本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及具有免疫活性功能的源于血紅蛋白的活性多肽，包含活性多肽的組合物或制劑以及活性多肽、含有活性多肽的組合物或制劑在制備用于治療免疫疾病、癌癥和/或乙型肝炎等疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

胎盤(placenta)是哺乳動物妊娠期間由胚胎的胚膜和母體子宮內(nèi)膜聯(lián)合長成的母子間交換物質(zhì)的過渡性器官。胎盤由羊膜(amnioticmembrane)、葉狀絨毛膜(chorionfrondosum)和底蛻膜構(gòu)成。

人胎盤的成分較復(fù)雜。還含有干擾素(interferon)，有抑制多種病毒對人細(xì)胞的作用，含有巨球蛋白稱β抑制因子(β-inhibitor)能抑制流感病毒。胎盤中含有與血液凝固有關(guān)的成分，有類似凝血因子?的纖維蛋白穩(wěn)定因子；尿激酶抑制和纖維蛋白溶酶原活化物。通常情況下纖維蛋白深酶原活化物的作用遠(yuǎn)低于抑制物。人胎盤中還含有許多激素及促腎上腺皮質(zhì)激素。人胎盤中還含有多種有應(yīng)用價值的酶。此外，尚含有紅細(xì)胞生成素，磷脂(phospholipid)，β-內(nèi)啡肽(β-endorphin)，氨基多糖體(系由8分子乙酰氨葡萄糖、6分子甘露糖所組成)。胎盤乳原(多肽化合物)含多種氨基酸，并含微量維生素b12，乙酰膽堿及碘等。

已經(jīng)對胎盤成分進行了研究和利用，如彭立義等報道了胎盤免疫調(diào)節(jié)肽及其應(yīng)用。胎盤免疫調(diào)節(jié)肽是一種可透析、可超濾的多肽,含有16種氨基酸，分子量為6000以下。胎盤免疫調(diào)節(jié)肽對balb/c小鼠具有促進生長、發(fā)育的功能；可使95.2％的pha皮試陰性者轉(zhuǎn)陽；使因溫育37℃而降低的玫瑰花結(jié)形成率恢復(fù)至活性花結(jié)水平；同時經(jīng)164例臨床應(yīng)用研究證明,胎盤免疫調(diào)節(jié)肽可不同程度地提高患者的細(xì)胞免疫功能。(彭立義等：胎盤免疫調(diào)節(jié)肽的鑒定與臨床應(yīng)用；新藥與臨床：1990年03期)。

韓國延世大學(xué)的hyoung-joolee等人利用正常人和先兆性子癇病人的胎盤組織作為研究對象，用蛋白組學(xué)的分析方法，對人胎盤組織中的蛋白質(zhì)和多肽做了分析，結(jié)果鑒定了人胎盤組織中的4239種獨特蛋白質(zhì)，219種獨特的n-末端鏈接的糖肽，592種獨特的磷酸肽(phosphopeptides)，66種13號染色體特異的蛋白質(zhì)。其中，28種蛋白質(zhì)顯示為差異表達(dá)的先兆性子癇特異性蛋白質(zhì)。(leehjetal:comprehensivegenome-wideproteomicanalysisofhumanplacentaltissueforthechromosome-centrichumanproteomeproject.jproteomeres.2013feb14)。但這些特異性蛋白質(zhì)和多肽的生物學(xué)效用還有待進一步研究。

濟南軍區(qū)肝病研究所張光曙教授所領(lǐng)導(dǎo)和主持的研究小組，通過三十年的臨床研究發(fā)現(xiàn)利用乙肝病毒表面抗原陰性、乙肝病毒表面抗原抗體陽性的人胎盤作為轉(zhuǎn)移因子和核糖核酸制備的材料，制備分子量在8000以下的胎盤轉(zhuǎn)移因子，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)移因子來治療慢性乙型肝炎，以及與乙肝病毒感染相關(guān)的肝硬化和肝癌獲得相當(dāng)好的臨床療效。同時，用于丙型肝炎(115例)也有治療效果，對癌癥病人免疫系統(tǒng)的增強作用十分明顯。

