本發(fā)明屬于基因治療和car-t細(xì)胞治療藥物開發(fā)，特別涉及一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、嵌合抗原受體t(chimeric?antigen?receptor?t，car-t)細(xì)胞療法因在血液腫瘤中的突出療效已成為腫瘤細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域中新的研發(fā)熱點(diǎn)。car-t細(xì)胞療法是指體外通過基因工程技術(shù)，將特異性抗原嵌合受體car的編碼基因轉(zhuǎn)入t細(xì)胞，通過t細(xì)胞表達(dá)的car靶向識別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，激活t細(xì)胞殺傷。慢病毒是目前將car編碼基因轉(zhuǎn)入t細(xì)胞過程中應(yīng)用最普遍的表達(dá)載體之一，其具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、目的基因表達(dá)穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長等特點(diǎn)。慢病毒整合到宿主細(xì)胞的染色體上可以長期穩(wěn)定表達(dá)，并且與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如腺病毒)相比，慢病毒不但能感染分裂期細(xì)胞，而且還能感染非分裂期的細(xì)胞，基于以上優(yōu)點(diǎn)，慢病毒載體作為外源基因轉(zhuǎn)移載體已廣泛用于臨床基因治療。但是慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)可能存在一定的潛在風(fēng)險(xiǎn)：慢病毒在細(xì)胞基因組的整合可能引起原癌基因的激活、抑癌基因的失活、rna剪接、基因融合等，從而具有成瘤風(fēng)險(xiǎn)。我們需要對慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的安全性進(jìn)行評價(jià)，即對car-t細(xì)胞基因組中慢病毒載體整合位點(diǎn)進(jìn)行檢測，評價(jià)慢病毒載體在t細(xì)胞中不會(huì)產(chǎn)生熱點(diǎn)位置的整合而造成二次腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。

2、目前，已經(jīng)有多種方法被研究用于檢測慢病毒整合位點(diǎn)，最早人們利用反向pcr法，該方法的問題是靈敏度和特異性不夠。隨著非限制性線性擴(kuò)增介導(dǎo)的pcr(nonrestrictive?linear?amplification–mediatedpcr，nrlampcr)技術(shù)的出現(xiàn)，病毒插入位點(diǎn)的研究取得了重大進(jìn)展。目前，多數(shù)病毒插入位點(diǎn)分析(vis)方法基于此技術(shù)。在復(fù)雜樣品的檢測中，nrlam-pcr被廣泛應(yīng)用。然而，該方法需要考慮引物設(shè)計(jì)的難度并且容易引入偏差，因?yàn)檫@可能會(huì)對結(jié)果造成技術(shù)誤差的風(fēng)險(xiǎn)。

3、因此，鑒于上述方案于實(shí)際制作及實(shí)施使用上的缺失之處，而加以修正、改良，同時(shí)本著求好的精神及理念，并由專業(yè)的知識、經(jīng)驗(yàn)的輔助，以及在多方巧思、試驗(yàn)后，方創(chuàng)設(shè)出本發(fā)明，特再提供一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，用于解決上述的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提出一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的問題。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，包括如下步驟：

3、s1、提取dna；

4、s2、針對慢病毒載體5’ltr區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物ltri，進(jìn)行線性pcr；

5、s3、使用鏈霉素磁珠生物素化步驟s2的pcr產(chǎn)物；

6、s4、將步驟s3的產(chǎn)物與單鏈linker進(jìn)行連接；

7、s5、將步驟s4的產(chǎn)物作為模板，采用第一輪引物ltrii進(jìn)行第一輪pcr；

8、s6、將步驟s5的產(chǎn)物作為模板，采用第二輪引物ltriii進(jìn)行第二輪pcr；

9、s7、對步驟s6的pcr產(chǎn)物上機(jī)測序；

10、s8、對測序后的數(shù)據(jù)過濾并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得出慢病毒載體整合位點(diǎn)基本信息，判斷整合位點(diǎn)插入位置是否在基因安全港范圍。

11、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s2的特異性引物ltri，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

12、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s4的單鏈linker，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

