本發(fā)明屬微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株芽孢桿菌菌株及其應用。技術(shù)背景紫莖澤蘭(eupatoriumadenophorum)，菊科澤蘭屬，多年生草本或亞灌木，是一種世界性的惡性雜草，由于其能夠快速形成單優(yōu)群落，并且可以多種方式抑制其它植物生長，是我國現(xiàn)存危害最大的一種外來植物，由于其含有多種有毒組分及惡臭氣味組分，僅有澤蘭實蠅等極少數(shù)物種對其有采食現(xiàn)象。近年來人們對紫莖澤蘭的治理采取了投放專性天敵、除草劑、植物防控等手段但均收效甚微，因此很有必要針對紫莖澤蘭研發(fā)一種有效、成本低廉的生物防治措施。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種高效、低成本、使用方便的微生物藥劑控制紫莖澤蘭，具體是提供一株芽孢桿菌(bacillussp.)菌株及其在防治紫莖澤蘭中的應用。本專利申請人通過從紫莖澤蘭的寄生昆蟲澤蘭實蠅(procecidocharesutilisstone)唾液腺篩分出該菌株，能夠高效快速地對紫莖澤蘭發(fā)生生物侵染，可顯著抑制紫莖澤蘭的種子萌發(fā)，并且在適宜環(huán)境下造成紫莖澤蘭幼苗病變。本發(fā)明所提供的菌株為芽孢桿菌(bacillussp.)菌株，專利申請人對菌株的編號為zlsy5。該菌株已于2017年3月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc),地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。分類命名為：芽孢桿菌bacillussp.，保藏編號為13725(保藏中心登記入冊編號：cgmccno.13725)。本發(fā)明所提供的菌株的應用是以其為活性成分或活性成分之一制成菌劑防控紫莖澤蘭。專利申請人提供的上述zlsy5菌株，是芽孢桿菌屬中首次證實能夠高效侵染并造成紫莖澤蘭種子無法正常萌發(fā)，且會導致萌發(fā)中紫莖澤蘭種子根部病變的菌株，是在紫莖澤蘭防控領(lǐng)域有著良好應用前景的菌株。本發(fā)明通過從云南野外紫莖澤蘭上澤蘭實蠅的唾液腺內(nèi)分離出一株芽孢桿菌bacillussp.菌株，可在自然環(huán)境下快速侵染紫莖澤蘭種子使其無法正常萌發(fā)或者萌發(fā)根快速畸變導致萌發(fā)終止，是一種具有良好效果及開發(fā)研究遠景的微生物。本菌株的生物學特性研究如下。將菌株接種在lb培養(yǎng)基上并于28℃恒溫培養(yǎng)，3d。形態(tài)學觀察：挑取單菌落于載玻片上涂片后，用結(jié)晶紫對供試菌株染色，觀察細菌形態(tài)特征。用大腸桿菌做對照，進行革蘭氏染色。直接在培養(yǎng)基上觀察其菌落特征。分子生物學鑒定分子鑒定菌株dna的獲取：在無菌的環(huán)境中，挑供試菌株菌落在20μl無菌水，充分混勻，置于100℃金屬浴3h(半小時搖晃一次)裂解細胞，12000g離心1min去除菌體，吸取上清，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。核糖體16srdna-v4區(qū)段擴增：以細菌基因組dna為模板進行pcr擴增，引物由昆明擎科生物公司合成。pcr擴增反應在30μl反應體系中進行(見下表)。引物：16sv4515f5′-gtgccagcmgccgcggtaa-3′806r5′-ggactachvgggtwtctaat-3′反應成分終濃度所需體積(μl)ddh2017.5buffer1×3.0mgcl21mm2.0dntpmixture0.2mm3.0primer10.5μm1.5primer20.5μm1.5模板dna(稀釋4x)25ng1.0taq-dnaase1.5u0.5total30擴增循環(huán)反應條件為：94℃預變性1min；94℃變性30s，52℃退火60s，72℃延伸60s；35個循環(huán)；最終72℃延伸15min，4℃保存。取15μlpcr擴增產(chǎn)物和3μl核酸染料混合，于1.0％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，電泳緩沖液為0.5xtae，在120v電壓下進行15min，置于upv紫外成像系統(tǒng)上觀察成像，并拍照保存。目的片段切膠回收，方法參考qiagenepcrcleanupkit試劑盒說明書。pcr產(chǎn)物測序和序列分析：將回收產(chǎn)物送昆明擎科生物公司進行正反雙向測序，測序結(jié)果在genbank(http://www.ncbi.nih.gov)中進行blast比對分析。菌株鑒定形態(tài)學鑒定菌體桿狀或球狀，(0.3～2.2)μm×(1.2～7.0)μm，革蘭氏陽性菌。好氧型，多數(shù)運動，側(cè)生鞭毛，菌落表面粗糙、不透明、褶皺、乳白色或褐色、產(chǎn)色素。