本發(fā)明涉及一種天然高分子溶液及其制備方法，具體涉及一種再生柞蠶絲素蛋白溶液及其制備方法。

背景技術(shù)：

生物醫(yī)用材料是當(dāng)前生命科學(xué)和材料科學(xué)共同的前沿研究熱點(diǎn)之一。目前已經(jīng)開發(fā)應(yīng)用于組織工程等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的可降解高分子材料很多，但這些材料的原創(chuàng)性研究工作大多屬于國外并在我國申請了多項(xiàng)專利。因此積極尋找合適的原料，研制具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的生物材料，對(duì)于減小我國組織工程支架等生物材料對(duì)國外的依賴性，培育新的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)和實(shí)現(xiàn)國民經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。柞蠶絲（tussahsilk；antheraeapernyi）是以柞蠶繭為原料繅制而成的天然蠶絲纖維，是我國的寶貴資源。我國年產(chǎn)柞蠶繭3～4萬噸，占世界柞蠶繭總產(chǎn)量的90%以上，這是世界稀有我國特有的寶貴資源，但目前柞蠶絲主要用作普通的紡織原料，所體現(xiàn)出的經(jīng)濟(jì)價(jià)值十分有限。除作低價(jià)值紡織原料以外，將柞蠶絲用作生物醫(yī)學(xué)材料的需求越來越強(qiáng)烈，比如用作酶固定載體、細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)、傷口敷料、人工皮膚、組織工程支架等。

從六十年代至今，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)柞蠶絲素蛋白的氨基酸組成、分子結(jié)構(gòu)、物理性能等進(jìn)行了較多的研究。與家蠶絲相比，柞蠶絲具有更強(qiáng)的吸濕性、耐熱性、耐酸堿性，其氨基酸組成也有所不同：柞蠶絲素蛋白主要氨基酸含量順序?yàn)楸彼幔╝la）＞甘氨酸（gly）＞絲氨酸（ser）＞酪氨酸（tyr），且含有豐富的天冬氨酸（asp）和精氨酸（arg），因此含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)三肽序列。rgd序列作為細(xì)胞膜整合素受體與細(xì)胞外配體相結(jié)合的識(shí)別位點(diǎn)，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞之間的相互作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)支架的黏附。這些優(yōu)異的特性賦予柞蠶絲素蛋白在組織工程支架等生物材料領(lǐng)域得天獨(dú)厚的優(yōu)勢和廣泛的應(yīng)用前景。

天然柞蠶絲因?yàn)樾螒B(tài)單一（纖維狀）和結(jié)晶度較高難降解而限制了其應(yīng)用。已知有很多鹽溶液可以溶解天然桑蠶絲，如氯化鈣（cacl2）、氯化鎂(mgcl2)、溴化鋰(libr)等，從而可以輕易制得桑蠶絲素蛋白（b絲素蛋白）溶液。然而由于極強(qiáng)的分子間作用，柞蠶絲比桑蠶絲更難溶解，一般溶解桑蠶絲的體系很難溶解柞蠶絲。強(qiáng)酸和強(qiáng)堿都會(huì)使柞蠶絲素蛋白發(fā)生劇烈水解，分子量大大降低，如經(jīng)過鹽酸、磷酸和硫酸溶解后的分子量大約在200-5000d，所以通常只是用強(qiáng)酸和強(qiáng)堿來制取絲素肽和絲素粉，極大限制其應(yīng)用。

近年來出現(xiàn)的微波水解法制得的分子量在2000-3000d之間，該分子量的柞蠶絲素蛋白依然不能滿足醫(yī)用材料的要求，因此需要探索其他溶解方法來獲得較大分子量的柞蠶絲素蛋白，從而能夠滿足對(duì)柞蠶絲素蛋白溶液再次成型加工及成品物理機(jī)械性能的要求。目前可以獲得柞蠶絲素蛋白溶液的方法主要有兩種：第一種方法是直接從成熟柞蠶后部絲腺中提取液態(tài)柞蠶絲素蛋白，該方法操作步驟簡單，但僅適用于小量制備柞蠶絲素蛋白溶液及進(jìn)行相關(guān)研究，無法工業(yè)化；另外一種方法是用中性鹽溶解的方法獲得再生柞蠶絲素蛋白溶液，目前可以溶解柞蠶絲的中性鹽主要是硝酸鈣和硫氰酸鋰（liscn），雖然該方法可以提高柞蠶絲素蛋白溶液的獲取量，但溶解效率低、工藝復(fù)雜，更重要的是會(huì)嚴(yán)重破壞柞蠶絲原有的多級(jí)結(jié)構(gòu)，使得再生柞蠶絲素蛋白材料性能較差，難以滿足應(yīng)用要求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種再生柞蠶絲素蛋白溶液及其制備方法，由該方法得到的柞蠶絲素蛋白保留其本身的原有多級(jí)原纖結(jié)構(gòu)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種再生柞蠶絲素蛋白溶液的制備方法，包括如下步驟：

