本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及豬圓環(huán)病毒3型的檢測(cè)方法，具體涉及豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)及試劑盒。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒(porcinecircovirus，pcv)是已知的能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制的最小的病毒，屬于圓環(huán)病毒科(circoviridae)圓環(huán)病毒屬(circovirus)成員，它是一種無(wú)囊膜、單鏈環(huán)狀dna病毒，主要感染單核/巨噬細(xì)胞系細(xì)胞，其中豬肺泡巨噬細(xì)胞是其主要的靶細(xì)胞。根據(jù)pcv的抗原性、致病性及核苷酸序列的差異，將pcv劃分為pcv-1、pcv-2和pcv-3三種基因型，其中pcv-1無(wú)致病性，但廣泛存在于豬體和豬源細(xì)胞系；pcv-2具有致病性，可引起豬的多種疾病，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎與腎病綜合征和繁殖障礙等疾病，并在我國(guó)大部分地區(qū)呈暴發(fā)趨勢(shì)；pcv-3致病性還不明了，僅在流產(chǎn)胎兒、有肺炎的豬只中檢測(cè)出來(lái)。

目前，普遍應(yīng)用常規(guī)pcr檢測(cè)方法檢測(cè)pcv-3，但普通pcr檢測(cè)的靈敏度相對(duì)較低，且不能夠定量病毒含量等弊端，而臨床上豬只發(fā)病又與病毒含量成一定的正相關(guān)關(guān)系。因此，建立豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)及試劑盒十分必要。本發(fā)明根據(jù)豬圓環(huán)病毒3型的orf2基因設(shè)計(jì)引物，可用于建立高效、準(zhǔn)確、快速的分子生物學(xué)診斷技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種高敏感性、特異性和準(zhǔn)確性的豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)及試劑盒。

本發(fā)明的技術(shù)方案之一是，提供一種豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)，包括：seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述引物對(duì)的退火溫度是58℃。

本發(fā)明提供的引物對(duì)用于擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒3型的orf2基因部分片段，擴(kuò)增出的目的基因片段大小為131bp。

本發(fā)明的技術(shù)方案之二是，提供一種豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，其包括：seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物；和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物。

作為優(yōu)化的技術(shù)方案，所述seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物的濃度為10μmol/l；所述seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物的濃度為10μmol/l。

作為優(yōu)化的技術(shù)方案，本發(fā)明提供的試劑盒還包括sybrpremixextaq預(yù)混液、ddh2o、陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。

優(yōu)選地，所述的陰性質(zhì)控品為ddh2o；所述陽(yáng)性質(zhì)控品為豬圓環(huán)病毒3型的陽(yáng)性質(zhì)粒。

本發(fā)明的技術(shù)方案之三是，提供所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟：以待測(cè)樣品的dna為模板，在seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物存在下，經(jīng)過(guò)sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷豬圓環(huán)病毒3型的存在情況和含量。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物的濃度為10μmol/l；所述seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物的濃度為10μmol/l。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述pcr檢測(cè)的反應(yīng)體系為20μl，該反應(yīng)體系包括：

(1)10μmol/lseqidno:1所示核苷酸序列的正向引物1μl；和10μmol/lseqidno:2所示核苷酸序列的反向引物1μl；

(2)待測(cè)樣品的dna模板2μl；

(3)sybrpremixextaq預(yù)混液10μl；

(4)ddh2o6μl。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

(1)95℃預(yù)變性90s；

(2)94℃變性5s，58℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；

(3)95℃變性15s，58℃延伸1min；95℃變性30s，58℃延伸15s。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)及試劑盒，所述引物對(duì)包括seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物。所述引物對(duì)用于擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒3型的orf2基因部分片段，擴(kuò)增出的目的基因片段大小為131bp。本發(fā)明還提供豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及該試劑盒的使用方法。利用本發(fā)明所述的引物對(duì)對(duì)豬圓環(huán)病毒3型的檢測(cè)特異性好，不和豬相關(guān)病毒發(fā)生反應(yīng)，僅豬圓環(huán)病毒3型為陽(yáng)性，檢測(cè)的靈敏度高，為1.0×10¹拷貝/μl?？捎糜谪i圓環(huán)病毒3型的病原學(xué)調(diào)查。

附圖說(shuō)明

圖1為豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，1-6對(duì)應(yīng)不同濃度的樣品的pcr產(chǎn)物；樣品的濃度自左向右依次為：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³拷貝/μl；

圖2為豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3為豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線；

圖4為豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr敏感性試驗(yàn)結(jié)果；其中，1-9對(duì)應(yīng)不同濃度的樣品的pcr產(chǎn)物；樣品的濃度自左向右依次為：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷貝/μl；10為陰性對(duì)照；