所得結(jié)果與已發(fā)表的bacillussp.相同，從形態(tài)學上判斷該菌株是bacillussp.。16srdna產(chǎn)物測序結(jié)果基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物對(515f和608r)擴增到400bp左右的基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及核糖體dna基因片段。由昆明擎科生物公司對16srdna擴增產(chǎn)物進行了雙向測序。結(jié)果在ncbi上進行對比，結(jié)果表明所擴增的片段與genbank中已發(fā)表的bacillussp.基因cp014166.1、al009126.1、d84213.1的同源性達到了100％。從分子水平證明該細菌就是bacillussp.。本發(fā)明提供的zlsy5菌由以下方式分離純化得到：澤蘭實蠅采自云南農(nóng)業(yè)大學化學樓附近的紫莖澤蘭上，將有蟲癭的紫莖澤蘭采回實驗室。對采回的蟲癭整體消毒后在超凈工作臺內(nèi)解剖出幼蟲，幼蟲用75％酒精漂洗三次，每次兩分鐘，無菌水漂洗三次后解剖，獲得澤蘭實蠅體內(nèi)各組織。滅菌：所用培養(yǎng)皿、離心管、試管，槍頭等實驗器材及無菌水采用高壓滅菌，0.1mpa，121℃，滅菌30分鐘。研磨：將澤蘭實蠅唾液腺放入無菌離心管中，加入1ml無菌水，用研磨棒研磨。梯度稀釋：將研磨后的汁液取1ml放入盛有9ml無菌水的試管中，即為10-1稀釋度的菌液，再從10-1稀釋度的菌液中取1ml放入盛有9ml無菌水的試管中，即為10-2稀釋度的菌液，以此類推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度的菌液。平板涂布：細菌的分離常用的培養(yǎng)基是牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(na培養(yǎng)基)，純化常用lb培養(yǎng)基。倒平板，每個培養(yǎng)皿倒大約15ml的培養(yǎng)基，平放靜置，待冷卻備用。將稀釋菌液10-4、10-5、10-6、10-7分別涂布于平板上，每個梯度涂三皿。在皿底做上標記。培養(yǎng)：倒置平皿于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天。菌的純化：在無菌條件下用挑針將na培養(yǎng)基上長出的單菌落挑取于lb培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。純化3-4次可得純化后的單菌落。zlsy5菌培養(yǎng)條件研究本發(fā)明提供了芽孢桿菌zlsy5的人工擴繁及使用方式包含以下步驟：zlsy5的一階段擴繁培養(yǎng)：用標準lb固體培養(yǎng)基，按體積比0.2％比例添加紫莖澤蘭水提取物，調(diào)ph值4.3-6.3，倒平板待冷卻后，接種zlsy5菌株，在溫度15℃-28℃培養(yǎng)1-3天，見有單菌落長出即可。zlsy5的二階段擴繁培養(yǎng)基：標準lb液體培養(yǎng)基，按體積比0.5％比例添加紫莖澤蘭水提取物，ph值4.3-6.3。挑取第一步擴繁后長出的單菌落，接入到100ml的lb液體培養(yǎng)基，28℃過夜搖床培養(yǎng)后，將菌懸液接入二階段擴繁培養(yǎng)基，在溫度15℃-28℃培養(yǎng)1-3天，每12小時進行一次攪拌，接種比例為：2l液體培養(yǎng)基接種400μl菌懸液的比例進行接種。所述紫莖澤蘭水提取物為：紫莖澤蘭鮮品植株(含葉片)，粉碎后在40℃±5℃下，按照質(zhì)量比1:9-1:12的比例浸提2小時，去除固體后取上清，0.22μm濾膜過濾后即可使用。zlsy5的使用液：將上述二階段培養(yǎng)完成的培養(yǎng)液，8℃冷藏8小時，取出后靜置至常溫按1:5-1:10的比例加水稀釋后直接噴灑需要防控的地塊及已開花或結(jié)實的紫莖澤蘭植株上，也可配合zlsy2、zlsy22菌株對已經(jīng)爆發(fā)的紫莖澤蘭做生物防控。zlsy5致病癥狀研究將直徑為180mm培養(yǎng)皿墊定性濾紙后滅菌，在超凈工作臺上將稀釋好的帶紫莖澤蘭種子的液體10ml均勻倒在無菌濾紙表面，紫莖澤蘭種子液體為：常溫下100ml無菌水添加0.2g紫莖澤蘭種子混勻。采取對比效果實驗，空白對照為采取澤蘭提取液加水按實例2比例稀釋后灌溉處理，其余均abc組采用實施例2菌液使用量：噴灑量為每培養(yǎng)皿5ml，培養(yǎng)皿為直徑180mm噴灑后在人工氣候箱內(nèi)暗光條件培養(yǎng)5天，顯微鏡下觀察種子萌發(fā)情況。以上數(shù)據(jù)可以看出含有zlsy5菌株的培養(yǎng)液后能夠顯著抑制紫莖澤蘭種子的萌發(fā)率，并在一定數(shù)量下導致萌發(fā)期種子根部病變。