本發(fā)明屬于生物，尤其涉及工程菌構(gòu)建，具體涉及一種7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、頭孢菌素c(cpc)是由絲狀真菌頂頭孢霉(acremonium?chrysogenum)生成的一種β-內(nèi)酰胺類抗生素。頭孢菌素c可通過影響細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的合成組裝，從而干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成以發(fā)揮抗菌作用。由于其具有廣譜抗菌的能力及對人、畜相對安全的特性，頭孢類抗生素被廣泛地應(yīng)用于細(xì)菌性疾病的治療，成為臨床上最重要的抗感染藥物。

2、7-氨基頭孢烷酸(7-aca)作為半合成頭孢類抗生素的關(guān)鍵中間體，占全球40％以上頭孢類抗生素市場。由于cpc存在抗菌譜窄、容易被青霉素酶降解的弊端，為解決這一問題，可通過化學(xué)法或生物法對cpc脫?；M(jìn)而轉(zhuǎn)化7-aca。其中化學(xué)法不僅需要苛刻的反應(yīng)條件，而且面臨高污染和高能耗的問題，無法滿足生產(chǎn)高質(zhì)量7-aca的需要。而生物酶法裂解頭孢菌素c生產(chǎn)7-aca的工藝，具有工藝簡單、高效、低成本、安全、無污染及產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為是一種綠色生產(chǎn)工藝，已為國內(nèi)外多數(shù)公司所采用，在經(jīng)濟(jì)和保護(hù)環(huán)境上具有很大的競爭力。

3、酶法裂解生產(chǎn)7-aca包括兩步酶法和一步酶法；其中兩步酶法是cpc在d-氨基酸氧化酶的作用下，產(chǎn)生一個(gè)含有酮基的中間體(7-(5-oxoadipoamido)cephalosporanicacid)，這個(gè)中間體不穩(wěn)定，很容易被同時(shí)產(chǎn)生的h2o2氧化脫羧，轉(zhuǎn)變成戊二酰基-7-氨基頭孢烷酸(glutaryl-7-aminocephalosporanic?acid，gl-7-aca)，然后在gl-7-aca頭孢菌素c酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下脫去側(cè)鏈生成7-aca。一步酶法是指利用cpc?；D(zhuǎn)移酶(ca)裂解頭孢烯核與酰基側(cè)鏈之間的酰胺鍵,將cpc直接轉(zhuǎn)化為7-aca。因此，利用頭孢菌素c頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶直接?；痗pc獲得7-aca是更適合工業(yè)生產(chǎn)需求。

4、目前，7-aca的一步酶法生產(chǎn)工藝首先對頂頭孢霉發(fā)酵生成的cpc進(jìn)行提純，然后加入cpc?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行反應(yīng)獲得7-aca。但是，該過程不僅需要提純cpc，而且需要cpc酰基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá),提純和載體固定等步驟，十分繁瑣。

5、綜上所述，目前有多種方式生成7-aca，但缺乏環(huán)境友好，程序簡化的從頭合成7-aca的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種高生產(chǎn)性7-aca重組頂頭孢霉菌株的制備方法。

2、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種頂頭孢霉菌種內(nèi)蛋白質(zhì)高表達(dá)的啟動(dòng)子、一種編碼頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的氨基酸序列及將克隆在高表達(dá)載體中的cpc?；D(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化至cpc高生產(chǎn)性重組頂頭孢霉菌株。

3、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的方案如下：

4、本發(fā)明提供一種7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其在頂頭孢霉菌(acremonium?chrysogenum)中引入7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關(guān)基因，得到重組菌即為7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株；優(yōu)選地，其初始菌為頂頭孢霉cgmcc?3.3795或高生產(chǎn)性cpc重組頂頭孢霉。

5、具體地，所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關(guān)基因是頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因，所述頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶能水解cpc側(cè)鏈基。

6、優(yōu)選地，所述頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶為seq?id?no：1或ncbi號(hào)為aaa25690.1、caa48785.1、aac34685.2、wp_092168096.1、wp_217659596.1或其突變體。

7、更優(yōu)選地，所述突變體是在seq?id?no：1所奈序列的基礎(chǔ)上存在下述突變之一：g141q/l185k/a205e、h596k/a600e、w443i/l505a、w443i?l505t、d485i/h496k、a571k、n240q、d350k、v327i、t321g/v327i、t321g、a121h、m173q、i?166l、f381q、h453n、l505a、r437d或a565g。

8、具體地，在所述頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因引入頂頭孢霉菌中，以表達(dá)盒的表達(dá)載體的形式導(dǎo)入，包括啟動(dòng)子和終止子。

