本發(fā)明涉及人巨細(xì)胞病毒領(lǐng)域，且特別是涉及一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大量流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明人巨細(xì)胞病毒(humancytomeglovirus，hcmv)在育齡婦女生殖道的隱性感染率超過90％。當(dāng)婦女懷孕時(shí)，潛伏體內(nèi)的hcmv被激活、繁殖而導(dǎo)致胎兒的宮內(nèi)感染，結(jié)果會(huì)導(dǎo)致死胎(流產(chǎn))、畸胎和新生兒出生缺陷。孕婦宮內(nèi)感染的hcmv還可傳給新生兒并潛伏在其泌尿生殖系統(tǒng)，病毒對(duì)這些出生就已經(jīng)攜帶hcmv的新生兒腎臟持續(xù)的損害可能是其成年后發(fā)生原發(fā)性腎功衰竭的原因之一。另外婦女生殖道的乳頭瘤病毒hpv長(zhǎng)期潛伏感染是導(dǎo)致婦女子宮頸癌等生殖系統(tǒng)癌腫發(fā)生的元兇，大量研究表明hpv合并cmv感染后，其致癌風(fēng)險(xiǎn)將增加900倍以上?，F(xiàn)在臨床上廣泛使用的、以“更昔洛韋”為代表的抗hcmv藥物，其抗病毒機(jī)理是通過抑制dna的復(fù)制來完成的。但由于在抑制病毒dna復(fù)制的同時(shí)也抑制了正常人體細(xì)胞的dna復(fù)制，因而其具有抑制人體生長(zhǎng)發(fā)育的嚴(yán)重副作用，被禁止用于孕婦和少年兒童。綜上可見，hcmv在育齡婦女生殖道的潛伏感染是目前醫(yī)學(xué)界尚未能解決的、嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問題。

因此現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體及其制備方法和應(yīng)用，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)的抗hcmv藥物抑制人體生長(zhǎng)發(fā)育的嚴(yán)重副作用，無(wú)法用于孕婦和少年兒童的問題。

本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：

一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、培養(yǎng)正常人肺胚胎成纖維細(xì)胞hel；

步驟2、將步驟1中的成纖維細(xì)胞hel用hcmv標(biāo)準(zhǔn)病毒株感染；

步驟3、獲取步驟2中感染hcmv標(biāo)準(zhǔn)病毒株的成纖維細(xì)胞hel，經(jīng)裂解、分離、提取和純化后，獲得優(yōu)質(zhì)hcmv病毒蛋白；

步驟4、將步驟3中獲得的優(yōu)質(zhì)hcmv病毒蛋白制備免疫針劑；

步驟5、利用步驟4制備的免疫針劑對(duì)母雞進(jìn)行免疫注射；

步驟6、收集步驟5中已經(jīng)免疫注射后的母雞生產(chǎn)的雞蛋；

步驟7、將步驟6收集的雞蛋去蛋白留蛋黃，分離提純獲得抗hcmv卵黃抗體。

所述的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備方法，其中，所述步驟5中的母雞選用50-100天齡的母雞。

所述的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備方法，其中，所述步驟6中，收集已經(jīng)注射免疫針劑120天-180天齡的母雞生產(chǎn)的雞蛋。

一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體，通過如上所述的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備方法得到。

一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的用途，所述抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體在制備女性生殖道健康護(hù)理凝膠的應(yīng)用。

一種含有所述的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，其組分包括抗hcmv天然提取物、小分子團(tuán)水、抗hcmv卵黃抗體、保濕劑、皮膚調(diào)理劑、增稠劑、ph調(diào)節(jié)劑以及清涼劑。

所述的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，按照各個(gè)組分在該女性生殖道健康護(hù)理凝膠中的質(zhì)量百分含量計(jì)，包括：

