本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種基于微流控芯片裝置的明膠納米微粒的連續(xù)制備方法。

背景技術(shù)：

納米材料在微電子，化學，能源，生命科學和醫(yī)藥領(lǐng)域已有廣泛的應(yīng)用。尤其是近年來，納米顆粒材料在生物醫(yī)學領(lǐng)域體現(xiàn)出越來越多的應(yīng)用價值，如用于醫(yī)療成像的納米顆粒，用于靶向藥物控釋的納米載體材料。目前可用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的納米材料包括納米乳液，有機納米顆粒，樹狀大分子聚合物，膠束，脂質(zhì)體和多聚物。這些納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得以應(yīng)用的優(yōu)勢在于，納米材料的高比表面積使其具有高溶解性和高級滲透性，這對于許多非水溶性或弱水溶性藥物具有重要意義，可增加藥物分子的釋放；同時如何實現(xiàn)納米藥物的長時間釋放和靶向性釋放一直以來是納米生物醫(yī)藥材料領(lǐng)域的重要研究方向。盡管納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值，但如何實現(xiàn)有機或復(fù)合納米材料的產(chǎn)業(yè)化規(guī)模制備仍然是限制納米生物材料應(yīng)用的瓶頸之一。

微流控技術(shù)是一種用于微加工技術(shù)領(lǐng)域的新興技術(shù)，該技術(shù)通過設(shè)計構(gòu)建幾十到幾百微米的通道，操縱微小體積的流體(特征體積在10^-9至10^-18l間。該技術(shù)的關(guān)鍵是將傳統(tǒng)實驗室中在實驗臺上的合成等試驗技術(shù)微縮至一個幾厘米的微流控芯片中進行，這種系統(tǒng)的主要特征是流體環(huán)境的小型化，其中微流通道約100μm(約人類頭發(fā)的直徑)，而化學試劑則通過各種注射泵送入芯片中進行合成、分離或分析等反應(yīng)。近年來，微流控技術(shù)在生物藥物研究中已經(jīng)成為重要的工具之一。例如，上述微流控技術(shù)已被用于支持復(fù)雜的化學反應(yīng)過程或藥物篩選等工藝中，用于研究細胞-藥物的相互作用，用于產(chǎn)生微米級尺寸的顆粒或液滴并用于藥物控釋或細胞包埋等應(yīng)用。盡管微流控技術(shù)在微觀尺度材料合成加工方面已經(jīng)表現(xiàn)出其巨大的潛力，但如何將這一技術(shù)應(yīng)用到納米材料合成制備領(lǐng)域的相關(guān)研究和報道仍屈指可數(shù)。

蛋白質(zhì)(如白蛋白、明膠、膠原)納米顆粒在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價值，因其無毒性、穩(wěn)定性強、無抗原性、可規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點，因此可作為藥物控釋載體。明膠是膠原的衍生物，是由大量氨基酸組成的高分子材料，它具有良好的生物相容性、生物可降解性、無毒性、無免疫原性、可進行化學改性等特點，因此是被美國食品藥品監(jiān)察局批準的可植入生物材料的一種。明膠材料已經(jīng)在組織工程和藥物緩釋方面有了大量的應(yīng)用。近期研究表明以明膠納米顆粒為載體用于生物活性因子的釋放方面有著顯著效果。然而明膠納米顆粒的加工一直是限制其推廣應(yīng)用的難題。

發(fā)明us2008/0003292公開了使用常規(guī)反應(yīng)容器制備明膠納米顆粒的工藝，該納米顆粒最大粒徑為350nm，可作為藥物的載體系統(tǒng)，該方法是通過向明膠水溶液中逐滴滴加丙酮來制備明膠微粒。該方法基于傳統(tǒng)的實驗室制備方法需要分批次制備，制備過程中由于納米顆粒對制備參數(shù)影響非常敏感，導致不同制備批次間得到的納米顆粒產(chǎn)物參數(shù)難以保持穩(wěn)定。

發(fā)明cn103841965a公開了在包含混合單元的工藝管道的反應(yīng)器中制備明膠納米微粒的連續(xù)工藝。首先，該發(fā)明使用的是毫米尺度的流體管道的反應(yīng)器，由于在毫米尺度的管道中物質(zhì)交換速率有限，為將明膠水溶液與不良溶劑的極性有機溶劑快速混合，該專利需要設(shè)計特殊幾何形狀的通道結(jié)構(gòu)實現(xiàn)兩相流體的物理共混。另外，該方法是通過流體通道將兩相流體合并形成平行流動的層流，然后在通過物理共混使兩相共混，反應(yīng)時時間長，兩相溶液在芯片上形成明膠顆粒的反應(yīng)時間以秒為單位。尤其是微流通道的結(jié)構(gòu)設(shè)計和制備復(fù)雜，使這類反應(yīng)芯片的制備成本提高。還有，該方法是在ph為酸性的條件下(ph2-4)制備，酸性的環(huán)境對某些特殊藥物的加載或特定的應(yīng)用有所限制。

由于納米顆粒成核和生長過程中，溫度、良溶劑/不良溶劑混合比、攪拌速率等參數(shù)都會對納米顆粒的形成發(fā)生影響，傳統(tǒng)的使用攪拌共混方式的制備方式往往造成納米顆粒產(chǎn)物批次間差異顯著，難以保證不同批次間納米顆粒產(chǎn)品的性能參數(shù)(如尺寸和尺寸分布)穩(wěn)定。

