本發(fā)明涉及一種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒及其制備方法。

背景技術(shù)：

酒的度數(shù)，又稱(chēng)酒精度，指的是酒中乙醇所占的體積百分比，如無(wú)特殊說(shuō)明，通常指的是20℃時(shí)酒中乙醇所占的體積百分比。酒精度一般用x％表示，有時(shí)也用x％(v/v)或x％vol或x°表示。酒精度為x％的意思是，20℃時(shí)，100單位體積的酒中含有x單位體積的乙醇。

低度果酒，例如干紅葡萄酒、干白葡萄酒，由于含有類(lèi)黃酮(花青苷)、人體必需的氨基酸及礦質(zhì)元素等營(yíng)養(yǎng)保健成分，近幾年在中國(guó)的消費(fèi)呈明顯的上升態(tài)勢(shì)。但是，低度果酒的酒精含量低、刺激作用小，不能有效滿(mǎn)足習(xí)慣喝白酒的人群的需求。為了滿(mǎn)足習(xí)慣喝白酒人群的需求，現(xiàn)有技術(shù)中通常通過(guò)向發(fā)酵液里加糖或食用酒精的方式來(lái)增加低度果酒的酒精度。

酒及酒文化，是中國(guó)飲食和社會(huì)文化的重要組成部分。白酒已滲透于整個(gè)中華五千年的文明史中，從文學(xué)藝術(shù)創(chuàng)作、文化娛樂(lè)到飲食烹飪、養(yǎng)生保健等各方面都占有重要的位置?？蛷倪h(yuǎn)方來(lái)，無(wú)酒不足以表達(dá)深情厚意。良辰佳節(jié)，無(wú)酒不足以顯示歡快愜意。春風(fēng)得意，無(wú)酒不足以抒發(fā)豪情壯志。因此，盡管低度果酒在中國(guó)的消費(fèi)呈明顯的上升態(tài)勢(shì)，具有一定酒度的白酒在未來(lái)仍有很大的發(fā)展空間。

“醫(yī)食同源，吃營(yíng)養(yǎng)，吃健康”已成為人們的共識(shí)。蘋(píng)果果實(shí)含有較多的人體容易吸收的游離多酚或類(lèi)黃酮，在抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病及抗腫瘤等方面均具有較好的作用，而酚酸(phenolicacids)是一類(lèi)含有酚環(huán)的有機(jī)酸，具有醒腦提神、滋陰養(yǎng)顏、美白肌膚、清熱解火的功效，“一天一蘋(píng)果，醫(yī)生遠(yuǎn)離我”，世界上相當(dāng)多的國(guó)家都將蘋(píng)果作為主要消費(fèi)果品而大力推薦。但長(zhǎng)期以來(lái)，由于對(duì)產(chǎn)量和外觀的過(guò)分追求，而果實(shí)多酚等一些優(yōu)良性狀在歷史的長(zhǎng)河中逐漸被淘汰。為此，陳學(xué)森教授所在課題組率先提出了“功能型(高類(lèi)黃酮)蘋(píng)果”的概念及其育種思路，為完善新品種選育方案，提高育種效率，擴(kuò)大高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的應(yīng)用范圍，采取了四項(xiàng)措施：一是在對(duì)新疆紅肉蘋(píng)果與蘋(píng)果品種雜種一代果實(shí)總酚含量等性狀遺傳變異研究的基礎(chǔ)上，提出并實(shí)施了“三選兩早一促”的蘋(píng)果育種法(專(zhuān)利號(hào)zl201310205419.6)，育種效率顯著提高；二是利用遺傳背景復(fù)雜的‘嘎啦’等蘋(píng)果品種與新疆紅肉蘋(píng)果(m.sieversiif.niedzwetzkyana)進(jìn)行多親本雜交與反復(fù)回交，旨在進(jìn)行品質(zhì)育種，目前已構(gòu)建雜(回)交一、二代分離群體40個(gè)，定植雜種實(shí)生苗4萬(wàn)株，并申報(bào)了“果樹(shù)多種源品質(zhì)育種法”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01510428448.8)及“易著色蘋(píng)果品種培育法”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?01510890141.x)2個(gè)育種技術(shù)發(fā)明專(zhuān)利；三是及時(shí)地以性狀基本穩(wěn)定的后代株系為試材，進(jìn)行品質(zhì)性狀評(píng)價(jià)及發(fā)育機(jī)理的研究，并已取得了諸多重要進(jìn)展；四是按照“可移動(dòng)、小型化、智能化、純天然、無(wú)添加”的理念，研制了包括一種行程式高類(lèi)黃酮蘋(píng)果破碎打漿器、多功能釀酒分餾器、多效冷凝烤酒器及分離儲(chǔ)酒器等高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒加工成套設(shè)備及加工工藝。目前，已創(chuàng)建了常規(guī)雜交與生物技術(shù)有機(jī)結(jié)合的蘋(píng)果高效育種技術(shù)體系，創(chuàng)制了一批新品種及優(yōu)異種質(zhì)，研發(fā)了蘋(píng)果新品種配套高效栽培與深加工技術(shù)體系。授權(quán)和申報(bào)發(fā)明專(zhuān)利30余項(xiàng)，育成新品種(系)16個(gè)；發(fā)表相關(guān)研究論文120篇，其中sci論文20余篇，這些研究成果總體處在國(guó)際同類(lèi)研究的領(lǐng)先水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒及其制備方法。

