本領(lǐng)域涉及天然產(chǎn)物深加工技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法。
背景技術(shù)：
藻藍(lán)蛋白(又稱藻藍(lán)素，簡(jiǎn)稱pc)是從螺旋藻中分離出來(lái)的一種深藍(lán)色粉末，色澤美觀。它是一類稀有的光合作用色素蛋白，氨基酸組成齊全，是藻類中特有的捕光色素蛋白。pc具有抗輻射、抗氧化、抗腫瘤以及無(wú)毒副作用等優(yōu)勢(shì)，在食品保健、藥物治療、化妝品以及熒光探針方面具有廣泛的應(yīng)用。
藻藍(lán)蛋白是一種天然藍(lán)色色素，已作為食物色素添加在軟飲料，雙水相萃取是生物物質(zhì)分離純化中一種有效且有價(jià)值的方法，近年來(lái)得到了人們廣泛的關(guān)注，已經(jīng)應(yīng)用于蛋白質(zhì)、酶、天然物質(zhì)等的純化過程中，常用的是peg/無(wú)機(jī)鹽體系。其體系含水量高、溫和且無(wú)毒，可以有效地保證生物分子的活性。與其他分離方法(如離子交換層析、凝膠過濾層析等)相比，雙水相萃取具有分離時(shí)間短、萃取效率高、污染少等優(yōu)勢(shì)。
目前，缺乏一種分離效果好的甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種分離效果好，過濾分離回收率高的甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的一種甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟：
(1)制備藻藍(lán)蛋白粗提取液：用去離子水清洗新鮮的螺旋藻2-4次，洗滌干凈的螺旋藻，經(jīng)壓力為210-420kg/cm2的高壓細(xì)胞勻漿機(jī)，破碎時(shí)間為5-6min，超聲波處理時(shí)間為12-14min，將破碎的螺旋藻懸濁液于離心機(jī)中，離心時(shí)間為10-18min，離心收集上清液，制得含藻藍(lán)蛋白的粗提液于4-5℃下儲(chǔ)存；
(2)雙水相萃?。合虿襟E(1)所得含藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入甲基纖維素和檸檬酸三鈉，震蕩混合時(shí)間為1-2h，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相；
(3)采用膜孔徑為3-5um的濾膜對(duì)藻藍(lán)蛋白粗提液進(jìn)行粗過濾，處理時(shí)間為20-26小時(shí)，再于-10--12℃冷凍干燥10-12小時(shí)，制得雙水相萃取藻藍(lán)蛋白。
進(jìn)一步地，在步驟(1)中，所述離心速率為800-1000r/min。
進(jìn)一步地，在步驟(2)中，所述甲基纖維素的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的9-13％。
更進(jìn)一步地，在步驟(2)中，所述檸檬酸三鈉為雙水相體系總質(zhì)量的16-25％。
進(jìn)一步地，在步驟(2)中，含藻藍(lán)蛋白的粗提液的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的70-75％。
進(jìn)一步地，在步驟(3)中，所述濾膜的流速為150ml/min，滲透通量為60l/(h·m2)。
有益效果：本發(fā)明分離效果好，體系粘度較低，分相所需時(shí)間短，節(jié)約了時(shí)間又減小了能耗。過濾分離回收率高，產(chǎn)品質(zhì)量高，運(yùn)行成本低；過程無(wú)需添加化學(xué)藥品、溶媒溶劑，不帶入二次污染物質(zhì)；設(shè)備可自動(dòng)運(yùn)行，穩(wěn)定性好，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化需求。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
(1)本發(fā)明的雙水相體系用于萃取螺旋藻細(xì)胞破碎液中藻藍(lán)蛋白,經(jīng)一次萃取藻藍(lán)蛋白收率可達(dá)90.6％，分配系數(shù)達(dá)到8.03，分離因數(shù)達(dá)到6.5。結(jié)果證實(shí)螺旋藻藻藍(lán)蛋白在該體系中的分配系數(shù)和分離因數(shù)均較高。
(2)多次雙水相萃取有利于c-pc純度提高，三次雙水萃取后，c-pc純度為3.92，回收率為87.7％。繼續(xù)增加萃取的次數(shù)，純度不斷增加。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例是本發(fā)明的闡釋和舉例，并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
本發(fā)明的一種甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟：
(1)制備藻藍(lán)蛋白粗提取液：用去離子水清洗新鮮的螺旋藻2次，洗滌干凈的螺旋藻，經(jīng)壓力為210kg/cm2的高壓細(xì)胞勻漿機(jī)破碎5min,超聲波處理時(shí)間為14min,將破碎的螺旋藻懸濁液于離心機(jī)中離心時(shí)間為15min，離心收集上清液，制得含藻藍(lán)蛋白的粗提液于4℃下儲(chǔ)存；所述攪拌轉(zhuǎn)速為800r/min。
(2)雙水相萃?。合虿襟E(1)所得含藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入甲基纖維素和檸檬酸三鈉，徹底攪拌1h，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相；所述甲基纖維素的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的9％。檸檬酸三鈉為雙水相體系總質(zhì)量的16％。含藻藍(lán)蛋白的粗提液的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的68％。
(3)采用膜孔徑為3um的濾膜對(duì)藻藍(lán)蛋白粗提液進(jìn)行粗過濾，處理時(shí)間為20小時(shí)，再于-12℃冷凍干燥10小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末。