13、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s5的第一輪引物ltrii，核苷酸序列如seq?idno.3所示；lci，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

14、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s6的第二輪引物ltriii，核苷酸序列如seq?idno.5所示；lcii，核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

15、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s8中的數(shù)據(jù)過濾手段如下：

16、a.截去測序reads中的測序引物及接頭序列；

17、b.截去reads兩端質(zhì)量值低于20的堿基；

18、c.去除n堿基比例大于10％的reads；

19、d.去除剪切后長度小于75bp的reads。

20、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述步驟s8中的生物信息學(xué)分析包括：

21、a.將過濾的數(shù)據(jù)與參考基因組比對，對比完成后通過bam文件進(jìn)行排序；

22、b.對整合位點(diǎn)進(jìn)行ref?gene數(shù)據(jù)庫的注釋，注釋內(nèi)容包括：斷點(diǎn)所在基因、基因功能區(qū)、對應(yīng)基因的功能描述；

23、c.對整合位點(diǎn)進(jìn)行分析，查看插入位點(diǎn)位置的基因在疾病或其它方面的功能性影響。

24、作為優(yōu)選的實(shí)施方式，所述判斷整合位點(diǎn)插入位置是否在基因安全港范圍包括：

25、a.距離任何基因的5’端≥50kb；

26、b.距離任何與癌癥相關(guān)基因≥300kb；

27、c.距離任何micro?rna≥300kb；

28、d.不位于轉(zhuǎn)錄元件區(qū)間；

29、e.不位于人類基因組的超保守區(qū)域：phylop?conservation?score≥2.0的區(qū)間

30、采用了上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的檢測方法可以對car-t細(xì)胞進(jìn)行檢測，在回輸至患者體內(nèi)之前，明確car-t細(xì)胞基因組內(nèi)插入位點(diǎn)，對本批次生產(chǎn)的car-t細(xì)胞產(chǎn)品進(jìn)行安全評估及分析。

31、本發(fā)明的檢測方法可以明確插入位點(diǎn)，快速識別整合位點(diǎn)的插入位置和基礎(chǔ)信息，判斷慢病毒載體介導(dǎo)的整合是否具有傾向，有無發(fā)生發(fā)生熱點(diǎn)整合，car-t細(xì)胞產(chǎn)品的安全性。

技術(shù)特征：

1.一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述步驟s2的特異性引物ltri，核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述步驟s4的單鏈linker，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述步驟s5的第一輪引物ltrii，核苷酸序列如seq?id?no.3所示；lci，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述步驟s6的第二輪引物ltriii，核苷酸序列如seq?id?no.5所示；lcii，核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述步驟s8中的數(shù)據(jù)過濾手段如下：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述步驟s8中的生物信息學(xué)分析包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種car-t慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，其特征在于，所述判斷整合位點(diǎn)插入位置是否在基因安全港范圍包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提出了一種CAR?T慢病毒整合位點(diǎn)的檢測方法及其應(yīng)用，包括如下步驟：(1)提取DNA；(2)針對慢病毒載體5’LTR區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物L(fēng)TRI，進(jìn)行線性PCR；(3)使用鏈霉素磁珠生物素化步驟S2的PCR產(chǎn)物；(4)將步驟S3的產(chǎn)物與單鏈linker進(jìn)行連接；(5)將步驟S4的產(chǎn)物作為模板，采用第一輪引物L(fēng)TRII進(jìn)行第一輪PCR；(6)將步驟S5的產(chǎn)物作為模板，采用第二輪引物L(fēng)TRIII進(jìn)行第二輪PCR；(7)對步驟S6的PCR產(chǎn)物上機(jī)測序；(8)對測序后的數(shù)據(jù)過濾并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得出慢病毒載體整合位點(diǎn)基本信息，判斷整合位點(diǎn)插入位置是否在基因安全港范圍，借此，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)為，本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)CAR?T細(xì)胞檢測，并進(jìn)行安全評估及分析，保障產(chǎn)品安全性。

技術(shù)研發(fā)人員：徐美君
受保護(hù)的技術(shù)使用者：武漢科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19