目前對于轉(zhuǎn)移因子的研究主要集中于含有特異免疫活性的乙肝人體胎盤轉(zhuǎn)移因子的胎盤提取物的制備及其治療效果。例如，cn1579536a公開了一種抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子注射液的制備方法；cn1299763c公開了一種抗乙肝人體胎盤轉(zhuǎn)移因子粉針劑的制備方法；cn1554363a公開了一種具有特異免疫活性的抗乙肝胎盤特異因子提取物及其制備工藝。但是這些專利都沒有對于其中的活性成分及其作用進行研究。

血紅蛋白的主要功能是在血液中結(jié)合并轉(zhuǎn)運氧，但血紅蛋白的功能不僅僅是運輸氧。achally等于1971年的研究報道了血紅蛋白的酶消化產(chǎn)物具有生長激素釋放活性(andrewv.schally等，j.bio.chem.，1971；246:6647-6650)，之后的研究表明血紅蛋白生物活性肽具有多種重要的功能活性，如阿片樣活性(brantlv等，eurjpharmacol1986；125:309-10；lignotb等，biotechnolapplbiochem1999，30:201-7)、抗氧化活性(cn101298470a)、增強血管舒緩激肽活性(piotjm等，febslett1992，299：75-79)、抗菌活性(fogacaac等，j.bio.chem.，1999；274:2530-2534；parishca等人，bioorg.med.chem.2001，9：377)等。此外，liepkec等人的研究發(fā)現(xiàn)，從人胎盤肽庫純化的血紅蛋白來源的肽顯示出抗菌活性，首次證明了天然加工的人血紅蛋白片段的抗菌活性(cornelialiepke等，j.bio.chem.，2003；791:345-356)；sahad等人的實驗則表明nf-kb在血紅蛋白α亞基啟動子中發(fā)揮作用，指示血紅蛋白α和血紅蛋白β亞基可以充當(dāng)炎癥和感染的內(nèi)源性抗菌防御蛋白質(zhì)(sahad等，plosone，2017；12(2)：e0171084)。但這些研究均沒有公開血紅蛋白活性肽的免疫刺激活性及其在疾病治療中的用途。

而國內(nèi)對血紅蛋白肽的研究則集中于不同哺乳動物血紅蛋白肽組合物及其制備，如cn101366943a、cn101744092a、cn101194665a、cn1004395c、cn101298470a、cn103230587a等。

目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)血紅蛋白免疫活性肽的免疫刺激活性和用途的報道。

本發(fā)明利用蛋白組學(xué)的方法研究抗乙肝轉(zhuǎn)移因子，從其中的主要成分分離獲得(血紅蛋白)多肽片段，并進行氨基酸序列分析、多肽合成，免疫性實驗研究。發(fā)現(xiàn)這些血紅蛋白多肽片段對病人體內(nèi)非特異性和特異性免疫具有調(diào)節(jié)作用，可以用作免疫調(diào)節(jié)劑，是治療或輔助治療免疫疾病、哮喘、肝炎例如乙型肝炎、癌癥、或其他相關(guān)的疾病的活性成分組成部分。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

公開內(nèi)容

本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有免疫活性的源于血紅蛋白的多肽。

本發(fā)明的另一目標(biāo)為提供利用蛋白組學(xué)的方法從抗乙肝轉(zhuǎn)移因子中分離(血紅蛋白)多肽片段的方法。

本發(fā)明的另一目標(biāo)為提供通過該方法鑒定的源于血紅蛋白的活性多肽。

本發(fā)明的又一目標(biāo)為提供源于血紅蛋白的活性多肽的應(yīng)用。

技術(shù)方案

本發(fā)明涉及利用蛋白組學(xué)的方法對從乙肝轉(zhuǎn)移因子中分離得到的有效多肽(活性多肽)的分析和發(fā)現(xiàn)，對乙肝轉(zhuǎn)移因子中的多肽進行氨基酸序列分析。發(fā)現(xiàn)這些活性多肽對病人體內(nèi)非特異性和特異性免疫具有調(diào)節(jié)作用，可以用作免疫調(diào)節(jié)劑，可用于治療或輔助治療免疫疾病、肝炎例如乙型肝炎、癌癥疾病、哮喘或其他相關(guān)的疾病。