（1）對(duì)柞蠶絲進(jìn)行除雜、脫膠、超聲波處理，得到前處理柞蠶絲；

（2）將前處理柞蠶絲置于含甲酸的三氟乙酸水溶液中，制備混合液，常溫下攪拌溶解，得到再生柞蠶絲素蛋白有機(jī)溶液；

（3）將再生柞蠶絲素蛋白有機(jī)溶液置于去離子水中透析，得到再生柞蠶絲素蛋白溶液。

上述技術(shù)方案中，所述超生波處理的功率為1～10kw，時(shí)間為30～50分鐘；優(yōu)選的，所述超生波處理的功率為3～6kw，時(shí)間為35～40分鐘。

上述技術(shù)方案中，所述三氟乙酸水溶液的質(zhì)量濃度為80～90%；優(yōu)選的，所述三氟乙酸水溶液的質(zhì)量濃度為85～88%。

上述技術(shù)方案中，所述混合液中，甲酸的質(zhì)量為三氟乙酸的3～5%。

上述技術(shù)方案中，所述混合液中，前處理柞蠶絲的濃度（蠶絲溶解濃度）為5wt%～10wt%；優(yōu)選的蠶絲溶解濃度為7～8wt%。

上述技術(shù)方案中，所述攪拌溶解的時(shí)間為5～20分鐘。

上述技術(shù)方案中，所述透析的溫度為4～10℃，透析的時(shí)間為3～5天。

本發(fā)明還公開了一種再生柞蠶絲素蛋白材料及其制備方法，包括如下步驟：

（1）對(duì)柞蠶絲進(jìn)行除雜、脫膠、超聲波處理，得到前處理柞蠶絲；

（2）將前處理柞蠶絲置于含甲酸的三氟乙酸水溶液中，制備混合液，常溫下攪拌溶解，得到再生柞蠶絲素蛋白有機(jī)溶液；

（3）將再生柞蠶絲素蛋白有機(jī)溶液置于去離子水中透析，得到再生柞蠶絲素蛋白水溶液；

（4）將再生柞蠶絲素蛋白水溶液制備得到再生柞蠶絲素蛋白材料。

上述技術(shù)方案中，所述再生柞蠶絲素蛋白材料包括再生柞蠶絲素蛋白膜、再生柞蠶絲素蛋白凝膠。

本發(fā)明實(shí)質(zhì)上是采用三氟乙酸為溶劑，添加少量甲酸，在常溫下直接快速溶解柞蠶絲，然后經(jīng)透析去除有機(jī)溶劑，得到再生柞蠶絲素蛋白水溶液，以納米纖維為主要結(jié)構(gòu)；制備成再生絲素材料，具有良好的力學(xué)性能。

與已有技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

本發(fā)明公開的制備方法使用超聲波前處理工藝，疏松了蠶絲內(nèi)部的緊密結(jié)構(gòu)，有利于溶劑滲透加速了蠶絲的溶解，并且有利于調(diào)控溶劑對(duì)絲蛋白的溶解程度。

本發(fā)明公開的再生柞蠶絲素蛋白溶液及其制備方法，僅采用有機(jī)溶劑，避免高濃度中性鹽在高溫條件下對(duì)蠶絲的嚴(yán)重降解，并且通過有機(jī)溶劑的混合配比實(shí)現(xiàn)調(diào)控蠶絲蛋白溶解程度的目的。

本發(fā)明公開的再生柞蠶絲素蛋白溶液與以往柞蠶絲素蛋白溶液相比，顯著特征是以柞蠶絲素蛋白納米原纖為主要單元，該納米原纖為天然柞蠶絲本身具有，而非再生過程中通過自組裝形成，是天然柞蠶絲素蛋白納米原纖。

本發(fā)明公開的再生柞蠶絲素蛋白溶液首次僅以有機(jī)溶劑為溶解液，常溫?cái)嚢杓纯蓪?shí)現(xiàn)產(chǎn)品制備，該制備方法工藝簡單，得到的溶液無鹽、有機(jī)溶劑殘留，為純柞蠶絲素蛋白溶液。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例一制得溶液中絲素蛋白形態(tài)的掃描電鏡圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例一制得的再生絲素蛋白膜處理前后的紅外譜圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例二制得溶液中絲素蛋白形態(tài)的掃描電鏡圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例一