本發(fā)明首先提供了一種蘋(píng)果加工品(高度酒基)的制備方法，其特征在于：

以高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為原料，包括依次進(jìn)行的如下步驟：

(1)破碎打漿；

(2)滅菌；

(3)加入果膠酶；

(4)加入釀酒酵母并進(jìn)行發(fā)酵，直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高；

(5)蒸餾并收集85-95℃之間的餾出物，然后將餾出物再次蒸餾并收集85-95℃之間的餾出物，多次，直至得到酒精度為80％以上的餾出物，即為蘋(píng)果加工品。

所述高度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為唯一原料。所述高度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為清洗后的果實(shí)。所述高度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為用自來(lái)水清洗后的果實(shí)。所述高度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為用自來(lái)水徹底清洗去雜后的果實(shí)。

所述高度酒基的制備方法的所述步驟(1)中，破碎打漿至果漿粒度為1mm以下。

所述高度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件為：80-100℃滅菌5-12小時(shí)。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件具體可為：100℃、5小時(shí)。

所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u以上的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u-150萬(wàn)u以上的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u-150萬(wàn)u的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u-150萬(wàn)u的果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。

所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入10¹⁰cfu釀酒酵母。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入10¹⁰cfu釀酒酵母。所述發(fā)酵的過(guò)程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開(kāi)始持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。所述“直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高”時(shí)，發(fā)酵體系的酒精度為9％-12％。所述釀酒酵母具體可為高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)。

所述高度酒基的制備方法的所述步驟(5)中，所述“直至得到酒精度為80％以上的餾出物”，具體可為得到酒精度為80％-85％的餾出物。所述高度酒基的制備方法的所述步驟(5)中，所述“直至得到酒精度為80％以上的餾出物”，具體可為得到酒精度為80％的餾出物。

以上任一所述方法制備得到的蘋(píng)果加工品(高度酒基)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還保護(hù)所述蘋(píng)果加工品(高度酒基)在制備蘋(píng)果酒中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)一種蘋(píng)果酒(干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒)的制備方法，包括如下步驟：

①將1體積份高度酒基與5.5-6.5體積份低度酒基混合，先25～45℃靜置24～72小時(shí)，再0～4℃靜置24～72小時(shí)，收集液相，即為初酒；

②取步驟①得到的初酒，進(jìn)行高低溫交替熟化，得到成品酒。

所述步驟①中，將1體積份高度酒基與6體積份低度酒基混合，先30℃靜置24小時(shí)，再0℃靜置48小時(shí)，收集液相，即為初酒。所述步驟①中，所述“收集液相”具體可為“過(guò)600目篩，收集液相”。

所述步驟②中，所述高低溫交替熟化為：先25～45℃靜置24～72小時(shí)、再-8℃～-2℃靜置24～72小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次以上。所述步驟②中，所述高低溫交替熟化為：先30℃靜置24小時(shí)、再-5℃靜置48小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次。

所述方法制備得到的蘋(píng)果酒(干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述蘋(píng)果酒的度數(shù)為15％-21％，具體可為18％。

所述低度酒基以高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為原料，制備方法依次包括如下步驟：

(1)破碎打漿；

(2)滅菌；

(3)加入果膠酶；

(4)加入釀酒酵母并進(jìn)行發(fā)酵，直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高；

(5)收集液相，即為低度酒基。

所述低度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為唯一原料。所述低度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為清洗后的果實(shí)。所述低度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為用自來(lái)水清洗后的果實(shí)。所述低度酒基的制備方法中，所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)為用自來(lái)水徹底清洗去雜后的果實(shí)。

所述低度酒基的制備方法的所述步驟(1)中，破碎打漿至果漿粒度為1mm以下。

所述低度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件為：80-100℃滅菌5-12小時(shí)。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(2)中，所述滅菌的條件具體可為：100℃、5小時(shí)。

所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-55℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45-50℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為45℃時(shí)，加入果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u以上的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u-150萬(wàn)u以上的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u-150萬(wàn)u的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入100萬(wàn)u-150萬(wàn)u的果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(3)中，所述果膠酶的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入2-3g果膠酶。