在用于實現(xiàn)上述目標(biāo)的一個方面，本發(fā)明提供利用蛋白組學(xué)的方法從抗乙肝轉(zhuǎn)移因子中分離的源于血紅蛋白的活性多肽。

根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽的特征在于，其對病人體內(nèi)非特異性和特異性免疫具有調(diào)節(jié)作用，可以用作免疫調(diào)節(jié)劑。具體地，源于血紅蛋白的活性多肽都具有免疫活性，可以促進單個核細(xì)胞例如巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和提高巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能。

根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽衍生自人血紅蛋白α、β鏈，具有免疫調(diào)節(jié)作用，例如激活免疫細(xì)胞的功能。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽包括選自如下氨基酸序列：

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽是選自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在一個實施方式中，所述免疫細(xì)胞包括單個核細(xì)胞。

在一個實施方式中，單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。

在一個實施方式中，單個核細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞。

在一個實施方式中，激活免疫細(xì)胞的功能包括促進單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和提高巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能。

在用于實現(xiàn)上述目標(biāo)的另一方面，本發(fā)明提供組合物，其包括根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物還進一步包括藥學(xué)上可接受的載體。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽包括選自如下的氨基酸序列：

與seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列；

與seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列；

與seqidno:3的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列；

與seqidno:4的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列；

與seqidno:5的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽包括選自如下氨基酸序列：

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)。。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽是選自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的組合物進一步藥學(xué)上可接受的載體。

在用于實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，本發(fā)明提供制劑，所述制劑通過如下方法制備，所述方法包括：

1)將新鮮胎盤直接放入無菌0～4℃的保溫容器中，之后將胎盤裝入真空包裝內(nèi)并在低溫(低于-18℃)的條件下保存，例如，在液氮中或在-70℃下保存，優(yōu)選地，在-22℃至-18℃下保存；

2)將以上保存的胎盤20～30℃解凍，加入0.05-0.5％氯化鈉水溶液并均質(zhì)以獲得勻漿；

3)將以上獲得的勻漿于0～10℃恒溫條件下進行有效成分浸提0.5-5小時，再將勻漿升溫至55℃～65℃，連續(xù)均勻水浴5～15小時，完成病毒滅活，然后將勻漿冷卻至10℃以下；

4)將以上獲得的勻漿在溫度為4℃～10℃、轉(zhuǎn)速為3000～12000r/min的條件下離心30～100分鐘，獲得上清液；和

5)將以上獲得的上清液進行超濾處理，獲得所述含有抗乙肝胎盤轉(zhuǎn)移因子的生物制劑。

在一個實施方式中，制備根據(jù)本發(fā)明的制劑的方法還包括：

6)將獲得的提取物用生理鹽水或注射用水調(diào)配，然后經(jīng)過0.22μm孔徑的濾芯/濾膜除菌，獲得注射液半成品，和任選地：

7)將以上獲得的注射液半成品配制成注射液或制成凍干粉針劑。

在一個實施方式中，所述胎盤是人胎盤，優(yōu)選乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)陽性，乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體均為陰性的人胎盤。

在進一步的實施方式中，在上述步驟5)中的超濾處理是如下進行：將上清液經(jīng)截留分子量為80～200kd的中空超濾纖維柱超濾，所得濾液再用截留分子量為5～20kd(優(yōu)選10kd)的中空超濾纖維柱超濾，收集濾液。