為實現(xiàn)生物大分子在明膠顆粒中的加載，現(xiàn)有方法主要采用制備明膠顆粒后將藥物分子吸附在顆粒表面，或?qū)⑺幬锓肿油ㄟ^化學法接枝在明膠顆粒上。前者由于大分子無法進入明膠顆粒內(nèi)部，通常會造成藥物的快速釋放；后者需要額外的化學反應(yīng)，效率低。如果可以實現(xiàn)一步法制備載有大分子藥物將會大大提高制備的效率，也會提高大分子的釋放周期。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種基于微流控芯片裝置的明膠納米微粒的連續(xù)制備方法。本發(fā)明設(shè)計了能夠使明膠水溶液和極性有機溶劑形成同心軸流體的、微米尺度的微流控芯片為合成明膠納米微粒的反應(yīng)器，利用流體在微米尺度通道內(nèi)的物質(zhì)交換速率快，可大大加速顆粒的成核生長并形成納米顆粒的時間，提高反應(yīng)效率。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種基于微流控芯片裝置制備明膠納米微粒的連續(xù)制備方法，包括如下步驟：

(1)將明膠溶解在去離子水中得到明膠水溶液作為內(nèi)相，極性有機溶劑作為外相，以交聯(lián)劑溶液作為附加相；

(2)以第一流速將內(nèi)相，以第二流速將外相分別注入到微流控芯片裝置的內(nèi)相流體微通道和外相流體微通道中，所述內(nèi)相和外相匯合后在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體，通過兩相間的快速物質(zhì)擴散，促使明膠分子快速成核生長，并逐漸生長形成明膠納米顆粒；內(nèi)相和外相從匯合到明膠納米顆粒的形成所需時間在0.01-10秒；

(3)以第三流速將附加相注入至位于微流控芯片裝置下游的附加相流體微通道，交聯(lián)劑溶液與步驟(2)形成的含明膠納米顆粒的內(nèi)相和外相的混合溶液混合，使明膠微粒交聯(lián)，形成明膠納米顆粒懸浮液，從輸出通道出口導出芯片，收集在容器中；

(4)將收集的明膠納米顆粒懸浮液進行反復(fù)離心和在去離子水中重懸，最終得到明膠納米微粒；

其中，內(nèi)相和外相匯合至與交聯(lián)劑溶液混合所需時間在<10秒。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，在步驟(1)中所述的明膠水溶液中明膠的濃度為0.1～12w/v％，優(yōu)選為1～5％，更優(yōu)選為2.5～3％。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，在所述微流控芯片裝置內(nèi)各流體的溫度保持在30～60℃。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的明膠水溶液的ph為1～5，優(yōu)選為2～4或9～12，優(yōu)選為10～11。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的極性有機溶劑是對于明膠難溶或微溶的極性有機溶劑，優(yōu)選為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃中的一種或幾種的組合。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的第一流速、第二流速和第三流速分別為0.05-10mlhr^-1、0.1-50mlhr^-1和0.05-500μlhr^-1。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，第二流速與第一流速比為1.0～9.0，優(yōu)選2.0～3.5；第三流速與第一流速比為0.0067～0.067，優(yōu)選0.0067～0.013。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的交聯(lián)劑為戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亞胺、二鹵代烷、異氰酸酯、二異氰酸酯、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶、京尼平中的一種或幾種。

進一步地，在上述技術(shù)方案中，所述的交聯(lián)劑與明膠氨基的摩爾比例為0.25-10.0，優(yōu)選0.5-1.0。

本發(fā)明還提供用于制備明膠納米微粒的微流控芯片裝置，該裝置包括內(nèi)相流體微通道、至少一個外相流體微通道、附加相流體微通道和輸出通道，所述內(nèi)相流體微通道的內(nèi)徑小于外相流體微通道的內(nèi)徑；所述內(nèi)相流體微通道，用于流入內(nèi)相，所述外相流體微通道，用于流入外相，所述內(nèi)相和外相分別流經(jīng)內(nèi)相流體微通道和外相流體微通道匯合后直接流入輸出通道，并在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體；所述附加相流體微通道與輸出通道相交相連，附加相流經(jīng)附加相流體微通道流入輸出通道并與輸出通道內(nèi)的同心軸流體匯合。優(yōu)選地，所述內(nèi)相流體微通道、外相流體微通道、附加相流體微通道和輸出通道位于同一水平面上。

在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的微流控芯片裝置包括內(nèi)相流體微通道、一個外相流體微通道、附加相流體微通道和輸出通道，所述的內(nèi)相流體微通道的一端非密封地插入于外相流體微通道的一端，輸出通道的一端密封地插入于外相流體微通道的另一端，與插入于外相流體微通道內(nèi)的內(nèi)相流體微通道的端口非端到端連接，所述附加相流入通道與未插入于外相流體微通道的輸出通道相交相連通。其中，優(yōu)選地，在外相流體微通道內(nèi)，所述的內(nèi)相流體微通道的端口與輸出通道端口的距離為50～500μm。優(yōu)選地，所述的插入于外相流體微通道內(nèi)的內(nèi)相流體微通道端口和輸出通道的端口為錐形。所述微流控芯片裝置可以為使用毛細管制作的微流芯片。優(yōu)選地，所述各通道在同一水平面上。