所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為25-35℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，當(dāng)果漿自然冷卻至溫度為30℃時(shí)，加入釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入10¹⁰cfu釀酒酵母。所述低度酒基的制備方法的所述步驟(4)中，所述釀酒酵母的加入量為：每千克鮮重的高類(lèi)黃酮蘋(píng)果的成熟果實(shí)相應(yīng)加入10¹⁰cfu釀酒酵母。所述發(fā)酵的過(guò)程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開(kāi)始持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。所述“直至發(fā)酵體系的酒精度不再升高”時(shí)，發(fā)酵體系的酒精度為9％-12％。所述釀酒酵母具體可為高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)。

所述低度酒基的制備方法的所述步驟(5)中，所述“收集液相”具體可為“過(guò)600目篩，收集液相”。

所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果為每千克鮮重成熟果實(shí)的類(lèi)黃酮含量為5000mg以上的蘋(píng)果種質(zhì)。所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果為每千克鮮重成熟果實(shí)的類(lèi)黃酮含量為7000mg以上的蘋(píng)果種質(zhì)。所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果為每千克鮮重成熟果實(shí)的類(lèi)黃酮含量為10000mg以上的蘋(píng)果種質(zhì)。所述高類(lèi)黃酮蘋(píng)果具體可為‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’或‘csr6r6-777’。

‘csr6r6-888’，又稱(chēng)蘋(píng)果(malusdomestica)csr6r6-888，已于2017年6月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14295。

‘csr6r6-666’，又稱(chēng)蘋(píng)果(malusdomestica)csr6r6-666，已于2017年2月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.13783。

‘csr6r6-777’，又稱(chēng)蘋(píng)果(malusdomestica)csr6r6-777，已于2016年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.12468。

高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)，全稱(chēng)為酵母菌(saccharomycessp.)高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)，已于2017年6月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14250。

有效利用高類(lèi)黃酮蘋(píng)果優(yōu)異種質(zhì)及高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒加工成套設(shè)備，研制既具有蘋(píng)果特有的功能成分、果香濃郁，又具有較強(qiáng)的刺激性和白酒口感、可以滿(mǎn)足不同消費(fèi)人群需求的系列高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒，對(duì)于拉長(zhǎng)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)鏈、豐富酒品市場(chǎng)多樣性、提高企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量與效益、滿(mǎn)足市場(chǎng)和消費(fèi)需求具有重要意義。本發(fā)明提供的干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒，既含有類(lèi)黃酮、酚酸及礦質(zhì)元素等蘋(píng)果特有的功能保健成分，又具有較強(qiáng)的刺激性和白酒口感，酒香協(xié)調(diào)，入口醇平、爽和，回味清雅，適合喝低度白酒的人群飲用，具有重大的應(yīng)用推廣價(jià)值以及龐大的市場(chǎng)前景。

附圖說(shuō)明

圖1為‘csr6r6-888’干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒的照片。

圖2為‘csr6r6-888’干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒的照片。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

提及‘紅富士’蘋(píng)果和‘嘎啦’蘋(píng)果的參考文獻(xiàn)：陳學(xué)森，辛培剛等，元帥和金帥在蘋(píng)果新品種選育中的作用，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，25(2)：236—248。

0.5％鹽酸甲醇溶液的制備方法：將0.5體積份35％濃鹽酸與99.5體積份甲醇混合。

實(shí)施例中所用的果膠酶均為購(gòu)自寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司的果膠酶，相關(guān)參數(shù)為：固體粉末，酶活≥50萬(wàn)u/g,建議使用條件為“ph3.2-5.0，10-50℃”。50.0℃、ph3.5條件下，1min催化果膠水解生成1μg半乳糖醛酸的酶量為一個(gè)果膠酶活力單位(1u)。

實(shí)施例1、蘋(píng)果優(yōu)異種質(zhì)‘csr6r6-888’的獲得和鑒定

鑒定蘋(píng)果植株為r1r1基因型、r6r6基因型還是r6r1基因型的方法如下：從待測(cè)蘋(píng)果植株上取蘋(píng)果，提取蘋(píng)果果肉的基因組dna，以基因組dna為模板，采用f3和r3組成的引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后按如下標(biāo)準(zhǔn)判讀基因型：如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為497bp，待測(cè)蘋(píng)果植株為r6r6基因型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為一條帶且為386bp，待測(cè)蘋(píng)果植株為r1r1基因型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為兩條帶且分別為497bp和386bp，待測(cè)蘋(píng)果植株為r6r1基因型。

f3(序列1)：5’-ggtggtcaaagatgtgtgttgt-3’；

r3(序列2)：5’-tttgcctgctacccacttca-3’。

經(jīng)檢測(cè)，‘紅富士’蘋(píng)果和‘嘎啦’蘋(píng)果均為r1r1基因型。

一、‘csr6r6-888’的獲得

新疆紅肉蘋(píng)果作為親本，與‘紅富士’等白肉栽培蘋(píng)果品種雜交。按照孟德?tīng)栠z傳定律，新疆紅肉蘋(píng)果(r6r1基因型)與‘紅富士’(r1r1基因型)等白肉栽培蘋(píng)果品種雜交,其后代群體應(yīng)為紅肉表型(r6r1基因型):白肉表型(r1r1基因型)＝1:1。但是，在雜交f1代群體中發(fā)現(xiàn)了r6r6基因型的單株。