抗hcmv天然提取物，含量為5％～20％；

小分子團(tuán)水，含量為30％～70％；

抗hcmv卵黃抗體，含量為5％～20％；

保濕劑，含量為8％～20％；

皮膚調(diào)理劑，含量為6％～9％；

增稠劑，含量為1％～3％；

ph調(diào)節(jié)劑，含量為0.05％～0.15％；

清涼劑，含量為0.02％～0.2％。

所述的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，其中，所述保濕劑為甘油、丙二醇或者丁二醇中的一種或者兩種以上的混合物；所述皮膚調(diào)理劑為甘油聚甲基丙烯酸酯、乙醇、氫氧化銨、n-丁醇、異丙醇、苦參根提取物、魚腥草提取物或者透明質(zhì)酸中的一種或者兩種以上的混合物；所述增稠劑為羥乙基纖維素或者聚丙烯酸鈉接枝淀粉中的一種或者兩種的混合物。

所述的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，其中，所述抗hcmv天然提取物為田七提取物。

一種如上所述的女性生殖道健康護(hù)理凝膠的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、將抗hcmv天然提取物、抗hcmv卵黃抗體以及皮膚調(diào)理劑、清涼劑依次添加到小分子團(tuán)水中，至完全溶解，混合均勻得到第一混合物；

步驟2、將保濕劑、增稠劑依次加入到步驟1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均勻得到第二混合物；

步驟3、將ph調(diào)節(jié)劑加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康護(hù)理凝膠。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的女性生殖道健康護(hù)理凝膠通過將抗hcmv天然提取物廣譜抗病毒的特性與特殊制備的抗hcmv卵黃抗體的特異性抗hcmv特性結(jié)合起來，通過作用于病毒入侵人體細(xì)胞信號(hào)通道各水平的干預(yù)，阻止病毒的入侵或與正常細(xì)胞dna的整合，達(dá)到抑制病毒生長(zhǎng)繁殖的作用，同時(shí)對(duì)正常人體細(xì)胞無(wú)害，從而達(dá)到高效抗hcmv作用，起到局部清潔、抑制病原體生長(zhǎng)和抗病毒功效，從而為育齡女性及孕婦建立健康屏障，降低孕婦宮內(nèi)病毒感染幾率繼而減低新生兒出生缺陷發(fā)病率，降低女性生殖道癌腫的發(fā)病率；且無(wú)毒，育齡女性、孕婦及嬰幼兒均適用，針對(duì)性強(qiáng)，作用直接，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的口服或注射給藥。

附圖說明

圖1為人包皮成纖維細(xì)胞hffs在培養(yǎng)基正常生長(zhǎng)96小時(shí)顯微鏡下觀察到的實(shí)時(shí)圖片；

圖2為hcmv感染hffs后培養(yǎng)96小時(shí)顯微鏡下觀察到的實(shí)時(shí)圖片；

圖3為hcmv感染hffs后加igy培養(yǎng)96小時(shí)顯微鏡下觀察到的實(shí)時(shí)圖片。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚、明確，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備方法，包括以下

步驟：

步驟1、培養(yǎng)正常人肺胚胎成纖維細(xì)胞hel；

步驟2、將步驟1中的成纖維細(xì)胞hel用hcmv標(biāo)準(zhǔn)病毒株感染；

步驟3、獲取步驟2中感染hcmv標(biāo)準(zhǔn)病毒株的成纖維細(xì)胞hel，經(jīng)裂解、分離、提取和純化后，獲得優(yōu)質(zhì)hcmv病毒蛋白；

其中，在步驟3中，將感染hcmv標(biāo)準(zhǔn)病毒株的成纖維細(xì)胞hel裂解、分離、提取得到hcmv蛋白粗品，其具體操作如下所示：

首先，培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞hel在具蓋試管內(nèi)懸浮于0.15m，ph6.5-7.4的磷酸緩沖溶液中；接著，將試管反復(fù)置于“無(wú)水酒精-干冰溶液”浴鍋和37℃水浴鍋中，放置時(shí)間以試管中hel細(xì)胞液完全凍結(jié)和完全融化為準(zhǔn)，如此反復(fù)凍融三次后，試管于10000rpm速度，4℃離心15分鐘，棄上清液，再將沉淀用適量的0.15m，ph6.5-7.4的磷酸緩沖溶液重懸浮，即得hcmv蛋白粗提品。