再一優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述的微流控芯片裝置包括內(nèi)相流體微通道、兩個外相流體微通道、附加相流體微通道和輸出通道，所述兩個外相流體微通道分別與輸出通道相交連接，形成y形通道，相交連接處的中心位置上相交連接有內(nèi)相流體微通道，內(nèi)相流體微通道的中心線和輸出通道的中心線相重合，兩個外相流體微通道完全對稱地位置在內(nèi)相流體微通道的兩側(cè)，外相流體微通道與內(nèi)相流體微通道之間的夾角為30～90°，夾角優(yōu)選45-60°，更優(yōu)選60°。夾角對于在y形通道的相交連接處，內(nèi)相和外相匯合后在輸出通道內(nèi)能否形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體，有非常重要的調(diào)整作用，若夾角過于小或過于大，都不能很好地形成同心軸流體。所述微流控芯片裝置可以為軟刻蝕擠注制備的聚合物芯片。優(yōu)選地，所述各通道在同一水平面上。優(yōu)選地，在內(nèi)相流體微通道和外相流體微通道與輸出通道相交連接形成的y形通道中，所述相交連接處的橫截面積為3×10^-4～8×10^-1mm²，優(yōu)選3×10^-4～1.2×10^-1mm²，更優(yōu)選2×10^-3～3×10^-2mm²。

在上述技術(shù)方案中，所述的內(nèi)相流體微通道的內(nèi)徑為10～500μm，優(yōu)選10～200μm，更優(yōu)選25～100μm；所述的外相流體微通道的內(nèi)徑為20～1000μm，優(yōu)選10～500μm，更優(yōu)選50～100μm。

本發(fā)明利用流體聚焦的微流通道設(shè)計，使明膠水溶液(內(nèi)相)和極性有機溶劑(外相)形成同心軸流體，從而顯著增加兩相流體的接觸面積、加快兩相間物質(zhì)的擴散，從而提高納米顆粒形成的速率。在本發(fā)明中，微流控芯片的設(shè)計以及內(nèi)相、外相的流速是在明膠的連續(xù)制備中能否形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體的重要影響因素。

值得一提的是，微米尺度的流體通道不是簡單的將毫米級的流體通道縮小。從宏觀尺度到微觀尺度上，許多物理特性，包括比表面積、基于擴散的物質(zhì)交換等，并不是隨著尺寸縮小而線性的遞減。相反，在微流控芯片中，流體在粘性力的作用下遵循著層流的規(guī)律；即在微米尺寸通道內(nèi)不同流體間平行流動而沒有湍流，且垂直于流體的流動方向。因此，在微米級通道內(nèi)，物質(zhì)交換主要依靠被動的分子擴散，而非形成對流或湍流。

而物質(zhì)擴散是一個非線性過程，假設(shè)一種物質(zhì)在直徑為x的平方面積內(nèi)擴散所需要的時間t，我們可以通過一個簡單的一維擴散過程計算表達該物質(zhì)的擴散：x²＝2d×t。以明膠在水中的擴散系數(shù)為1×10^-1μm²/ms計算，明膠分子在10μm見方的微流通道內(nèi)的擴散時間約為500ms。因此，微通道為依靠兩相間擴散來合成明膠納米顆粒的制備方法提供了更高的反應(yīng)效率。

用于制備明膠納米顆粒的微流控芯片裝置，實現(xiàn)兩相流體的共混是利用兩相流體在微米尺度空間的高擴散速率從而促使納米顆粒的成核生長。同時，本發(fā)明裝置利用流體聚焦的微流通道設(shè)計使兩相流體形成同心軸，從而提高兩相間的接觸面積，增加兩相擴散效率。另外，本發(fā)明兩相流體匯合后不需要設(shè)計結(jié)構(gòu)復(fù)雜的輸出通道，而是采用水平微通道，降低芯片設(shè)計的復(fù)雜性、節(jié)約成本；同時利用兩相間的快速擴散促使納米顆粒成核長大，從兩相流體匯合到納米顆粒形成的反應(yīng)時間較已有報道顯著縮短，最低可在100毫秒內(nèi)反應(yīng)完成。

本發(fā)明還提供一種膠體凝膠，該膠體凝膠是采用上述本發(fā)明所述的方法制備得到的明膠納米微粒的凍干粉和水性溶液共混而得到。其中，所述明膠納米微粒與水性溶液共混形成的分散液中，復(fù)合材料納米顆粒的體積百分比為5％～150％。制備得到的膠體凝膠的彈性模量為10pa～100kpa，優(yōu)選10pa～50kpa。該膠體凝膠具有可注射、可修復(fù)的功能，剪切破壞后儲存(彈性)模量30min內(nèi)恢復(fù)值超過初始儲存(彈性)模量值的60％。該膠體凝膠還可以采用上述本發(fā)明所述的方法制備得到的明膠納米微粒的凍干粉和懸浮有細胞的水性溶液或溶解有生物活性分子的水性溶液直接共混而得到。其中，所述的細胞選自原代培養(yǎng)細胞、傳代培養(yǎng)細胞、細胞株培養(yǎng)細胞和雜合體中的一種；所述的生物活性分子為藥物、蛋白質(zhì)和信號因子中的一種。所述膠體凝膠可應(yīng)用于組織修復(fù)和治療的可植入填充材料的制備。