將一株r6r6基因型的單株命名為‘csr6r6-888’。

‘csr6r6-888’具有如下表型：莖、葉、花、果皮和果肉等各部分及各個(gè)發(fā)育階段均為深紫紅色。

‘csr6r6-888’的果實(shí)鮮食品質(zhì)：酸甜適口，酥脆多汁，鮮食品質(zhì)優(yōu)良。

通過(guò)嫁接枝條或組培的方式，將‘csr6r6-888’擴(kuò)繁。

二、‘csr6r6-888’的保藏

‘csr6r6-888’，又稱(chēng)蘋(píng)果(malusdomestica)csr6r6-888，已于2017年6月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14295。

三、‘csr6r6-666’的保藏

‘csr6r6-666’是發(fā)明人所在的實(shí)驗(yàn)室前期選育出來(lái)的另一株r6r6基因型的單株。

‘csr6r6-666’具有如下表型：莖、葉、花、果皮和果肉等各部分及各個(gè)發(fā)育階段均為紫紅色。

‘csr6r6-666’，又稱(chēng)蘋(píng)果(malusdomestica)csr6r6-666，已于2017年2月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.13783。

四、‘csr6r6-777’的保藏

‘csr6r6-777’是發(fā)明人所在的實(shí)驗(yàn)室前期選育出來(lái)的另一株r6r6基因型的單株。

‘csr6r6-777’，又稱(chēng)蘋(píng)果(malusdomestica)csr6r6-777，已于2016年12月08日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.12468。

五、類(lèi)黃酮組分含量分析

分別將‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’作為待測(cè)植株。

1、取待測(cè)植株上的成熟蘋(píng)果，取蘋(píng)果果肉。

2、取步驟1得到的果肉，在液氮中研磨得到粉末。

3、稱(chēng)取2g步驟2得到的粉末，加入5ml0.5％鹽酸甲醇溶液，4℃靜置提取2h，然后8000rpm離心20min，分別收集上清液和殘?jiān)?/p>

4、取步驟3得到的殘?jiān)?，加?ml0.5％鹽酸甲醇溶液，4℃靜置提取1h，然后8000rpm離心20min，收集上清液。

5、將步驟3得到的上清液和步驟4得到的上清液混合，得到混合液。

6、取步驟5得到的混合液，37℃旋蒸除去甲醇，殘留物用2-3ml甲醇溶解，然后8000rpm離心20min，收集上清液。

7、取步驟6得到的上清液，用甲醇定容至5ml，然后用0.45μm濾膜過(guò)濾，收集濾液。

8、將步驟7得到的濾液進(jìn)行hplc-ms分析。

液相色譜條件：

采用watersacquityuplc色譜儀，色譜柱為behc18柱(100mm×2.1mm)，填料粒徑1.7μm；柱溫45℃；進(jìn)樣體積1μl；

流動(dòng)相為a液和b液的混合液，流速為0.3ml/min；a液為乙腈，b液為含0.2％(體積分?jǐn)?shù))甲酸的水溶液；0-0.1min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)為5％；0.1-20min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由5％線(xiàn)性上升至20％；20-22min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由20％線(xiàn)性上升至80％；22-22.1min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由80％線(xiàn)性下降至5％；22.1-25min，a液占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)為5％。

質(zhì)譜條件：

質(zhì)譜儀為watersmaldisynaptq-tofms，esi電離源，電噴霧離子化正離子采集模式(esi+)；掃描范圍100-1500m/z；毛細(xì)管電壓3.5kv，錐孔電壓30v；源溫度100℃，脫溶溫度300℃；脫溶劑氣流量500l/h。

9種特定黃酮醇物質(zhì)的含量見(jiàn)表1。表1中的9種特有物質(zhì)的檢測(cè)方法均屬于類(lèi)黃酮組分及含量檢測(cè)方法，參考文獻(xiàn)(陳學(xué)森,張晶,劉大亮,等.新疆紅肉蘋(píng)果雜種一代的遺傳變異及功能型蘋(píng)果優(yōu)株評(píng)價(jià)[j].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,47(11):2193-2204.。

表1

以上結(jié)果表明，‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’均具有很強(qiáng)的類(lèi)黃酮合成能力，果肉富含類(lèi)黃酮，并且含有特殊的黃酮醇類(lèi)組分，為高類(lèi)黃酮蘋(píng)果品種的優(yōu)異種質(zhì)?！甤sr6r6-888’優(yōu)于‘csr6r6-666’，‘csr6r6-666’優(yōu)于‘csr6r6-777’。