步驟3中的hcmv蛋白的純化具體操作如下所示：

首先，將hcmv蛋白粗提溶液過deae弱陰離子交換柱(交換柱預(yù)先用0.15m，ph6.5-7.4的磷酸緩沖溶液平衡)，棄流出液以除去核酸雜質(zhì)，然后用含0.25mnacl的0.15m，ph6.5-7.4的磷酸緩沖溶液洗脫，最后收集280nm波長(zhǎng)下的流出峰，即得純化的hcmv蛋白溶液。

步驟4、將步驟3中獲得的優(yōu)質(zhì)hcmv病毒蛋白制備免疫針劑；

步驟5、利用步驟4制備的免疫針劑對(duì)母雞進(jìn)行免疫注射；

步驟6、收集步驟5中已經(jīng)免疫注射后的母雞生產(chǎn)的雞蛋；

步驟7、將步驟6收集的雞蛋去蛋白留蛋黃，分離提純獲得抗hcmv卵黃抗體(igyagainsthcmv,簡(jiǎn)稱igy)。

所述步驟7中的“分離提純”具體操作如下所示：

首先，將收集的蛋黃加9倍滅菌蒸餾水稀釋，4℃-8℃放置過夜棄沉淀，取上清液過deae弱陰離子交換柱(交換柱預(yù)先用0.15m，ph6.5-7.4的磷酸緩沖溶液平衡)，棄流出液以除去核酸雜質(zhì)，然后用含0.25mnacl的0.15m，ph6.5-7.4的磷酸緩沖溶液洗脫，最后收集280nm波長(zhǎng)下的流出峰，即得純化的hcmv卵黃抗體。

優(yōu)選的，所述步驟5中的母雞選用50-100天齡母雞，例如可以選用出生50天的母雞、出生75天的母雞、或者出生100天的母雞。

所述步驟6中，收集已經(jīng)注射免疫針劑120天-180天齡母雞生產(chǎn)的雞蛋，例如可以收集已經(jīng)注射免疫針劑120天、150天齡母雞生產(chǎn)的雞蛋、或者收集已經(jīng)注射免疫針劑180天齡母雞生產(chǎn)的雞蛋。

本發(fā)明的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體igy是禽類在卵發(fā)育期間受到異種抗原刺激后產(chǎn)生于卵黃中的特異性抗體，具有操作簡(jiǎn)便，無(wú)須處死動(dòng)物，且來源安全(源于雞蛋的卵黃抗體igy屬于美國(guó)和歐盟fda認(rèn)可的“傳統(tǒng)安全食品”，無(wú)須進(jìn)行安全性審查)。

本發(fā)明還提供了一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體，通過如上所述的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備方法得到。

下面對(duì)本發(fā)明所制備的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體在抗hcmv方面的功效進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如下所示：

(1)抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的制備

取純化的hcmv抗原蛋白對(duì)三月齡左右的母雞進(jìn)行免疫注射，收集該母雞生產(chǎn)的所有雞蛋，取蛋黃，經(jīng)分離、提取和純化，得到特異性抗hcmv的卵黃抗體igy。

(2)取人包皮成纖維細(xì)胞hffs在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將hffs培養(yǎng)96小時(shí)在顯微鏡下觀察，如圖1所示，人包皮成纖維細(xì)胞hffs正常生長(zhǎng)。

(3)使用hcmv感染hffs，96小時(shí)在顯微鏡下觀察如圖2所示，由于病毒大量復(fù)制，致細(xì)胞腫脹、空斑形成，細(xì)胞基本死亡。

(3)在使用hcmv感染hffs的同時(shí)往培養(yǎng)基里加入抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體igy(濃度為0.05mg/ml),96小時(shí)在顯微鏡下觀察如圖3所示，仍有相當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞存活。

由上述抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體igy在體外細(xì)胞培養(yǎng)抗hcmv效果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：本發(fā)明制備的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體具備抵抗hcmv對(duì)人包皮細(xì)胞hffs侵襲的功效。