本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明的制備方法采用能夠明膠水溶液和極性有機溶劑形成同心軸流體的、微米尺度的微流控芯片，相對于傳統(tǒng)的宏觀制備方法，微流控芯片中流體的比表面積增加、物質(zhì)交換和熱量擴散更均勻更快速，因此有利于提高納米顆粒的產(chǎn)率、控制顆粒的尺寸分布并減少不必要的附加產(chǎn)物。傳統(tǒng)的宏觀攪拌的制備方法，需要滴加的方法將極性有機溶劑與明膠水溶液共混從而促使明膠成核生長為納米顆粒，其反應(yīng)時間以分鐘甚至小時計算，反應(yīng)時間長、生產(chǎn)效率低下；而使用微米尺度的微流控芯片制備納米顆粒，明膠顆粒的生成時間在0.01～10秒范圍內(nèi)，因此反應(yīng)效率更高。

2.傳統(tǒng)的宏觀實驗室制備方法在將明膠水溶液和明膠不良溶劑的極性有機溶劑共混時，需要進行物理的攪拌使兩相快速混合，然而由于宏觀尺度上物質(zhì)和熱量交換速率慢導致制備的明膠納米顆粒尺度分布寬；而本發(fā)明采用的微流芯片保證兩相流體在微觀尺度上快速、高效共混，且對參數(shù)控制更加精確，因此制備的明膠納米顆粒尺寸與相同制備參數(shù)通過傳統(tǒng)方法制備的納米顆粒尺寸更小、尺寸分布更窄。

3.傳統(tǒng)方法需要分批次制備，制備過程中由于納米顆粒對制備參數(shù)影響非常敏感，導致不同制備批次間得到的納米顆粒產(chǎn)物參數(shù)難以保持穩(wěn)定；而本發(fā)明中的微流控制備方法可實現(xiàn)連續(xù)加樣制備，反應(yīng)條件更加穩(wěn)定、更加可控，因此得到的產(chǎn)品參數(shù)更加穩(wěn)定可控。

4.可通過多個微流通道疊加的方法實現(xiàn)生產(chǎn)的放大，提高產(chǎn)量、產(chǎn)率，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為實施例1中所述的毛細管微流控芯片裝置微通道結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為實施例2中所述的軟刻蝕加工的微流控芯片裝置微通道結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3為根據(jù)實施例3制備的明膠納米顆粒的透射電鏡照片。

圖4為根據(jù)實施例3制備的明膠納米顆粒的掃描電鏡照片。

圖5為根據(jù)實施例3中所述的微流芯片方法和實施例4所述的傳統(tǒng)攪拌方法制備的明膠納米顆粒的顆粒尺寸分布。

圖6為根據(jù)實施例9所述方法制備載堿性磷酸酶(活性蛋白)明膠納米顆粒的示意圖。

圖7表示實施例9中所述方法制備的載堿性磷酸酶(活性蛋白)明膠納米顆粒在甘油磷酸鈣溶液中誘導礦化。

圖8為實施例10中所述方法制備的質(zhì)量分數(shù)為10wt％的gela+b膠體凝膠的自修復(fù)行為的流變學測試結(jié)果。

符號說明：1、內(nèi)相流體微通道，2、外相流體微通道，3、附加相流體微通道，4、輸出通道，5、排氣口，6、基臺，7、內(nèi)相流體送樣端，8、外相流體送樣端，9、輸出通道輸出端。

具體實施方式

下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。下述實施例中，如無特殊說明，所使用的實驗方法均為常規(guī)方法，所用材料、試劑等均可從生物或化學公司購買。

實施例1

如圖1所述，一種具有流體聚焦功能的毛細管微流控芯片裝置，包括內(nèi)相流體微通道、一個外相流體微通道、附加相流體微通道、輸出通道和收集容器，所述的內(nèi)相流體微通道的一端非密封地插入于外相流體微通道的一端，輸出通道的一端密封地插入于外相流體微通道的另一端，與插入于外相流體微通道內(nèi)的內(nèi)相流體微通道的端口非端到端連接，所述附加相流體微通道與未插入于外相流體微通道的輸出通道相交相連通，輸出通道的另一端與收集容器相連；該裝置可以固定于基臺，便于使用，所述各通道在同一水平面上，各微通道內(nèi)壁表面進行親水處理。

其中插入于外相流體微通道內(nèi)的內(nèi)相流體微通道的端口和插入于外相流體微通道中的輸出通道端口為錐形；所述的內(nèi)相流體微通道、外相流體微通道和附加相流體微通道分別與微蠕動泵或微注射器相連，以實現(xiàn)自動進樣；在所述外相流體微通道內(nèi)，所述的內(nèi)相流體微通道的端口與輸出通道的端口的距離為200μm。在輸出通道的未插入于外相流體通道內(nèi)的部分設(shè)置有排氣口，用于在流體首次注入芯片時將芯片中氣體排出。

該微流控芯片裝置中，外相流體微通道為內(nèi)經(jīng)均一(內(nèi)徑為1.05μm)的方形ait玻璃毛細管。內(nèi)相流體微通道為內(nèi)徑均一(內(nèi)徑為560μm)的圓柱形ait玻璃毛細管，插入于外相流體通道中的端口為錐形端口，端口內(nèi)徑為30μm。輸出通道為內(nèi)徑均一(內(nèi)徑為560μm)的圓柱形ait玻璃毛細管，插入于外相流體微通道中的端口為錐形端口，端口內(nèi)徑為60μm。