六、類(lèi)黃酮含量測(cè)定

分別將‘csr6r6-888’、‘csr6r6-666’和‘csr6r6-777’作為待測(cè)植株。

(1)取待測(cè)植株上的成熟蘋(píng)果果實(shí)，取蘋(píng)果果肉。

(2)取1g果肉，液氮研磨，然后加入10ml4℃預(yù)冷的65％(體積百分含量)乙醇水溶液并混勻，4℃避光靜置提取4h，然后12000g離心20min，收集上清液。

(3)取試管，加入0.5ml步驟(2)得到的上清液，然后依次加入1ml5g/100mlnano2水溶液、1ml10g/100mlal(no3)3水溶液、4ml2mnaoh水溶液，混勻后靜置15min，8000rpm離心10min，取上清，然后在510nm下測(cè)定吸光值。

以蘆丁(rutin,sigmachemical,st,loiuis,usa)為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

‘csr6r6-888’的蘋(píng)果果實(shí)的類(lèi)黃酮含量為11358.7mg/kg鮮重。

‘csr6r6-666’的蘋(píng)果果實(shí)的類(lèi)黃酮含量為9134.6mg/kg鮮重。

‘csr6r6-777’的蘋(píng)果果實(shí)的類(lèi)黃酮含量為7555.1mg/kg鮮重。

實(shí)施例2、酵母菌株的獲得

一、天然酵母的馴化和分離

‘csr6r6-888’植株上生長(zhǎng)的蘋(píng)果成熟時(shí)，在果園中選擇優(yōu)良的蘋(píng)果帶回?zé)o菌室，將果皮切成小塊放入已殺過(guò)菌的裝有果汁的試管中，塞好棉塞置于25～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～8d。采用平板劃線(xiàn)分離法分離酵母菌株，每個(gè)發(fā)酵醪液做3個(gè)平板，28℃恒溫箱中培養(yǎng)3d。對(duì)菌落進(jìn)行形態(tài)觀察,從平板上挑取分離良好、具有典型性的單菌落，分別接種于試管斜面和經(jīng)滅菌的大試管蘋(píng)果汁中，每個(gè)發(fā)酵醪液的3個(gè)平板上只挑選3個(gè)單菌落，并編號(hào)標(biāo)記,以示菌株來(lái)源。試管斜面置于28℃培養(yǎng)3d,檢查菌苔是否單純,菌苔單純的好菌株置冰箱中貯存。

二、酵母篩選

1、杜氏管發(fā)酵篩選。

采用杜氏管發(fā)酵法，在相同的培養(yǎng)條件下，測(cè)定酵母菌株產(chǎn)氣泡的快慢及在規(guī)定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)氣泡的多少，初步比較各株酵母菌的起酵能力和發(fā)酵能力，篩選出發(fā)酵性能優(yōu)良的酵母菌株。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。菌株活化條件：25℃于10°brix的蘋(píng)果汁中恒溫培養(yǎng)24h。發(fā)酵條件：20℃于15°brix的蘋(píng)果汁中靜止發(fā)酵48h。

2、酵母菌發(fā)酵力測(cè)試(co2失重法)。

3、酵母菌凝聚性比較(酵母數(shù)比較法)。

4、酵母菌的耐乙醇、耐so2試驗(yàn)。

采用杜氏管發(fā)酵法,將酵母菌分別接入不同乙醇濃度(6％、8％、10％、12％,v/v)和不同so2濃度(50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l)的蘋(píng)果汁中，在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察杜氏管中的氣泡產(chǎn)生情況，比較各酵母菌株對(duì)乙醇、so2的耐受程度，進(jìn)一步確定適合蘋(píng)果酒釀造的菌株。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。菌株活化條件：25℃于10°brix的蘋(píng)果汁中恒溫培養(yǎng)24h。發(fā)酵條件：20℃于15°brix的蘋(píng)果汁中靜止發(fā)酵96h(由于乙醇或so2的存在，對(duì)酵母菌的發(fā)酵在不同程度上會(huì)產(chǎn)生抑制作用，故產(chǎn)氣觀察時(shí)間延長(zhǎng)為96h)。接種量：(6～8)×10⁷個(gè)/ml。

5、酵母菌釀制蘋(píng)果酒發(fā)酵試驗(yàn)。

取500ml三角瓶,加入400ml蘋(píng)果汁(糖度20°brix)，按20ml/l的接種量接入菌濃度為(3～3.6)×10⁶個(gè)/ml的酵母菌種子液，20℃發(fā)酵。發(fā)酵至第15d進(jìn)行倒罐，去除酒腳，再陳釀10d后，測(cè)定蘋(píng)果酒的理化指標(biāo)并進(jìn)行感官分析。

通過(guò)酵母發(fā)酵力比較、凝聚力比較、耐so2、耐乙醇能力比較和對(duì)其發(fā)酵所得蘋(píng)果酒的理化指標(biāo)分析及感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，篩選出三株最佳蘋(píng)果酒釀酒酵母，分別命名為高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)、高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母二號(hào)、高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母三號(hào)。