圖5為豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr特異性試驗(yàn)結(jié)果；其中，1-10對(duì)應(yīng)不同病毒樣品的pcr產(chǎn)物，病毒樣品自左向右依次為pcv-3、pcv-1、pcv-2、prv、csfv、prrsv、pedv、pdcov、tgev和pastv。

具體實(shí)施方式

提供下述實(shí)施例是為了更好地進(jìn)一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實(shí)施方式，最佳實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成限制，任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其他現(xiàn)有技術(shù)的特征進(jìn)行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的方法和產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明所涉及的實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源如下，其他未說(shuō)明的材料均為普通市售品，均可通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)獲得：

1、菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

pcv-1(豬圓環(huán)病毒1型)、pcv-2(豬圓環(huán)病毒2型)、prv(豬偽狂犬病毒)、csfv(豬瘟病毒)、prrsv(豬繁殖與呼吸綜合征病毒)、pedv(豬流行性腹瀉病毒)、pdcov(豬丁型冠狀病毒)、tgev(豬傳染性胃腸炎病毒)、pastv(豬星狀病毒)均從江西各豬場(chǎng)臨床樣品中分離獲得并由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2、試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、氨芐青霉素均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；

病毒rna/dna提取試劑盒(離心柱型)、sybrpremixextaq預(yù)混液、dl2000dnamarker、pmd18-t載體均購(gòu)置takara(大連)公司；

質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；

膠回收試劑盒購(gòu)自omega公司。

3、設(shè)備

sorvallst16r高速冷凍離心機(jī)、legendmicro21r高速冷凍離心機(jī)和nanodrop2000均購(gòu)自美國(guó)thermo公司；

appliedbiosystems7500pcr儀購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；

瓊脂糖水平電泳槽購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；

凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海培清科技有限公司。

實(shí)施例1：豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法建立

1、引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)genbank中登陸的pcv-3(kx966193)pcv3-us/sd2016毒株的orf2保守區(qū)域，應(yīng)用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成，所得的引物對(duì)的序列如表1所示(其中，“f”代表正向引物，“r”代表反向引物)：

表1：引物信息

2、病毒dna提取

根據(jù)takara公司的minibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0病毒提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)提取病毒rna/dna，操作步驟如下：

(1)研磨器研磨病料后，離心取上清；

(2)取200μl離心后上清、200μlbuffervgb、20μl蛋白酶k和1μlcarrierrna混勻，于56℃水浴10min；

(3)裂解后的液體加入200μl無(wú)水乙醇混勻，轉(zhuǎn)移至spincolumns，離心后分步加入bufferrwa/rwb，離心。

(4)離心后加入30μl無(wú)rnaaseddh2o溶解dna/rna，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、pcr擴(kuò)增

將上一步提取的dna為模板進(jìn)行豬圓環(huán)病毒3型的orf2基因部分序列pcr擴(kuò)增，按下述的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增：

該豬圓環(huán)病毒3型orf2基因部分序列pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25μl，包括：

(1)10μmol/lseqidno:1所示核苷酸序列的正向引物1μl；和10μmol/lseqidno:2所示核苷酸序列的反向引物1μl；

(2)待測(cè)樣品的dna模板2.5μl；

(3)premixtaq預(yù)混液12.5μl；

(4)ddh2o8μl。

該pcr檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

(1)94℃預(yù)變性10min；

(2)94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，36個(gè)循環(huán)；

(3)72℃再延伸7min。

pcr產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳觀察電泳結(jié)果。擴(kuò)增pcr產(chǎn)物對(duì)應(yīng)條帶大小約為131bp，與豬圓環(huán)病毒3型orf2基因片段的長(zhǎng)度一致。

4、目的產(chǎn)物膠回收

根據(jù)omega公司的膠回收試劑盒的操作說(shuō)明對(duì)上一步pcr擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行膠回收純化。

5、目的基因克隆

將上一步純化好的目的基因與pmd18-t載體連接，16℃連接2h或4℃連接過(guò)夜，連接體系如下：

6、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化

將上一步得到的連接產(chǎn)物按照以下步驟進(jìn)行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：

(1)從-80℃冰箱中取出大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞，迅速置于冰上或者冰水混合物中解凍。

(2)取5μl連接產(chǎn)物和25μl解凍的大腸桿菌top10感受態(tài)細(xì)胞置于1.5ml離心管中輕輕攪拌混勻，冰浴30min。并提前開(kāi)好水浴鍋，將溫度調(diào)至42℃。

(3)42℃水浴熱應(yīng)激60s，并將離心管迅速轉(zhuǎn)移至碎冰中放置5min。

(4)加入900μl預(yù)熱的lb液體培養(yǎng)基，180rpm振蕩培養(yǎng)約90min。

(5)8000rpm常溫離心5min，棄800μl上清，重懸菌體取50μl和150μl菌液分別均勻涂布在加有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)10min后倒置培養(yǎng)12-16h。