圖1b為圖1a中a-a'線上的剖視圖。

實施例2

可以采用軟刻蝕加工本發(fā)明的微流控芯片裝置，如圖2所示。包括內(nèi)相流體微通道、外相流體微通道、附加相流體微通道、輸出通道和收集容器，內(nèi)相流體、外相流體、以及附加相流體分別通過相應(yīng)的送樣端輸入到相應(yīng)的微通道中，a、b、c分別表示微通道內(nèi)的不同區(qū)域。圖2b表示a、b、c三個不同區(qū)域中明膠顆粒形成的過程。在a區(qū)域的流體作為內(nèi)相的明膠水溶液，與外相(有機溶劑)匯合后在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體，兩相微流體間在微米級通道內(nèi)物質(zhì)擴散更快，促使本來溶解于水中的明膠分子快速過飽和并成核，并逐漸生長形成明膠納米顆粒(b區(qū)域)，進一步明膠納米顆粒溶液與其下游的交聯(lián)劑混合，交聯(lián)反應(yīng)，逐漸形成明膠納米顆粒微球懸浮液，從輸出通道出口導出芯片，收集在容器中。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案，上述軟刻蝕加工的本發(fā)明的微流控芯片裝置，可以具有兩個外相流體微通道、所述兩個外相流體微通道分別與輸出通道相交連接，形成y形通道，相交連接處的中心位置上相交連接有內(nèi)相流體微通道，內(nèi)相流體微通道的中心線和輸出通道的中心線相重合，兩個外相流體微通道完全對稱地位置在內(nèi)相流體微通道的兩側(cè)，外相流體微通道與內(nèi)相流體外通道的夾角為60°。內(nèi)相和外相各自流經(jīng)相應(yīng)的微通道，在y形通道相交連接處匯合，流入輸出通道，在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體，通過兩相間的快速物質(zhì)擴散，促使明膠分子快速成核生長，并逐漸生長形成明膠納米顆粒。圖2c為具有兩個對稱的外相流體通道的本發(fā)明的微流控芯片裝置中，內(nèi)外兩相流體回合處的微通道三維立體結(jié)構(gòu)圖。圖2d為內(nèi)外相流體在輸出通道交匯處的微通道橫截面的結(jié)構(gòu)。

在上述的微流控芯片裝置中，所述的內(nèi)相流體微通道、外相流體微通道和附加相流體微通道分別與微蠕動泵或微注射器相連，以實現(xiàn)自動進樣。

上述微流控芯片裝置采用軟刻蝕擠注制備得到，各通道在同一水平面上，各微通道內(nèi)壁表面進行親水處理。

該微流控芯片裝置中，所述的內(nèi)相流體微通道是內(nèi)徑為50μm的均一的管道結(jié)構(gòu)，外相流體微通道是內(nèi)徑為100μm的均一的管道結(jié)構(gòu)，交聯(lián)劑微通道是內(nèi)徑為50μm的均一的管道結(jié)構(gòu)，輸出通道是內(nèi)徑為200μm的均一的管道結(jié)構(gòu)。

實施例3

利用圖1所示毛細管微流控芯片裝置，連續(xù)制備明膠納米微球，具體步驟包括：

(1)明膠水溶液的制備：將明膠與去離子水在40℃共混，配置明膠濃度為5w/v％的明膠水溶液；持續(xù)攪拌待明膠完全溶解得到透明澄清溶液，將明膠水溶液的ph值調(diào)為3，將明膠水溶液過濾后注入注射器中，并使用加熱套加熱其中的明膠水溶液，溫度保持40℃；

(2)以明膠水溶液作為內(nèi)相以3ml/h的流速注入至內(nèi)相流體微通道中，以純丙酮作為外相以9ml/h的流速注入至外相流體微通道中；使用加熱套對微流芯片持續(xù)加熱40℃，溫度保持穩(wěn)定，所述內(nèi)相和外相匯合后在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體，兩相微流體間在微米級通道內(nèi)物質(zhì)擴散更快，促使本來溶解于水中的明膠分子快速過飽和并成核，并逐漸生長形成納米顆粒；根據(jù)流速不同控制，納米顆粒在該微流芯片中形成的時間為0.1～0.5秒；

(3)以19.8μl/h流速將交聯(lián)劑溶液(濃度為25wt％的戊二醛水溶液)注入至附加相流體微通道內(nèi)，進而交聯(lián)劑溶液流入輸出通道內(nèi)并與含明膠顆粒的內(nèi)外相混合溶液混合，使明膠微粒交聯(lián)，形成明膠納米顆粒懸浮液，從輸出通道出口導出芯片，收集在收集容器中；

(4)將收集容器中的明膠納米顆粒懸浮液在室溫下持續(xù)以600rpm轉(zhuǎn)速攪拌過夜，將明膠納米顆粒分散液室溫下反復(fù)離心和充分散3次，得到明膠膠體顆粒分散液。

其中，由于微通道的尺寸，因此流體的reynold常數(shù)小，內(nèi)相和外相匯合后，內(nèi)相和外相在輸出通道內(nèi)形成穩(wěn)定的層流流體。

將制備的明膠納米顆粒分散在去離子水中，滴加在銅網(wǎng)上，并自然干燥得到產(chǎn)物進行透射電鏡檢測，考察產(chǎn)物的形貌和尺寸。結(jié)果如圖3所示，制備的明膠納米顆粒成球形，且粒徑在200-400nm區(qū)間分布。

將上述明膠納米顆粒在水中分散后冷凍干燥，得到明膠顆粒的粉末并進行掃描電鏡分析。結(jié)果如圖4所示，凍干后的明膠納米顆粒成球形，且尺寸分布窄，平均粒徑在200nm左右。