三、比較步驟二得到的三株酵母菌生產(chǎn)蘋(píng)果酒的性能

待測(cè)酵母分別為：高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)、高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母二號(hào)或高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母三號(hào)。

1、取‘csr6r6-888’無(wú)腐爛的成熟果實(shí)，用自來(lái)水徹底清洗。

2、完成步驟1后，取果實(shí)，進(jìn)行破碎打漿，直至果漿粒度為1mm以下。

3、完成步驟2后，將果漿進(jìn)行滅菌(80℃，12小時(shí))。

4、完成步驟3后，自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為50℃時(shí)加入果膠酶(每1000g鮮重的果實(shí)，加入2-3g果膠酶)。

5、完成步驟4后，繼續(xù)自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為30℃時(shí)，加入待測(cè)酵母(每1000g鮮重的果實(shí)，加入10¹⁰cfu的待測(cè)酵母)，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的酒精度，當(dāng)酒精度不再升高時(shí)停止發(fā)酵(此時(shí)體系的酒精度為9％-12％)。發(fā)酵過(guò)程中，從加入待測(cè)酵母24小時(shí)后開(kāi)始持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。

對(duì)得到的蘋(píng)果酒進(jìn)行理化指標(biāo)分析及感官品質(zhì)評(píng)價(jià)，高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)的各項(xiàng)指標(biāo)最理想，可耐12％的乙醇,其發(fā)酵的原酒酒精度達(dá)11.9％，酒體澄清透明,具有蘋(píng)果酒的典型風(fēng)味。

四、高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)的鑒定

形態(tài)特征：呈橢圓球形，有明顯的細(xì)胞核和大小不等的液泡。

生理生化特征：可以利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖發(fā)酵產(chǎn)氣，可以同化葡萄糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、纖維二糖、檸檬酸，不能產(chǎn)酸及類(lèi)淀粉化合物，可以產(chǎn)酯香味物質(zhì)。

生長(zhǎng)特征：最適生長(zhǎng)ph5.5-6.5,最適生長(zhǎng)溫度29-31℃。

五、高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)的保藏

高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)，全稱(chēng)為酵母菌(saccharomycessp.)高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)，已于2017年6月16日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為cgmccno.14250。

采用高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒酵母一號(hào)作為釀酒酵母進(jìn)行實(shí)施例3和實(shí)施例4。

實(shí)施例3、高度酒基的制備

分別采用‘csr6r6-888’上的蘋(píng)果、‘csr6r6-666’上的蘋(píng)果和‘csr6r6-777’上的蘋(píng)果果實(shí)制備高度酒基。

1、取無(wú)腐爛的成熟蘋(píng)果果實(shí)，用自來(lái)水徹底清洗去雜。

2、完成步驟1后，取果實(shí)，進(jìn)行破碎打漿，直至果漿粒度為1mm以下。

3、完成步驟2后，將果漿進(jìn)行滅菌(100℃、5小時(shí)；實(shí)際應(yīng)用中可采用80-100℃滅菌5-12小時(shí)，當(dāng)溫度較低時(shí)采用較長(zhǎng)的滅菌時(shí)間，當(dāng)溫度較高時(shí)采用較短的滅菌時(shí)間，例如當(dāng)80℃時(shí)采用10-12小時(shí)的滅菌時(shí)間，當(dāng)100℃時(shí)采用5小時(shí)的滅菌時(shí)間)。

4、完成步驟3后，自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為45℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用45-55℃，具體可采用45-50℃)時(shí)，加入果膠酶(每1000g鮮重的果實(shí)，加入2-3g果膠酶；2-3g果膠酶的酶活為100萬(wàn)u-150萬(wàn)u以上)。

5、完成步驟4后，繼續(xù)自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為30℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用25-35℃)時(shí)，加入釀酒酵母(每1000g鮮重的果實(shí)，加入10¹⁰cfu釀酒酵母)，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的酒精度，當(dāng)酒精度不再升高時(shí)停止發(fā)酵(此時(shí)體系的酒精度為9％-12％)。發(fā)酵過(guò)程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開(kāi)始持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。

6、完成步驟5后，進(jìn)行蒸餾，收集85-95℃之間的餾出物。該餾出物的酒精度約為20％。

7、取步驟6得到的餾出物，進(jìn)行多次蒸餾，每次均收集收集85-95℃之間的餾出物，直至得到酒精度為80％以上的餾出物，即為高度酒基。

‘csr6r6-888’得到的高度酒基命名為‘csr6r6-888’高度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-888’高度酒基的酒精度為80％。

‘csr6r6-666’得到的高度酒基命名為‘csr6r6-666’高度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-666’高度酒基的酒精度為80％。

‘csr6r6-777’得到的高度酒基命名為‘csr6r6-777’高度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-777’高度酒基的酒精度為80％。

實(shí)施例4、低度酒基的制備

分別采用‘csr6r6-888’上的蘋(píng)果、‘csr6r6-666’上的蘋(píng)果和‘csr6r6-777’上的蘋(píng)果果實(shí)制備低度酒基。

