本發(fā)明涉及生物，具體而言涉及一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法。

背景技術(shù)：

1、胰蛋白酶，是蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動(dòng)物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原被合成后，作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。胰蛋白酶廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥制造、科學(xué)研究等行業(yè)。國際上promega(普洛麥格)公司生產(chǎn)的質(zhì)譜級胰蛋白酶，幾乎壟斷了蛋白質(zhì)組學(xué)工具酶市場，產(chǎn)品價(jià)格極其昂貴。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究所需酶制劑上，對promega公司存在很大依賴，迫切需要開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)的新型高穩(wěn)定性胰蛋白酶制劑。

2、胰蛋白酶在應(yīng)用過程中，不僅會(huì)水解底物蛋白，也會(huì)快速降解自身蛋白分子，引起酶活力的迅速下降，自切現(xiàn)象制約了胰蛋白酶的水解效率和應(yīng)用水平。提高胰蛋白酶的抗自切能力，將會(huì)提高其水解效率，降低應(yīng)用成本。近年來，化學(xué)修飾已經(jīng)成功地用于增強(qiáng)酶在溶液中熱變性和自溶失活的穩(wěn)定性。如申請?zhí)枮?02010992651.9的發(fā)明申請中公開了一種新型抗自切甲基化胰蛋白酶及其制備方法，包括以下步驟：a)使用含有5mm?cacl2的50mm醋酸溶液配制5～15mg/ml的胰蛋白酶。b)混合1m二甲胺硼烷(dmab)溶液和1m甲醛溶液，按1:2體積比配置甲基化試劑。c)取步驟a)配制的胰蛋白酶溶液，并按1000:(15～60)的體積比，添加步驟b)配制的甲基化試劑，在4℃、避光的條件下震蕩反應(yīng)2～4h進(jìn)行甲基化修飾反應(yīng)。

3、通過化學(xué)基團(tuán)修飾提高胰蛋白酶抗自切能力具有重要意義，為實(shí)現(xiàn)高穩(wěn)定胰蛋白酶的產(chǎn)業(yè)化建立了重要的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用羥乙基或peg修飾獲得的抗自切胰蛋白酶。

2、本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

3、步驟1)、配制修飾劑溶液；所述修飾劑包括乙二醇單甲磺酸酯或peg單甲磺酸酯；

4、步驟2)、使用5mm氯化鈣溶液配制5～20mg/ml的胰蛋白酶；

5、步驟3)、取步驟2)配制的胰蛋白酶溶液，添加步驟1)中配制的修飾劑溶液，攪拌，進(jìn)行修飾反應(yīng)；

6、步驟4)、將步驟3)中的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行超濾、稀釋，得到羥乙基化胰蛋白酶或peg化胰蛋白酶；

7、具體修飾反應(yīng)如下：

8、

9、其中，n≧2。

10、進(jìn)一步地，步驟1)中，所述修飾劑溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～25％乙二醇單甲磺酸酯的水溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5～25％?peg單甲磺酸酯的dmf溶液。

11、進(jìn)一步地，步驟3)中，修飾反應(yīng)的條件為：0～25℃、避光，調(diào)節(jié)ph至7～10；修飾反應(yīng)的時(shí)間為0.5～4h。

12、進(jìn)一步地，步驟4)中，使用截留分子量3～10kda的超濾膜超濾，用10～50mm醋酸溶液沖洗超濾膜并稀釋至蛋白質(zhì)濃度為5～15mg/ml，將化學(xué)修飾胰蛋白酶保存在4℃條件下。

13、進(jìn)一步地，所述修飾劑與胰蛋白酶的摩爾比為2～30。

14、進(jìn)一步地，所述peg單甲磺酸酯的聚合度為2～10。

15、進(jìn)一步地，所述羥乙基化胰蛋白酶孵育自切2、4、6、8、10、12、24、32、48小時(shí)后的酶活保留率均高于野生型胰蛋白酶；所獲羥乙基化胰蛋白酶的酶活收率大于85％，自切12小時(shí)酶活保留率大于90％。

16、進(jìn)一步地，所述peg化胰蛋白酶孵育自切12小時(shí)后的酶活保留率高于野生型胰蛋白酶；所獲peg化胰蛋白酶的酶活收率大于80％，自切12小時(shí)酶活保留率大于90％。

17、本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，通過羥乙基或peg修飾獲得了一種新型的抗自切胰蛋白酶，其抗自切能力相比野生型胰蛋白酶顯著增強(qiáng)；相比較甲基化修飾，甲基導(dǎo)致胺基的脂溶性變大，羥乙基或peg修飾對胺基的脂溶性影響較小，因而對酶活性影響較??；通過羥乙基化或peg修飾所獲得的抗自切胰蛋白酶，相比野生型的酶活收率不低于85％，自切12小時(shí)后的酶活保留率不小于90％。

技術(shù)特征：

1.一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于：步驟1)中，所述修飾劑溶液為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-25％乙二醇單甲磺酸酯的水溶液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-25％peg單甲磺酸酯的dmf溶液。

3.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于，步驟3)中，修飾反應(yīng)的條件為：0～25℃、避光，調(diào)節(jié)ph至7～10；修飾反應(yīng)的時(shí)間為0.5～4h。

4.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于：步驟4)中，使用截留分子量3～10kda的超濾膜超濾，用10～50mm醋酸溶液沖洗超濾膜并稀釋至蛋白質(zhì)濃度為5～15mg/ml，將化學(xué)修飾胰蛋白酶保存在4℃條件下。

5.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于：所述修飾劑與胰蛋白酶的摩爾比為2～30。

6.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于：所述peg單甲磺酸酯的聚合度為2～10。

7.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于：所述羥乙基化胰蛋白酶孵育自切2、4、6、8、10、12、24、32、48小時(shí)后的酶活保留率均高于野生型胰蛋白酶；所獲羥乙基化胰蛋白酶的酶活收率大于85％，自切12小時(shí)酶活保留率大于90％。

8.如權(quán)利要求1所述的一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，其特征在于：所述peg化胰蛋白酶孵育自切12小時(shí)后的酶活保留率高于野生型胰蛋白酶；所獲peg化胰蛋白酶的酶活收率大于80％，自切12小時(shí)酶活保留率大于90％。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種抗自切化學(xué)修飾胰蛋白酶的制備方法，包括以下步驟：步驟1)、配制修飾劑溶液；所述修飾劑包括乙二醇單甲磺酸酯或PEG單甲磺酸酯；步驟2)、使用5mM氯化鈣溶液配制5～20mg/ml的胰蛋白酶；步驟3)、取步驟2)配制的胰蛋白酶溶液，添加步驟1)中配制的修飾劑溶液，攪拌，進(jìn)行修飾反應(yīng)；步驟4)、將步驟3)中的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行超濾、稀釋，得到羥乙基化胰蛋白酶或PEG化胰蛋白酶。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了胰蛋白酶穩(wěn)定性的顯著提升，極大地減少了胰蛋白酶因自切帶來的酶活損失和對應(yīng)用效果的干擾，為將來實(shí)現(xiàn)高穩(wěn)定胰蛋白酶的生產(chǎn)建立了重要的基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：翟富民,范豪,祁高富,曹逸,黃瀟,溫佳紅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：恒敬合創(chuàng)生物醫(yī)藥（浙江）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/18