實施例4

傳統(tǒng)的物理攪拌的方法制備的明膠納米微球：將3.75克干燥的明膠溶解在40℃的75ml的去離子水中，持續(xù)攪拌30min得到無色澄清的明膠水溶液，使用鹽酸將明膠水溶液的ph值調(diào)為3，使用磁力攪拌器對明膠水溶液持續(xù)攪拌，轉(zhuǎn)速1200rpm、溫度保持40℃。使用注射泵加入225ml丙酮，最終得到明膠膠體微球的懸濁液。然后，加入495μl的戊二醛水溶液(25wt％)對明膠微球進行化學交聯(lián)，并在室溫下保持600rpm攪拌12h。離心清洗得到明膠膠體顆粒的分散液。

使用上述傳統(tǒng)方法和實施例3中的微流控芯片裝置制備法得到的明膠納米膠體微粒在去離子水中的分散液，通過激光粒度儀對水中的納米顆粒粒徑進行分析。結(jié)果如圖5所示，在制備參數(shù)(包括溫度、明膠水溶液/丙酮兩相混合體積比、交聯(lián)度)相同的情況下，傳統(tǒng)方法制備的明膠納米顆粒相比于微流芯片制備的顆粒平均粒徑更大、尺寸分布更寬。證實本發(fā)明的方法制備的明膠納米顆粒性能更優(yōu)。

實施例5

利用圖1所示毛細管微流控芯片裝置，連續(xù)制備明膠納米微球，具體步驟包括：

(1)明膠水溶液的制備：將明膠分別在37℃、50℃或60℃與去離子水共混，配置明膠濃度為5w/v％的明膠水溶液；將明膠水溶液的ph值調(diào)為3。再將明膠水溶液加入注射器中，并使用加熱套加熱其中的明膠溶液，溫度保持37℃、50℃或60℃；

(2)以明膠水溶液作為內(nèi)相以3ml/h的流速注入至內(nèi)相流體微通道中，以純丙酮作為外相以9ml/h的流速注入至外相流體微通道中；使用加熱套分別對微流芯片持續(xù)加熱37℃、50℃或60℃，溫度保持穩(wěn)定，所述內(nèi)相和外相匯合后在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體；

(3)將交聯(lián)劑溶液以19.8μl/h流速分別流入不同溫度的微流芯片的附加相流體微通道中，交聯(lián)明膠微粒得到明膠納米顆粒懸浮液，導出并收集在收集容器中，經(jīng)攪拌交聯(lián)反應(yīng)、離心和重分散處理后最終得到在3種不同溫度下制備的明膠納米顆粒分散液。

上述明膠納米顆粒分散液的制備方法，除了制備溫度不同外，其他條件和步驟均與實施例3相同。

通過激光粒度儀對不同溫度下制備的分散液中的明膠納米顆粒粒徑進行分析，結(jié)果如表1所示，明膠的顆粒尺寸隨著制備溫度的增加而增加。

表1.在不同制備溫度條件下制備得到的明膠納米顆粒的粒徑分布

實施例6

利用圖2所示的軟刻蝕技術(shù)制備的微流控芯片裝置，連續(xù)制備明膠納米微球，具體步驟包括：

(1)明膠水溶液的制備：將明膠在40℃條件下與去離子水共混，配置明膠濃度為5w/v％的明膠水溶液；將明膠溶液ph調(diào)至11，再將明膠溶液加入注射器中，并使用加熱套加熱其中的明膠溶液，溫度保持40℃；

(2)以明膠水溶液作為內(nèi)相注入至內(nèi)相流體微通道中，以乙醇作為外相注入至外相流體微通道中，其中，明膠水溶液的輸入流速為3ml/h(第一流速)保持不變，乙醇的輸入流速(第二流速)根據(jù)第二/第一流速比不同而改變(如表2)，使用加熱套對微流芯片持續(xù)加熱40℃，溫度保持穩(wěn)定；

(3)將交聯(lián)劑溶液以19.8μl/h流速分別流入不同溫度的微流芯片的附加相流體微通道中，交聯(lián)明膠微粒得到明膠納米顆粒懸浮液，導出并收集在收集容器中，經(jīng)攪拌交聯(lián)反應(yīng)、離心和重分散處理后最終得到在不同內(nèi)相和外相的流速下制備的明膠納米顆粒分散液。

使用激光粒度儀對在不同條件下制備得到的明膠納米顆粒進行顆粒尺寸分析，結(jié)果如表2。

表2.內(nèi)外相流速對制備的明膠膠體顆粒的粒徑的影響

實施例7

利用圖2所示的軟刻蝕技術(shù)制備的微流控芯片裝置，連續(xù)制備明膠納米微球，具體步驟包括：

(1)明膠水溶液的制備：將明膠在40℃條件下與去離子水共混，配置明膠濃度為5w/v％的明膠水溶液；將明膠溶液ph調(diào)至11，再將明膠溶液加入注射器中，并使用加熱套加熱其中的明膠溶液，溫度保持40℃；

