取該重組膠原的技術(shù)，該重組人源膠原氨基酸結(jié)構(gòu)和基因與目前所報(bào)道的不同，于甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母相比，該高密度發(fā)酵更簡(jiǎn)單易操作，發(fā)酵周期更短、所使用的培養(yǎng)基配方更簡(jiǎn)單和廉價(jià)，純化提取方法更高效便捷。

16、2、本發(fā)明重組人源膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體是一個(gè)全新的氨基酸序列，但是又完全由人源膠原蛋白ⅲ片段組成的，其編碼的基因是全新的人工基因序列；該方法較易地實(shí)現(xiàn)了該膠原蛋白工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)，所表達(dá)的重組蛋白具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的特性。

17、3、本發(fā)明可以高效、穩(wěn)定地生產(chǎn)結(jié)構(gòu)均一的重組人膠原蛋白ⅲ片段串聯(lián)體，并且保持其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性。與傳統(tǒng)的畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)方法相比，本方法具有更好的易操作性、培養(yǎng)基成本更低，發(fā)酵時(shí)間更短，較適用于工業(yè)化生產(chǎn)。