7、菌落的挑取及pcr鑒定

挑取五個(gè)涂布的lb培養(yǎng)基中白色、濕潤(rùn)、光滑的單個(gè)菌落至1.5mlep管中，加300μllb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)4h，以該菌液為dna模板，按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行pcr檢測(cè)：

該pcr檢測(cè)的反應(yīng)體系為25μl，包括：

(1)10μmol/lseqidno:1所示核苷酸序列的正向引物1μl；和10μmol/lseqidno:2所示核苷酸序列的反向引物1μl；

(2)菌液2.5μl；

(3)premixtaq預(yù)混液12.5μl；

(4)ddh2o8μl。

該pcr檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

(1)94℃預(yù)變性10min；

(2)94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共36個(gè)循環(huán)；

(3)72℃總延伸7min。

所得pcr產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳觀察。挑取2個(gè)鑒定為陽(yáng)性克隆的菌落進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

8、pcv-3orf2基因的序列測(cè)定及分析

將上一步獲得的2個(gè)鑒定為陽(yáng)性克隆的菌落送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為m13，并進(jìn)行序列比對(duì)分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)blast比對(duì)分析，本發(fā)明所述的pcr方法擴(kuò)增的基因序列與pcv-3毒株的同源性在98％以上，說(shuō)明本發(fā)明提供的引物對(duì)擴(kuò)增的目的基因?yàn)閜cv-3型。

9、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將鑒定為陽(yáng)性重組菌的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒計(jì)算出拷貝數(shù)(拷貝數(shù)的計(jì)算公式為：copies/ml＝(6.02×10²³)×(g/ml)/(dnalength×660))，做10倍梯度稀釋?zhuān)?.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³為標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，每個(gè)梯度做三次重復(fù)(做三次重復(fù)的目的是保證結(jié)果準(zhǔn)確性)，豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，圖1中0.056598為熒光閾值，1-6對(duì)應(yīng)不同濃度的樣品的pcr產(chǎn)物；樣品的濃度自左向右依次為：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³拷貝/μl；對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行結(jié)果分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖2。

反應(yīng)結(jié)束后逐漸加溫，每加溫一度，讀一次熒光信號(hào)。以溫度為橫坐標(biāo),熒光信號(hào)的變化為縱坐標(biāo)，繪制豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr擴(kuò)增熔解曲線見(jiàn)圖3，tm值為84.5℃，熔解曲線為單峰，說(shuō)明擴(kuò)增的產(chǎn)物特異性好。

實(shí)施例2：豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr測(cè)定方法優(yōu)化

使用48℃，50℃，52℃，54℃的溫度梯度對(duì)反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，確認(rèn)以下的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序?yàn)樽罴褩l件：

最佳反應(yīng)程序：20μl的反應(yīng)體系，包括：

(1)10μmol/lseqidno:1所示核苷酸序列的正向引物1μl；和10μmol/lseqidno:2所示核苷酸序列的反向引物1μl；

(2)待測(cè)樣品dna模板2μl；

(3)sybrpremixextaq預(yù)混液10μl；

(4)ddh2o6μl。

最佳擴(kuò)增程序?yàn)椋?/p>

(1)95℃預(yù)變性90s；

(2)94℃變性5s，58℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；

(3)95℃變性15s，58℃延伸1min；95℃變性30s，58℃延伸15s。

實(shí)施例3：豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)的試劑盒制備

本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒3型核酸檢測(cè)試劑盒，包括：sybrpremixextaq預(yù)混液、ddh2o、seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物、seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物、陰性質(zhì)控品(ddh2o)、陽(yáng)性質(zhì)控品(制備的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒)。

本試劑盒制備過(guò)程中所用的試劑主要購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(takara)，其余購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司、北京化工廠。所述試劑盒的制備過(guò)程如下：

1、pcr反應(yīng)液制備

(1)引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)genbank已發(fā)表的pcv-3orf2基因序列，用mega6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)找出保守序列。根據(jù)豬圓環(huán)病毒3型保守序列用primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒3型pcr引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物包括：seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物。

(2)引物的溶解

取合成好的引物(seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物)干粉管，12,000rpm離心1min，按照引物溶解說(shuō)明書(shū)加入ddh2o將干粉溶解，使兩種引物濃度各為10μm，振蕩混勻離心，備用；

(3)pcr反應(yīng)液配制：

按下述比例配制pcr反應(yīng)液：seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物(10μmol/l)1μl，seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物(10μmol/l)1μl，sybrpremixextaq預(yù)混液10μl，ddh2o6μl。

2、陰性質(zhì)控品制備

陰性質(zhì)控品的作用是用來(lái)防止因污染而產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本發(fā)明采用ddh2o作為陰性質(zhì)控品，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控。