(2)以明膠水溶液作為內(nèi)相注入至內(nèi)相流體微通道中，以乙醇作為外相注入至外相流體微通道中，其中，使用加熱套對微流芯片持續(xù)加熱40℃，溫度保持穩(wěn)定；調(diào)整內(nèi)相明膠水溶液的輸入流速(第一流速)、外相乙醇的輸入流速(第二流速)和交聯(lián)劑溶液流速不同(如表3)，具體為：第二流速/第一流速比為3.0保持不變的條件下，改變內(nèi)相和外相的輸入流速；改變交聯(lián)劑溶液的流速，但其改變要滿足交聯(lián)劑溶液與第一流速比例保持為0.0066不變，如表3；

(3)將交聯(lián)劑戊二醛溶液以19.8μl/h流速分別流入不同溫度的微流芯片的附加相流體微通道中，交聯(lián)明膠微粒得到明膠納米顆粒懸浮液，改變交聯(lián)劑溶液的流速，但其改變要滿足交聯(lián)劑溶液與第一流速比例保持為0.0066不變，如表3；交聯(lián)后的明膠顆粒導出并收集在收集容器中，經(jīng)攪拌交聯(lián)反應(yīng)、離心和重分散處理后最終得到在流速參數(shù)條件下制備的明膠納米顆粒分散液。

使用激光粒度儀對在不同條件下制備得到的明膠納米顆粒進行顆粒尺寸分析，結(jié)果如表3所示。

表3.流速對生成明膠納米顆粒尺寸的影響

實施例8

利用圖1所示毛細管微流控芯片裝置，連續(xù)制備明膠納米微球，具體步驟包括：

(1)明膠水溶液的制備：將明膠在40℃條件下與去離子水共混，配置明膠濃度為5w/v％的明膠水溶液；將明膠溶液ph調(diào)至11，再將明膠溶液加入注射器中，并使用加熱套加熱其中的明膠溶液，溫度保持40℃；

(2)以明膠水溶液作為內(nèi)相注入至內(nèi)相流體微通道中，以乙醇作為外相注入至外相流體微通道中，其中，明膠水溶液的輸入流速為3ml/h(第一流速)保持不變，乙醇的輸入流速(第二流速)為9ml/h保持不變的條件下，使用加熱套對微流芯片持續(xù)加熱40℃，溫度保持穩(wěn)定；

(3)將交聯(lián)劑戊二醛溶液以不同流速(如表4)注入微流控芯片的附加相流體微通道中，交聯(lián)明膠微粒得到明膠納米顆粒懸浮液；交聯(lián)后的明膠顆粒導出并收集在收集容器中，經(jīng)攪拌交聯(lián)反應(yīng)、離心和重分散處理后最終得到在流速參數(shù)條件下制備的明膠納米顆粒分散液。

使用激光粒度儀對在不同條件下制備得到的明膠納米顆粒進行顆粒尺寸分析，結(jié)果如表4所示。

表4.交聯(lián)劑溶液流速對生成明膠納米顆粒尺寸的影響

實施例9

本實施例用堿性磷酸酶(alp)為模型藥物，采用圖2所示的軟刻蝕技術(shù)制備的微流控芯片裝置，制備包埋有大分子藥物的明膠納米顆粒，具體制備方法如下：

(1)將明膠和alp溶解在40℃去離子水中，明膠的最終濃度為5w/v％，alp的濃度為0.2w/v％；使用鹽酸將明膠水溶液的ph值調(diào)為3，加入注射器中，使用加熱套加熱其中的明膠溶液，溫度保持40℃；

(2)以步驟(1)得到的明膠水溶液作為內(nèi)相以3ml/h的流速注入至內(nèi)相流入微通道中，以純丙酮作為外相以9ml/h的流速注入至外相流入微通道中，使用加熱套對微流芯片持續(xù)加熱40℃，溫度保持穩(wěn)定，所述內(nèi)相和外相匯合后在輸出通道內(nèi)形成外相包圍內(nèi)相的同心軸流體，兩相微流體間在微米級通道內(nèi)物質(zhì)擴散更快，促使本來溶解于水中的明膠分子快速過飽和并成核，并逐漸生長形成納米顆粒；納米顆粒在微流芯片中形成的時間為0.1～0.5秒；

(3)以19.8μl/h流速將交聯(lián)劑溶液(濃度為25wt％的戊二醛水溶液)注入至交聯(lián)劑溶液流入微通道內(nèi)，交聯(lián)劑溶液流入輸出通道內(nèi)并與含明膠顆粒的內(nèi)外相混合溶液混合，使明膠微粒交聯(lián)，形成明膠納米顆粒懸浮液，從輸出通道出口導出芯片，收集在容器中；

(4)將收集在容器中的明膠納米顆粒懸浮液在室溫下持續(xù)以600rpm轉(zhuǎn)速攪拌過夜，加入相同體積的100mm鹽酸胍(或賴氨酸)的水溶液，從而將未反應(yīng)的醛基中和得到明膠納米顆粒；

(5)繼續(xù)攪拌1小時后，將明膠納米顆粒分散液過濾，并在去離子水中重懸，在室溫下反復(fù)離心和再分散5次，從而得到包埋有alp的明膠納米顆粒分散液。

為證實alp被成功的包埋在明膠納米微球中且仍保持其活性，將載alp明膠納米微球重懸在10mm的甘油磷酸鈣水溶液中，甘油磷酸鈣可擴散到明膠微球內(nèi)部，alp大分子將甘油磷酸鈣分解成磷酸根po4^3-和ca²⁺鈣離子，從而形成磷酸鈣晶體在明膠微球中生長，如圖7所示。圖7中可見明膠顆粒中明顯形成有片狀的磷酸鈣晶體，說明上述方法制備得到的載alp明膠納米顆粒中的alp保持其活性。

