技術(shù)特征：

1.熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因編輯載體，其特征在于，所述基因編輯載體的sgrna作用位點(diǎn)的dna序列為5’-tta-nx-3’；其中tta為pam序列；n表示堿基a、t、g或c，x為大于等于27的整數(shù)，優(yōu)選x為27～40之間的整數(shù)；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編輯載體，其特征在于，所述基因編輯載體包含誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；

3.熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述基因編輯系統(tǒng)包括權(quán)利要求1或2所述的基因編輯載體和含有熱葡糖苷酶地芽孢桿菌cas1～cas8蛋白的表達(dá)體系或表達(dá)載體，其中，所述含有熱葡糖苷酶地芽孢桿菌cas1～cas8蛋白的表達(dá)體系位于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌的染色體上；任選包括供體載體；

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因編輯系統(tǒng)，其特征在于，所述基因編輯載體的構(gòu)建方法如下：

5.熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因沉默載體，其特征在于，所述基因沉默載體的sgrna作用位點(diǎn)的dna序列為5’-tta-nx-3’；其中tta為pam序列；n表示堿基a、t、g或c，x為11～26之間的整數(shù)；

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因沉默載體，其特征在于，所述基因沉默載體包含組成型啟動(dòng)子；

7.熱葡糖苷酶地芽孢桿菌crispr?type?i-b基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，所述基因沉默系統(tǒng)包括權(quán)利要求5或6所述的基因沉默載體和含有熱葡糖苷酶地芽孢桿菌cas1～cas8蛋白的表達(dá)載體；

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因沉默系統(tǒng)，其特征在于，所述基因沉默載體的構(gòu)建方法如下：

9.權(quán)利要求1或2所述基因編輯載體、權(quán)利要求3或4所述基因編輯系統(tǒng)，或者權(quán)利要求5或6所述基因沉默載體、權(quán)利要求7或8所述基因沉默系統(tǒng)在宿主基因編輯或基因沉默中的應(yīng)用；

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因編輯系統(tǒng)或基因沉默系統(tǒng)在37℃-70℃有活性。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了熱葡糖苷酶地芽孢桿菌CRISPR?type?I?B基因編輯及其應(yīng)用，通過建立內(nèi)源CRISPR?type?I?B系統(tǒng)的基因編輯方法，有效解決了基于反向篩選的同源重組基因編輯方法存在的編輯效率低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，以及異源CRISPR?Cas9系統(tǒng)面臨潛在蛋白毒性和PAM序列過長(zhǎng)的問題。該內(nèi)源系統(tǒng)的PAM序列為5’?TTA?3’，基因敲除、敲入效率均超過95％。本發(fā)明通過截短spacer長(zhǎng)度實(shí)現(xiàn)CRISPR?type?I?B系統(tǒng)由切割到轉(zhuǎn)錄抑制的功能切換，解決了熱葡糖苷酶地芽孢桿菌無基因調(diào)控工具的問題，且無需失活核酸酶Cas3。本發(fā)明將促進(jìn)對(duì)此菌株基因功能和遺傳特性的基礎(chǔ)研究和工業(yè)化研究。

技術(shù)研發(fā)人員：王為善,楊志恒,李子龍,卜瑞紅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院微生物研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19