3、陽(yáng)性質(zhì)控品制備

陽(yáng)性質(zhì)控品的作用是監(jiān)控試劑是否失效及性能是否下降。本發(fā)明采用pcv-3型的陽(yáng)性重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性質(zhì)控品。按照本技術(shù)領(lǐng)域中常用的分子克隆技術(shù)，陽(yáng)性重組質(zhì)粒的構(gòu)建和提取方法如下：

首先利用seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2所示核苷酸序列的反向引物對(duì)提取的基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；然后采用omegagelextractionkit回收pcr產(chǎn)物作為目的片段；采用大連寶生物的pmd18-tcloningvector試劑盒，將上述目的片段插入pmd18-t載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過(guò)轉(zhuǎn)化及篩選，得到含插入有上述目的片段的重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌；該陽(yáng)性克隆菌經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用天根質(zhì)粒提取試劑盒提取培養(yǎng)菌液中的質(zhì)粒并用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

4、質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：

陰性質(zhì)控品：陰性；

陽(yáng)性質(zhì)控品：陽(yáng)性。

以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則，此次試驗(yàn)視為無(wú)效，全部試驗(yàn)應(yīng)重新進(jìn)行。

5、分析判斷：

sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)熒光強(qiáng)弱，有擴(kuò)增曲線的為陽(yáng)性，沒(méi)有擴(kuò)增曲線的為陰性。并且可以根據(jù)樣品的ct值和繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中的病毒核酸含量。

實(shí)施例4：豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)

利用本發(fā)明建立的豬圓環(huán)病毒3型pcr檢測(cè)方法分別以pcv-3、pcv-1、pcv-2、prv、csfv、prrsv、pedv、pdcov、tgev、pastv核酸為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中1-10對(duì)應(yīng)不同病毒樣品的pcr產(chǎn)物，病毒樣品自左向右依次為pcv-3、pcv-1、pcv-2、prv、csfv、prrsv、pedv、pdcov、tgev和pastv。

結(jié)果說(shuō)明：應(yīng)用本申請(qǐng)?zhí)峁┑呢i圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法對(duì)pcv-1、pcv-2、prv、csfv、prrsv、pedv、pdcov、tgev、pastv病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，只有pcv-3的pcr檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，表明該pcr檢測(cè)方法的特異性良好。

實(shí)施例5：豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)

將實(shí)施例1中獲得的陽(yáng)性重組菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，提取方法為：將200μlpcr鑒定為陽(yáng)性且測(cè)序結(jié)果正確的菌液接種于20ml加有氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8h后，12000rpm離心2min，棄上清；加入2mlpbs重懸，12000rpm離心2min，棄上清后參照質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)(北京天根)提取質(zhì)粒，提取后通過(guò)超微量分光光度計(jì)nanodrop2000測(cè)定提取的重組質(zhì)粒的濃度，再根據(jù)重組質(zhì)粒分子質(zhì)量和阿伏伽德羅常數(shù)將質(zhì)粒濃度換算成單位體積分子拷貝數(shù)，并將重組質(zhì)粒以1.0×10⁸拷貝/μl為原始濃度后進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e以1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷貝/μl為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增以檢驗(yàn)本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的靈敏度，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4，圖中，1-9對(duì)應(yīng)不同濃度樣品的pcr產(chǎn)物；樣品的濃度自左向右依次為：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹、1.0×10⁰拷貝/μl；10：陰性對(duì)照。

結(jié)果表明：本發(fā)明提供的豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法的最低檢測(cè)量為1.0×10¹拷貝/μl，表明所建立的pcr方法敏感性良好。

實(shí)施例6：豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法重復(fù)性試驗(yàn)

利用本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法，以不同濃度的pcv-3型陽(yáng)性質(zhì)粒dna為模板，進(jìn)行三次擴(kuò)增(間隔五天)，以確定檢測(cè)結(jié)果的重復(fù)性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2：豬圓環(huán)病毒3型熒光定量pcr重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果說(shuō)明：利用本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法以不同濃度的pcv-3型陽(yáng)性質(zhì)粒在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示其變異系數(shù)范圍均小于0.5％，表明本發(fā)明所述的方法重復(fù)性良好。

實(shí)施例7：豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品的檢測(cè)

利用本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒3型的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法對(duì)采自江西32個(gè)豬場(chǎng)256份樣品(肺、淋巴結(jié)、脾臟)進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的實(shí)用性。結(jié)果5份檢測(cè)樣品呈陽(yáng)性，檢出的陽(yáng)性率為1.95％。

結(jié)果表明：本發(fā)明所述的sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法在臨床實(shí)踐上具有可行性。

sequencelisting

<110>江西農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>豬圓環(huán)病毒3型sybrgreeni實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物對(duì)及試劑盒

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