上述制備方法的示意圖如圖6所示。

實施例10

利用圖1所示毛細管微流控芯片裝置，連續(xù)制備明膠納米微球，具體步驟包括：

(1)將a型或b型明膠在40℃條件下與去離子水共混，配置明膠濃度為5w/v％的明膠水溶液；將明膠溶液ph調(diào)至3，再將明膠溶液加入注射器中，并使用加熱套加熱其中的明膠溶液，溫度保持40℃；

(2)以明膠水溶液作為內(nèi)相注入至內(nèi)相流體微通道中，以丙酮作為外相注入至外相流體微通道中，其中，明膠水溶液的輸入流速為3ml/h(第一流速)保持不變，丙酮的輸入流速(第二流速)為9ml/h保持不變的條件下，使用加熱套對微流芯片持續(xù)加熱40℃，溫度保持穩(wěn)定；

(3)將交聯(lián)劑戊二醛溶液以19.8μl/h流速注入微流芯片的附加相流體微通道中，交聯(lián)明膠微粒得到明膠納米顆粒懸浮液；交聯(lián)后的明膠顆粒導出并收集在收集容器中，經(jīng)攪拌交聯(lián)反應(yīng)、離心和重分散處理后分別得到a型或b型明膠納米顆粒分散液。使用激光粒度儀對上述方法制備得到的a型和b型明膠納米顆粒的顆粒尺寸和zeta電勢進行測試，結(jié)果如表5所示。

表5.不同類型明膠顆粒的性能參數(shù)

將上述明膠納米顆粒分散液經(jīng)冷凍干燥，分別得到a型明膠顆粒的凍干粉末(標記為gela)或b型明膠顆粒的凍干粉末(標記為gelb)。將上述gela或gelb明膠膠體顆粒的凍干粉末與適當量的1mm的nacl溶液共混，并快速攪拌混合均勻得到可注射型膠體凝膠。

將a型明膠和b型明膠微凝膠顆粒分別分散在20mm的naoh堿性水溶液中，分別得到分散有帶正電荷的a型明膠微凝膠顆粒和帶負電荷的b型明膠微凝膠顆粒的分散液，將兩者充分混合、攪拌，得分散有兩種不同微凝膠顆粒的分散液，其中a型明膠和b型明膠混合的顆粒數(shù)量比為1:1；向分散液中加入100mm的鹽酸調(diào)節(jié)ph值至7.0，攪拌混合，冷凍干燥，得到含有兩種不同明膠膠體顆粒的凍干粉末，標記為gela+b。將上述gela+b混合物凍干粉末與適當量的1mm的nacl溶液共混，并快速攪拌混合均勻得到可注射型自愈合膠體凝膠。制備所得不同組分的膠體凝膠，通過流變儀對所得不同組分的膠體凝膠的粘彈性能進行評價。結(jié)果如表6所示，膠體體積分數(shù)增加，凝膠的彈性模量增加；在體積分數(shù)相同時，帶相反電荷膠體顆粒組成的凝膠彈性模量顯著強于單一組分的膠體凝膠。在微凝膠膠體顆粒質(zhì)量分數(shù)為25vol％時，gela+b組分的膠體凝膠彈性模量>40kpa。

膠體凝膠的自修復(fù)行為是通過流變儀進行表征，具體測試方法如下。對膠體凝膠進行連續(xù)的流變測試：首先進行震蕩時間掃描，對樣品施加頻率為1hz和應(yīng)變?yōu)?.5％的外力，測試樣品的儲能模量(或彈性模量，g’)和損耗模量(或粘性模量，g”)，此時凝膠在低剪切力情況下表現(xiàn)出固體的剛性行為，因此儲能模量g’大于損耗模量g”且保持穩(wěn)定。這一階段的g’值即為樣品的初始彈性模量。隨后逐漸增加施加的應(yīng)變從0.1％至1000％，此過程中通過施加外力將樣品破壞，彈性模量g’逐漸降低，最終低于g”，即膠體體系從剛性固體向粘性流體發(fā)生轉(zhuǎn)變，結(jié)構(gòu)被破壞。隨后立即取消外力作用，考察樣品彈性模量的恢復(fù)情況。將外力釋放后，樣品恢復(fù)的儲能(彈性)模量與其初始儲能彈性模的百分比(％)定量考察凝膠的自修復(fù)效率。凝膠的自修復(fù)效率如表7所示，由帶相反電荷膠體顆粒組成的凝膠彈性模量顯著強于單一組分的膠體凝膠。其中，質(zhì)量分數(shù)為10wt％的gela+b膠體凝膠的自修復(fù)過程如圖8所示，凝膠在剪切破壞后其彈性模量瞬間恢復(fù)，5分鐘內(nèi)自修復(fù)彈性模量恢復(fù)到初始模量超過85％。并且這樣自修復(fù)行為可以反復(fù)發(fā)生：在對樣品施加多個循環(huán)的剪切破壞過程中，每次取消外力后，凝膠的彈性模量都會快速恢復(fù)，并恢復(fù)到初始彈性模量的80％以上。

表6.不同膠體凝膠材料的流變儲存(彈性)模量g'

*注：自修復(fù)效率是采用1000％的應(yīng)變持續(xù)你剪切凝膠材料60s后，檢測應(yīng)力釋放后5min內(nèi)的彈性模量恢復(fù)的百分比(％)。