1、取無(wú)腐爛的成熟蘋(píng)果果實(shí)，用自來(lái)水徹底清洗去雜。

2、完成步驟1后，取果實(shí)，進(jìn)行破碎打漿，直至果漿粒度為1mm以下。

3、完成步驟2后，將果漿進(jìn)行滅菌(100℃、5小時(shí)；實(shí)際應(yīng)用中可采用80-100℃滅菌5-12小時(shí)，當(dāng)溫度較低時(shí)采用較長(zhǎng)的滅菌時(shí)間，當(dāng)溫度較高時(shí)采用較短的滅菌時(shí)間，例如當(dāng)80℃時(shí)采用10-12小時(shí)的滅菌時(shí)間，當(dāng)100℃時(shí)采用5小時(shí)的滅菌時(shí)間)。

4、完成步驟3后，自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為45℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用45-55℃，具體可采用45-50℃)時(shí)，加入果膠酶(每1000g鮮重的果實(shí)，加入2-3g果膠酶；2-3g果膠酶的酶活為100萬(wàn)u-150萬(wàn)u以上)。

5、完成步驟4后，繼續(xù)自然冷卻，當(dāng)果漿溫度為30℃(實(shí)際應(yīng)用中，可采用25-35℃)時(shí)，加入釀酒酵母(每1000g鮮重的果實(shí)，加入10¹⁰cfu釀酒酵母)，進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的酒精度，當(dāng)酒精度不再升高時(shí)停止發(fā)酵(此時(shí)體系的酒精度為9％-12％)。發(fā)酵過(guò)程中，從加入釀酒酵母24小時(shí)后開(kāi)始持續(xù)監(jiān)測(cè)發(fā)酵體系的溫度，控制溫度為15-20℃。

6、完成步驟5后，過(guò)600目篩，收集液相，即為低度酒基。

‘csr6r6-888’得到的低度酒基命名為‘csr6r6-888’低度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-888’低度酒基的酒精度為10％。

‘csr6r6-666’得到的低度酒基命名為‘csr6r6-666’低度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-666’低度酒基的酒精度為10％。

‘csr6r6-777’得到的低度酒基命名為‘csr6r6-777’低度酒基。本實(shí)施例得到的‘csr6r6-777’低度酒基的酒精度為10％。

實(shí)施例5、干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒的制備

1、將1體積份高度酒基與6體積份低度酒基混合，先30℃靜置24小時(shí)，再0℃靜置48小時(shí)，然后過(guò)600目篩，收集液相，即為初酒。實(shí)際應(yīng)用中，可先25至45℃靜置24至72小時(shí)，再0至4℃靜置24至72小時(shí)。

2、取步驟1得到的初酒，進(jìn)行高低溫交替熟化(先30℃靜置24小時(shí)、再-5℃靜置48小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次)，得到成品酒。實(shí)際應(yīng)用中，可先25至45℃靜置24至72小時(shí)、再-8℃至-2℃靜置24至72小時(shí)，重復(fù)進(jìn)行15次以上。

采用實(shí)施例3制備的‘csr6r6-888’高度酒基和實(shí)施例4制備的‘csr6r6-888’低度酒基制備得到的成品酒命名為‘csr6r6-888’干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒?！甤sr6r6-888’干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒的照片見(jiàn)圖1和圖2。

采用實(shí)施例3制備的‘csr6r6-666’高度酒基和實(shí)施例4制備的‘csr6r6-666’低度酒基制備得到的成品酒命名為‘csr6r6-666’干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒。

采用實(shí)施例3制備的‘csr6r6-777’高度酒基和實(shí)施例4制備的‘csr6r6-777’低度酒基制備得到的成品酒命名為‘csr6r6-777’干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒。

實(shí)施例6、酒精度檢測(cè)和感官描述

取實(shí)施例5制備的三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒，檢測(cè)酒精度和感官指標(biāo)。

結(jié)果見(jiàn)表2。酒精度為18％的干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒，外觀為橙紅色、澄清透明，酒香協(xié)調(diào)、果香突出，入口醇平、爽和，回味清雅。

表2

實(shí)施例7、食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

取實(shí)施例5制備的三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒，根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb2757-2012和gb2760-2014檢測(cè)甲醇和重金屬含量。

結(jié)果表明，實(shí)施例5制備的三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒中的甲醇含量符合食品安全指標(biāo)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)施例5制備的三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒中的鋁、錳等重金屬含量均符合食品安全指標(biāo)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)施例8、營(yíng)養(yǎng)保健成分檢測(cè)

以煙臺(tái)張?jiān)Ｆ咸厌劸乒煞萦邢薰旧a(chǎn)的酒精度為12％的張?jiān)８砂灼咸丫坪途凭葹?2％的張?jiān)８杉t葡萄酒為對(duì)照。分別檢測(cè)實(shí)施例5制備的三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒和對(duì)照酒的類(lèi)黃酮含量和酚酸含量。