天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸60min，去離子水充分洗滌晾干后獲得脫膠蠶絲。將脫膠蠶絲置于燒杯中，加入去離子水，然后進(jìn)行超聲處理，超聲波功率5kw，超聲波處理時(shí)間40分鐘。室溫下，將脫膠蠶絲置于含有3%甲酸（三氟乙酸質(zhì)量為基數(shù)）的86wt%三氟乙酸水溶液中，蠶絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，磁力攪拌10min后獲得再生絲素蛋白三氟乙酸溶液。然后將溶液注入透析袋中，置于流動(dòng)去離子水中透析3d，透析溫度10℃，得到純化的再生柞蠶絲素蛋白納米纖維水溶液。該溶液中絲素蛋白為納米纖維狀，纖維長度為0.1-15μm，直徑0.01-1μm（如圖1所示），絲素蛋白分子量分布范圍150～300kda。再生絲素蛋白溶液注入聚乙烯皿中，自然干燥即得到再生柞蠶絲素蛋白膜，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為無定形結(jié)構(gòu)，經(jīng)乙醇水溶液處理后轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)（如圖2所示），該膜力學(xué)性能優(yōu)異，斷裂強(qiáng)度98mpa，斷裂伸長率6.5%；經(jīng)過凝膠化處理，可得到生物相容性良好的再生柞蠶絲素蛋白凝膠；濕態(tài)壓縮模量為96mpa；可應(yīng)用在制備組織工程支架中。

對(duì)比例一：

參見實(shí)施例一的工藝，其中不含甲酸，絲素蛋白分子量分布范圍50～70kda；再生柞蠶絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度46mpa，斷裂伸長率3.5%；再生柞蠶絲素蛋白凝膠的濕態(tài)壓縮模量為36mpa。

實(shí)施例二：

天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸60min，然后去離子水充分洗滌，重復(fù)三次晾干后獲得脫膠蠶絲。將脫膠蠶絲置于燒杯中，加入去離子水，然后進(jìn)行超聲處理，超聲波功率3kw，超聲波處理時(shí)間35分鐘。室溫下，將脫膠蠶絲置于含有5%甲酸（三氟乙酸質(zhì)量為基數(shù)）的85wt%三氟乙酸水溶液中，蠶絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，磁力攪拌5min后獲得再生絲素蛋白有機(jī)溶液。然后將溶液注入透析袋中，置于流動(dòng)去離子水中透析5d，透析溫度4℃，得到純化的再生柞蠶絲素蛋白納米纖維水溶液。該溶液中絲素蛋白為納米纖維狀，如圖3所示，絲素蛋白分子量分布范圍140～200kda；自然干燥即得到再生柞蠶絲素蛋白膜，斷裂強(qiáng)度95mpa，斷裂伸長率6.1%；經(jīng)過凝膠化處理，可得到生物相容性良好的再生柞蠶絲素蛋白凝膠；濕態(tài)壓縮模量為94mpa；可應(yīng)用在制備組織工程支架中。

對(duì)比例二：

參見實(shí)施例二的工藝，其中不含甲酸，絲素蛋白分子量分布范圍40～65kda；再生柞蠶絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度40mpa，斷裂伸長率3.2%；再生柞蠶絲素蛋白凝膠的濕態(tài)壓縮模量為38mpa。

實(shí)施例三：

天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸60min，然后去離子水充分洗滌，重復(fù)三次晾干后獲得脫膠蠶絲。將脫膠蠶絲置于燒杯中，加入去離子水，然后進(jìn)行超聲處理，超聲波功率6kw，超聲波處理時(shí)間35分鐘。室溫下，將脫膠蠶絲置于含有4%甲酸（三氟乙酸質(zhì)量為基數(shù)）的88wt%三氟乙酸水溶液中，蠶絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%，磁力攪拌20min后獲得再生絲素蛋白有機(jī)溶液。然后將溶液注入透析袋中，置于流動(dòng)去離子水中透析3d，透析溫度4℃，得到純化的再生柞蠶絲素蛋白納米纖維水溶液，絲素蛋白分子量分布范圍110～180kda；自然干燥即得到再生柞蠶絲素蛋白膜，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為無定形結(jié)構(gòu)，經(jīng)乙醇水溶液處理后轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，斷裂強(qiáng)度89mpa，斷裂伸長率6.1%；經(jīng)過凝膠化處理，可得到生物相容性良好的再生柞蠶絲素蛋白凝膠；濕態(tài)壓縮模量為95mpa；可應(yīng)用在制備組織工程支架中。

對(duì)比例三：

參見實(shí)施例三的工藝，其中不采用超聲波處理，絲素蛋白分子量分布范圍90～120kda；再生柞蠶絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度68mpa，斷裂伸長率5.5%；再生柞蠶絲素蛋白凝膠的濕態(tài)壓縮模量為82mpa。