本發(fā)明還提供了一種抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的用途，所述抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體在制備女性生殖道健康護(hù)理凝膠的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種含有所述的抗人巨細(xì)胞病毒卵黃抗體的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，其組分包括抗hcmv天然提取物、小分子團(tuán)水、抗hcmv卵黃抗體、保濕劑、皮膚調(diào)理劑、增稠劑、ph調(diào)節(jié)劑以及清涼劑。

其中，抗hcmv天然提取物是天然的中草藥提取物，其能夠針對(duì)病毒粘附并侵入人體細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一些特殊靶點(diǎn)發(fā)揮封閉或抑制作用，其抗病毒作用具有普遍性，即對(duì)局部潛伏的hcmv、hpv及其它病毒均有一定作用。而抗hcmv卵黃抗體，則可以特異性地抵抗hcmv在作用部位的感染。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的女性生殖道健康護(hù)理凝膠具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的女性生殖道健康護(hù)理凝膠通過將抗hcmv天然提取物廣譜抗病毒的特性與特殊制備的抗hcmv卵黃抗體的特異性抗hcmv特性結(jié)合起來，通過作用于病毒入侵人體細(xì)胞信號(hào)通道各水平的干預(yù)，阻止病毒的入侵或與正常細(xì)胞dna的整合，達(dá)到抑制病毒生長(zhǎng)繁殖的作用，同時(shí)對(duì)正常人體細(xì)胞無(wú)害，從而達(dá)到高效抗hcmv作用，起到局部清潔、抑制病原體生長(zhǎng)和抗病毒功效，從而為育齡女性及孕婦建立健康屏障，降低孕婦宮內(nèi)病毒感染幾率繼而減低新生兒出生缺陷發(fā)病率，降低女性生殖道癌腫的發(fā)病率；且無(wú)毒，育齡女性、孕婦及嬰幼兒均適用，針對(duì)性強(qiáng)，作用直接，效果優(yōu)于傳統(tǒng)的口服或注射給藥。

優(yōu)選的，所述女性生殖道健康護(hù)理凝膠，按照各個(gè)組分在該女性生殖道健康護(hù)理凝膠中的質(zhì)量百分含量計(jì)，包括：

抗hcmv天然提取物，含量為5％～20％；

小分子團(tuán)水，含量為30％～70％；

抗hcmv卵黃抗體，含量為5％～20％；

保濕劑，含量為8％～20％；

皮膚調(diào)理劑，含量為6％～9％；

增稠劑，含量為1％～3％；

ph調(diào)節(jié)劑，含量為0.05％～0.15％；

清涼劑，含量為0.02％～0.2％。

優(yōu)選的，所述保濕劑為甘油、丙二醇或者丁二醇中的一種或者兩種以上的混合物；所述皮膚調(diào)理劑為甘油聚甲基丙烯酸酯、乙醇、氫氧化銨、n-丁醇、異丙醇、苦參根提取物、魚腥草提取物或者透明質(zhì)酸中的一種或者兩種以上的混合物；所述增稠劑為羥乙基纖維素或者聚丙烯酸鈉接枝淀粉中的一種或者兩種的混合物。

優(yōu)選的，所述清涼劑為冰片或者薄荷醇中的一種或者兩種的混合物；所述ph調(diào)節(jié)劑為檸檬酸。

優(yōu)選的，所述抗hcmv天然提取物為田七提取物，所述田七提取物中含有總黃酮類物質(zhì)和總皂苷類物質(zhì)，所述田七提取物的制備方法以及在抗hcmv方面的作用請(qǐng)參見專利號(hào)為cn102166238b，名稱為“一種田七提取物及其應(yīng)用”的中國(guó)發(fā)明專利，在此不再贅述。應(yīng)當(dāng)說明的是所述抗hcmv天然提取物還可以是其它提取物，例如蒲公英、大青葉、金銀花和魚腥草等植物提取物。