一、提取

1、取20ml待測(cè)酒，用1mol/lnaoh調(diào)ph值至7，用乙酸乙酯萃取3次(每次加入20ml乙酸乙酯，充分混合后靜置分層，然后收集有機(jī)相),將三次萃取收集的有機(jī)相混合，然后40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，此時(shí)得到的殘留物即為類(lèi)黃酮(中性酚)，加入2ml甲醇溶解殘留物，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行hplc測(cè)定。

2、取步驟1中3次萃取后剩余的酒液，用2mol/lhcl調(diào)ph值至2，用乙酸乙酯萃取3次(每次加入20ml乙酸乙酯，充分混合后靜置分層，然后收集有機(jī)相),將三次萃取收集的有機(jī)相混合，然后40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，此時(shí)得到的殘留物即為酚酸(酸性酚)，加入2ml甲醇溶解殘留物，然后用0.22μm濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行hplc測(cè)定。

二、hplc檢測(cè)

1、hplc檢測(cè)類(lèi)黃酮的相關(guān)參數(shù)

高效液相色譜裝置型號(hào)為2695(waters，milford，ma，usa)，二極管陣列檢測(cè)器(pda2998waters，milford，ma，usa)，季泵和自動(dòng)采樣器；分離柱為對(duì)稱(chēng)c18(4.6×150毫米，3.5μm)柱(waters，milford，ma，usa)，柱溫20℃。

進(jìn)樣量為10μl。

流動(dòng)相由溶劑a(含體積比為2.5％的乙酸的水溶液)和溶劑b(乙腈)組成，或者，流動(dòng)相為溶劑b。洗脫過(guò)程(流速1ml/min)：0-5min，溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由3％線(xiàn)性上升至9％；6-15min，溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由9％線(xiàn)性上升至16％；16-33min，溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由16％線(xiàn)性上升至36.4％；34-38min溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)保持100％；最后柱子修復(fù)10分鐘(溶劑b占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)為3％)。

黃烷醇和二氫查爾酮的檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，黃酮醇的檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。黃烷醇包括兒茶素、表兒茶素、原花青素b2。二氫查耳酮包括根皮苷。黃酮醇包括山奈酚、蘆丁、異槲皮苷(槲皮素-3-葡萄糖苷)、番石榴苷(槲皮素-3-o-α-l-吡喃阿拉伯糖苷)、金絲桃苷(槲皮素-3-o-β-d-吡喃半乳糖苷)、槲皮素鼠李糖苷。

兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為12.52min。表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為16.06min。原花青素b2標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為13.83min。根皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為27.76min。山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為36.86min。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為21.37min。異槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為23.25min。番石榴苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為24.39min。金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為22.64min。槲皮素鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為25.35min。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自sigma-aldrichco。

2、hplc檢測(cè)酚酸的相關(guān)參數(shù)

高效液相色譜裝置型號(hào)為2695(waters，milford，ma，usa)，二極管陣列檢測(cè)器(pda2998waters，milford，ma，usa)，季泵和自動(dòng)采樣器；分離柱為對(duì)稱(chēng)c18(4.6×150毫米，3.5μm)柱(waters，milford，ma，usa)，柱溫30℃。

進(jìn)樣量為10μl。

流動(dòng)相由乙腈和0.6％(體積比)乙酸水溶液組成。洗脫過(guò)程(流速0.5ml/min)：0-35min，乙腈占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由5％線(xiàn)性上升至35％；36-40min，乙腈占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)保持35％；41-42min，乙腈占流動(dòng)相的體積分?jǐn)?shù)由35％線(xiàn)性下降至5％。

檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為6.51min。對(duì)羥基苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為15.33min。兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為15.55min。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為15.60min?？Х人針?biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為17.29min。丁香酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為17.3min。香蘭素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為21.66min。香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為22.35min。阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為24.09min。苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為28.35min。香豆素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為30.69min。肉桂酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為37.21min。根皮素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為38.49min。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自sigma-aldrichco。

三、結(jié)果

三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒以及兩種對(duì)照酒中的類(lèi)黃酮組分含量見(jiàn)表3。三種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒以及兩種對(duì)照酒中的酚酸組分含量見(jiàn)表4。以高類(lèi)黃酮優(yōu)異種質(zhì)csr6r6-666、csr6r6-777和csr6r6-888的成熟蘋(píng)果果實(shí)為原料制成的3種干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒的類(lèi)黃酮組分含量和酚酸組分含量均顯著高于兩種類(lèi)似度數(shù)的對(duì)照酒，其中csr6r6-888的成熟蘋(píng)果果實(shí)為原料制成的干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒中類(lèi)黃酮組分含量和酚酸組分含量最高。

表3類(lèi)黃酮組分含量

表4酚酸組分含量

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<110>山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>干低型高類(lèi)黃酮蘋(píng)果酒及其制備方法

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