藻藍(lán)蛋白溶液在280nm和620nm處有最大吸收波長(zhǎng)，螺旋藻蛋白在280nm處有最大吸收峰，藻藍(lán)蛋白在620nm處有最大吸收峰，凍融破壁后螺旋藻溶液中藻藍(lán)蛋白純度為0.4，其中螺旋藻雜蛋白含量較多。
實(shí)施例2
實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于：本發(fā)明的一種甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟：
(1)制備藻藍(lán)蛋白粗提取液：用去離子水清洗新鮮的螺旋藻3次，洗滌干凈的螺旋藻經(jīng)壓力為300kg/cm2的高壓細(xì)胞勻漿機(jī)破碎5.5min,超聲波處理時(shí)間為12min,將破碎的螺旋藻懸濁液于離心機(jī)中離心時(shí)間為10min，離心收集上清液，制得含藻藍(lán)蛋白的粗提液于5℃下儲(chǔ)存；所述攪拌轉(zhuǎn)速為900r/min。
(2)雙水相萃?。合虿襟E(1)所得含藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入甲基纖維素和檸檬酸三鈉，徹底攪拌2h，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相；所述甲基纖維素的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的10％。檸檬酸三鈉為雙水相體系總質(zhì)量的21％。含藻藍(lán)蛋白的粗提液的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的70％。
(3)采用膜孔徑為4um的濾膜對(duì)藻藍(lán)蛋白粗提液進(jìn)行粗過濾，處理時(shí)間為24小時(shí)，再于-11℃冷凍干燥11小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末。
實(shí)施例3
實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于：本發(fā)明的一種甲基纖維素和檸檬酸三鈉雙水相萃取分離藻藍(lán)蛋白的方法，包括如下步驟：
(1)制備藻藍(lán)蛋白粗提取液：用去離子水清洗新鮮的螺旋藻4次，洗滌干凈的螺旋藻經(jīng)壓力為420kg/cm2的高壓細(xì)胞勻漿機(jī)破碎6min，超聲波處理時(shí)間為14min,將破碎的螺旋藻懸濁液于離心機(jī)中離心時(shí)間為18min，離心收集上清液，制得含藻藍(lán)蛋白的粗提液于4.5℃下儲(chǔ)存；所述攪拌轉(zhuǎn)速為1000r/min。
(2)雙水相萃取：向步驟(1)所得含藻藍(lán)蛋白的粗提液中加入甲基纖維素和檸檬酸三鈉，徹底攪拌1.5h，靜置分相，藻藍(lán)蛋白富集于上相；所述甲基纖維素的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的13％。檸檬酸三鈉為雙水相體系總質(zhì)量的25％。含藻藍(lán)蛋白的粗提液的質(zhì)量為雙水相體系總質(zhì)量的65％。
(3)采用膜孔徑為5um的濾膜對(duì)藻藍(lán)蛋白粗提液進(jìn)行粗過濾，處理時(shí)間為26小時(shí)，再于-10℃冷凍干燥12小時(shí)得藻藍(lán)蛋白粉末。所述濾膜的流速為150ml/min，滲透通量為60l/(h·m2)。
試驗(yàn)1
檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)c－pc分配影響
檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)c－pc分配影響如表1所示，
表1
由表1所示，當(dāng)甲基纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16％，ph值為6.2，室溫條件下，當(dāng)檸檬酸三鈉低于某一用量時(shí)不能形成雙水相體系，隨著檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，相比值逐漸減小，分配系數(shù)、純度和回收率逐漸增大。當(dāng)檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21％時(shí)，c－pc的分配系數(shù)、純度和收率最高，然后逐漸減小。造成這種現(xiàn)象的原因可能是，檸檬酸三鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，下相的鹽析作用增加，使c－pc由下相向上相遷移。但檸檬酸三鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，下相鹽析作用過強(qiáng)，破壞c－pc表面的水化層，c－pc被部分或全部析出。再者，在甲基纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變的情況下，隨著檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)的提高，雙水相體系逐漸遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，物質(zhì)在兩相中界面張力增大，有利于藻藍(lán)蛋白在上相富集，多糖在下相富集；當(dāng)檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)更大時(shí)，上相體積逐漸減小，上相體積逐漸減小，同時(shí)粘度逐漸增大，不利于藻藍(lán)蛋白的在上相的富集。c－pc的遷移能力受到限制，不利于c－pc的富集。
由表1所示，16％-21％檸檬酸三鈉析得到的藻藍(lán)蛋白純度較低，21％-25％檸檬酸三鈉析出藻藍(lán)蛋白，藻藍(lán)蛋白純度逐漸增加，大于25％飽和度檸檬酸三鈉鹽析藻藍(lán)蛋白純度變化不大。確定：16％-25％之間的檸檬酸三鈉飽和度可以用來(lái)除去大量螺旋藻雜蛋白，大于25％飽和度的檸檬酸三鈉用于沉淀藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)蛋白的富集純化。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。