優(yōu)選的，所述抗hcmv天然提取物的ph值為9.5。

本發(fā)明的女性生殖道健康護(hù)理凝膠的制備方法，包括以下步驟：

步驟1、將抗hcmv天然提取物、抗hcmv卵黃抗體以及皮膚調(diào)理劑、清涼劑依次添加到小分子團(tuán)水中，至完全溶解，混合均勻得到第一混合物；

步驟2、將保濕劑、增稠劑依次加入到步驟1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均勻得到第二混合物；

步驟3、將ph調(diào)節(jié)劑加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康護(hù)理凝膠。

下面以三個(gè)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明女性生殖道健康護(hù)理凝膠的組分、制備方法做進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，按照各個(gè)組分在該女性生殖道健康護(hù)理凝膠中的質(zhì)量百分含量計(jì)，包括：

抗hcmv天然提取物，含量為5％；

小分子團(tuán)水，含量為70％；

抗hcmv卵黃抗體，含量為5％；

保濕劑，含量為10.75％；

皮膚調(diào)理劑，含量為6％；

增稠劑，含量為3％；

ph調(diào)節(jié)劑，含量為0.05％；

清涼劑，含量為0.2％。

本實(shí)施例中的女性生殖道健康護(hù)理凝膠的制備方法如下所示：

步驟1、將含量為5％的抗hcmv天然提取物、含量為5％的抗hcmv卵黃抗體以及含量為6％的皮膚調(diào)理劑、含量為0.2％的清涼劑依次添加到含量為70％的小分子團(tuán)水中，至完全溶解，混合均勻得到第一混合物；

步驟2、將含量為10.75％的保濕劑、含量為3％的增稠劑依次加入到步驟1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均勻得到第二混合物；

步驟3、將含量為0.05％的ph調(diào)節(jié)劑加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康護(hù)理凝膠。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，按照各個(gè)組分在該女性生殖道健康護(hù)理凝膠中的質(zhì)量百分含量計(jì)，包括：

抗hcmv天然提取物，含量為18.83％；

小分子團(tuán)水，含量為30％；

抗hcmv卵黃抗體，含量為20％；

保濕劑，含量為20％；

皮膚調(diào)理劑，含量為9％；

增稠劑，含量為2％；

ph調(diào)節(jié)劑，含量為0.15％；

清涼劑，含量為0.02％。

本實(shí)施例中的女性生殖道健康護(hù)理凝膠的制備方法如下所示：

步驟1、將含量為18.83％的抗hcmv天然提取物、含量為20％的抗hcmv卵黃抗體以及含量為9％的皮膚調(diào)理劑、含量為0.02％的清涼劑依次添加到含量為30％的小分子團(tuán)水中，至完全溶解，混合均勻得到第一混合物；

步驟2、將含量為20％的保濕劑、含量為2％的增稠劑依次加入到步驟1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均勻得到第二混合物；

步驟3、將含量為0.15％的ph調(diào)節(jié)劑加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康護(hù)理凝膠。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中的女性生殖道健康護(hù)理凝膠，按照各個(gè)組分在該女性生殖道健康護(hù)理凝膠中的質(zhì)量百分含量計(jì)，包括：

抗hcmv天然提取物，含量為20％；

小分子團(tuán)水，含量為48％；

抗hcmv卵黃抗體，含量為15％；

保濕劑，含量為8％；

皮膚調(diào)理劑，含量為7.8％；

增稠劑，含量為1％；

ph調(diào)節(jié)劑，含量為0.1％；

清涼劑，含量為0.1％。

本實(shí)施例中的女性生殖道健康護(hù)理凝膠的制備方法如下所示：

步驟1、將含量為20％的抗hcmv天然提取物、含量為15％的抗hcmv卵黃抗體以及含量為7.8％的皮膚調(diào)理劑、含量為0.1％的清涼劑依次添加到含量為48％的小分子團(tuán)水中，至完全溶解，混合均勻得到第一混合物；

步驟2、將含量為8％的保濕劑、含量為1％的增稠劑依次加入到步驟1中的第一混合物中，使其完全溶解，混合均勻得到第二混合物；

步驟3、將含量為0.1％的ph調(diào)節(jié)劑加入到第二混合物中，得到所述女性生殖道健康護(hù)理凝膠。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。