實(shí)施例四：

天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸氫鈉溶液煮沸60min，然后去離子水充分洗滌，重復(fù)三次晾干后獲得脫膠蠶絲。將脫膠蠶絲置于燒杯中，加入去離子水，然后進(jìn)行超聲處理，超聲波功率1kw，超聲波處理時(shí)間50分鐘。室溫下，將脫膠蠶絲置于含有4%甲酸（三氟乙酸質(zhì)量為基數(shù)）的80wt%三氟乙酸水溶液中，蠶絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，磁力攪拌15min后獲得再生絲素蛋白有機(jī)溶液。然后將溶液注入透析袋中，置于流動(dòng)去離子水中透析5d，透析溫度10℃，得到純化的再生柞蠶絲素蛋白納米纖維水溶液，絲素蛋白分子量分布范圍160～320kda；自然干燥即得到再生柞蠶絲素蛋白膜，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為無定形結(jié)構(gòu)，經(jīng)乙醇水溶液處理后轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，斷裂強(qiáng)度78mpa，斷裂伸長率5.5%；經(jīng)過凝膠化處理，可得到生物相容性良好的再生柞蠶絲素蛋白凝膠；濕態(tài)壓縮模量為82mpa；可應(yīng)用在制備組織工程支架中。

對(duì)比例四：

參見實(shí)施例四的工藝，其中甲酸用量為8%，絲素蛋白分子量分布范圍8～10kda；再生柞蠶絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度40mpa，斷裂伸長率2.9%；再生柞蠶絲素蛋白凝膠的濕態(tài)壓縮模量為31mpa。

實(shí)施例五：

天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25wt%的碳酸鈉溶液煮沸60min，然后去離子水充分洗滌，重復(fù)兩次晾干后獲得脫膠蠶絲。將脫膠蠶絲置于燒杯中，加入去離子水，然后進(jìn)行超聲處理，超聲波功率10kw，超聲波處理時(shí)間30分鐘。室溫下，將脫膠蠶絲置于含有4%甲酸（三氟乙酸質(zhì)量為基數(shù)）的90wt%三氟乙酸水溶液中，蠶絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，磁力攪拌10min后獲得再生絲素蛋白有機(jī)溶液。然后將溶液注入透析袋中，置于流動(dòng)去離子水中透析3d，透析溫度4℃，得到純化再生柞蠶絲素蛋白納米纖維水溶液，絲素蛋白分子量分布范圍130～200kda；自然干燥即得到再生柞蠶絲素蛋白膜，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為無定形結(jié)構(gòu)，經(jīng)乙醇水溶液處理后轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，斷裂強(qiáng)度75mpa，斷裂伸長率5.6%；經(jīng)過凝膠化處理，可得到生物相容性良好的再生柞蠶絲素蛋白凝膠；濕態(tài)壓縮模量為83mpa；可應(yīng)用在制備組織工程支架中。

對(duì)比例五：

參見實(shí)施例五的工藝，其中超聲波功率20kw，絲素蛋白分子量分布范圍30～80kda；再生柞蠶絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度58mpa，斷裂伸長率4.5%；再生柞蠶絲素蛋白凝膠的濕態(tài)壓縮模量為49mpa。

實(shí)施例六：

天然柞蠶絲用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5wt%的碳酸鈉溶液煮沸60min，去離子水充分洗滌晾干后獲得脫膠蠶絲。將脫膠蠶絲置于燒杯中，加入去離子水，然后進(jìn)行超聲處理，超聲波功率6kw，超聲波處理時(shí)間50分鐘。室溫下，將脫膠蠶絲置于含有4%甲酸（三氟乙酸質(zhì)量為基數(shù)）的85wt%三氟乙酸水溶液中，蠶絲質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，磁力攪拌10min后獲得再生絲素蛋白有機(jī)溶液。然后將溶液注入透析袋中，置于流動(dòng)去離子水中透析3d，透析溫度4℃，得到純化的再生柞蠶絲素蛋白納米纖維水溶液，絲素蛋白分子量分布范圍160～300kda；自然干燥即得到再生柞蠶絲素蛋白膜，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為無定形結(jié)構(gòu)，經(jīng)乙醇水溶液處理后轉(zhuǎn)化為β-折疊結(jié)晶結(jié)構(gòu)，斷裂強(qiáng)度72mpa，斷裂伸長率5.5%；經(jīng)過凝膠化處理，可得到生物相容性良好的再生柞蠶絲素蛋白凝膠；濕態(tài)壓縮模量為81mpa；可應(yīng)用在制備組織工程支架中。

對(duì)比例六：

參見實(shí)施例六的工藝，其中采用90%的甲酸溶解，不采用三氟乙酸，絲素蛋白分子量分布范圍6～8kda；再生柞蠶絲素蛋白膜的斷裂強(qiáng)度28mpa，斷裂伸長率2.5%；再生柞蠶絲素蛋白凝膠的濕態(tài)壓縮模量為29mpa。