9、更具體地，所述啟動(dòng)子為頂頭孢霉菌的內(nèi)源性gpda啟動(dòng)子；優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子序列為seq?id?no：2或seq?id?no：3或seq?id?no：4或seq?id?no：5或seq?id?no：6或其突變體。

10、進(jìn)一步地，表達(dá)載體的載體骨架為質(zhì)粒puc57。

11、在具體實(shí)施方式中，通過基因編輯或同源重組的方式所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關(guān)基因。

12、本發(fā)明還提供所述的制備方法得到的7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株。

13、本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：發(fā)酵所述的7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株，得到7-氨基頭孢烷酸；任選地，還包括收集所述7-氨基頭孢烷酸的步驟。

14、通過本發(fā)明的制備方法所制備的重組頂頭孢霉菌株可實(shí)現(xiàn)7-aca的一步合成，且轉(zhuǎn)化效率具有非常高的特征。通過本發(fā)明制備的高生產(chǎn)性7-aca重組頂頭孢霉菌株的7-aca生產(chǎn)能力可以為1至4.3g/l，最為優(yōu)選的4.3g/l以上。7-aca的生產(chǎn)量由菌種活化培養(yǎng)條件，發(fā)酵培養(yǎng)基配方，發(fā)酵工藝等參數(shù)決定。

15、本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明合成的頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶導(dǎo)入頂頭孢霉菌中得到可以一步發(fā)酵合成7-氨基頭孢烷酸的重組菌。其中頭孢菌素c酰基轉(zhuǎn)移酶xy408構(gòu)建的重組菌wh07通過搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虍a(chǎn)生4.3g/l以上的7-氨基頭孢烷酸，實(shí)現(xiàn)工業(yè)發(fā)酵法合成7-氨基頭孢烷酸。

技術(shù)特征：

1.一種7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株的制備方法，其特征在于，在頂頭孢霉菌(acremoniumchrysogenum)中引入7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關(guān)基因，得到重組菌即為7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株；優(yōu)選地，其初始菌為頂頭孢霉cgmcc?3.3795或高生產(chǎn)性cpc重組頂頭孢霉。

2.根據(jù)權(quán)利要求?1?所述的制備方法，其特征在于：所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關(guān)基因是頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因，所述頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶能水解cpc側(cè)鏈基。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于：所述頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶為seq?idno：1?seq?id?no：1或ncbi號(hào)為aaa25690.1、caa48785.1、aac34685.2、wp_092168096.1、wp_217659596.1或其突變體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于：所述突變體是在seq?id?no：1所奈?序列的基礎(chǔ)上存在下述突變之一：g141q/l185k/a205e、h596k/a600e、w443i/l505a、w443i

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于：在所述頭孢菌素c?；D(zhuǎn)移酶的編碼基因引入頂頭孢霉菌中，以表達(dá)盒的表達(dá)載體的形式導(dǎo)入，包括啟動(dòng)子和終止子。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述啟動(dòng)子為頂頭孢霉菌的內(nèi)源性gpda啟動(dòng)子；優(yōu)選地，所述的啟動(dòng)子序列為seq?id?no：2或seq?id?no：3或seq?id?no：4或seq?id?no：5或seq?id?no：6或其突變體。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：表達(dá)載體的載體骨架為質(zhì)粒puc57。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：通過基因編輯或同源重組的方式所述7-氨基頭孢烷酸合成途徑相關(guān)基因。

9.如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的制備方法得到的7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株。

10.一種制備7-氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：發(fā)酵如權(quán)利要求7所述的7-氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌株，得到7-氨基頭孢烷酸；任選地，還包括收集所述7-氨基頭孢烷酸的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種7?氨基頭孢烷酸生產(chǎn)菌及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供一種制備7?氨基頭孢烷酸的方法，包括如下步驟：將不同來源啟動(dòng)子與多種頭孢菌素C頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行組合質(zhì)粒構(gòu)建，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將頭孢菌素C頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶基因整合至頂頭孢霉菌種基因組中得到重組菌，發(fā)酵重組菌，得到7?氨基頭孢烷酸產(chǎn)物。本發(fā)明以CPC高生產(chǎn)性頂頭孢霉菌種為出發(fā)菌種，利用基因工程、合成生物學(xué)等手段，在其中外源引入頭孢菌素C頭孢菌素C?；D(zhuǎn)移酶，可以實(shí)現(xiàn)由工程菌直接生產(chǎn)7?氨基頭孢烷酸。該方法步驟簡單，生產(chǎn)過程中無化工污染，具有巨大的工業(yè)化前景。

技術(shù)研發(fā)人員：孫周通,曲戈,吳昊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19