zlsy5室內(nèi)影響紫莖澤蘭播種的實驗結(jié)果將100粒紫莖澤蘭種子均勻與曬好并高溫滅菌處理過的細泥土中置于直徑50cm的花盆，播種后即將實施例1的菌液500ml均勻噴灑至土壤表層，空白對照使用的為單純紫莖澤蘭提取液。隨后觀察14天，觀察紫莖澤蘭出芽率和長勢，觀察期間視土壤情況正常灌溉無菌水，得到以下數(shù)據(jù)：從以上數(shù)據(jù)可以看出：含有zlsy5菌株的培養(yǎng)液后能夠顯著抑制紫莖澤蘭種子的萌發(fā)率，并在一定數(shù)量下導致萌發(fā)苗畸變。以下情況也表明：本發(fā)明所提供的枯草芽孢桿菌(bacillussp.)菌株(zlsy5菌株)，其分類學特征與枯草芽孢桿菌cgmccno.13451(zlsy2菌株)明顯不同。菌形態(tài)比較菌生理生化測定結(jié)果注：”a”既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣；“b”只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；“c”既不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的芽孢桿菌用于紫莖澤蘭的防控，效果好成本低。具體實施方式實施例1。第一步：將標準固體lb培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.2％紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整ph值至4.3倒平板，待冷凝后將zlsy5接種至培養(yǎng)基上，在15℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)1天后，挑取單菌落接入到100ml的lb液體培養(yǎng)基，28℃過夜搖床培養(yǎng)，獲得菌懸液備用。第二步：配置標準液體lb培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整ph值至4.3，降溫至25℃，將上一步驟準備好的菌懸液按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在25℃下培養(yǎng)3天，每12小時進行一次攪拌。取出降溫至8℃冷藏8小時。第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按照體積比培養(yǎng)基：水為1:10的比例稀釋后，噴灑至土壤表層或已開花或結(jié)實的紫莖澤蘭植株上。實施例2。第一步：將標準固體lb培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.2％紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整ph值至6.3倒平板，待冷凝后將zlsy5接種至培養(yǎng)基上，在28℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，挑取單菌落接入到100ml的lb液體培養(yǎng)基，28℃過夜搖床培養(yǎng)，獲得菌懸液備用。第二步：配置標準液體lb培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整ph值至6.5，降溫至22℃，將上一步驟準備好的菌懸液按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在22℃下培養(yǎng)5天，每12小時進行一次攪拌。取出降溫至8℃冷藏8小時。第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按照體積比培養(yǎng)基：水為1:10的比例稀釋后，噴灑至土壤表層或已開花或結(jié)實的紫莖澤蘭植株上。實施例3。第一步：將標準固體lb培養(yǎng)基滅菌后，在未凝固前添加0.2％紫莖澤蘭提取物，并調(diào)整ph值至5.7倒平板，待冷凝后將zlsy5接種至培養(yǎng)基上，在15℃培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，挑取單菌落接入到100ml的lb液體培養(yǎng)基，28℃過夜搖床培養(yǎng)，獲得菌懸液備用。第二步：配置標準液體lb培養(yǎng)基，滅菌后按體積比添加0.5％的紫莖澤蘭提取物，調(diào)整ph值至5.7，降溫至15℃，將上一步驟準備好的菌懸液按比例接種(添加)至液體培養(yǎng)基中，在15℃下培養(yǎng)3天，每12小時進行一次攪拌。取出降溫至8℃冷藏8小時。第三步：將冷藏好的帶菌液體培養(yǎng)基取出，按照體積比培養(yǎng)基：水為1:5的比例稀釋后，噴灑至土壤表層或已開花或結(jié)實的紫莖澤蘭植株上。當前第1頁12