在一個實施方式中，濾液包括分子量小于10kd的物質(zhì)，例如，包括但不限于核酸、多肽等。

在一個實施方式中，胎盤裝入真空包裝內(nèi)并且優(yōu)選地在約-20℃的條件下保存。

在一個實施方式中，氯化鈉水溶液的濃度優(yōu)選為約0.1％。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑為注射液或凍干粉針劑形式。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑其包括根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑含有一種或多種選自以下的多肽：與seqidno:1的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

與seqidno:2的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

與seqidno:3的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

與seqidno:4的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽；

與seqidno:5的氨基酸序列具有至少80％同一性，更優(yōu)選地，至少85％同一性，至少90％同一性，以及最優(yōu)選地，至少95％同一性的氨基酸序列的多肽。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑含有一種或多種選自以下的多肽：

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽是選自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑含有本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽和藥學(xué)上可接受的載體。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑還含有另外的制劑，例如增強免疫的藥物。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑還含有另外的制劑，例如用于治療乙型肝炎的藥物，如拉米夫定。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制劑還含有另外的制劑，例如用于治療癌癥的藥物。

在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽包括選自如下氨基酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、或seqidno:5。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽可以用作免疫調(diào)節(jié)劑。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽可以用于制備促進單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和提高巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的組合物可以用于制備促進單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和提高巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的制劑可以用于制備促進單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和提高巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽可以用于制備治療或輔助治療炎癥或感染的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的組合物可以用于制備治療或輔助治療炎癥或感染的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的制劑可以用于制備治療或輔助治療炎癥或感染的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽可以用于制備治療或輔助免疫疾病的疾病的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以用于制備治療或輔助免疫疾病的疾病的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的制劑可以用于制備治療或輔助免疫疾病的疾病的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽可以用于制備治療或輔助治療癌癥的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以用于制備治療或輔助治療癌癥的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的制劑可以用于制備治療或輔助治療癌癥的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽可以用于制備治療或輔助治療乙型肝炎的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的組合物可以用于制備治療或輔助治療乙型肝炎的藥物。

在實現(xiàn)上述目標(biāo)的又一方面，根據(jù)本發(fā)明的制劑可以用于制備治療或輔助治療乙型肝炎的藥物。

在一個實施方式中，免疫疾病的疾病包括免疫力低下的狀況，例如包括但不限于，癌癥、哮喘。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽在單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子和提高巨噬細(xì)胞的抗原遞呈功能方面效果顯著。具體地，源于血紅蛋白的活性多肽能夠顯著刺激單個核細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞)中il-2、il-6、il-17、hlaii的表達(dá)，表明本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽能提高巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能，并促進單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子。

附圖說明

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制劑中免疫活性多肽的指紋圖譜(lcms/ms)，其中的2個主峰包括本發(fā)明的活性多肽α1、α2、β1、β2和β3；

圖2-1至圖2-6顯示根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的生物制劑中免疫活性多肽的指紋圖譜(lcms/ms)，其中圖2-1標(biāo)出的5個峰顯示本發(fā)明的活性多肽α1、α2、β1、β2和β3，并且圖2-2至圖2-6分別具體顯示了多肽α1、α2、β1、β2和β3各自的質(zhì)譜圖；

圖3顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨作用于pbmc細(xì)胞48h后il-10的表達(dá)量，其中，與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著；

圖4顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2肽單獨作用于pbmc細(xì)胞48h后il-2的表達(dá)量；

圖5顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨作用于pbmc細(xì)胞48h后il-6的表達(dá)量，其中，與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖6顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨作用于pbmc細(xì)胞48h后tnf-α的表達(dá)量

圖7為顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨作用于pbmc細(xì)胞48h后il-1β的表達(dá)量，其中與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖8顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后il-10的表達(dá)量；

圖9顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后il-2的表達(dá)量；

圖10顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2肽單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后tnf-α的表達(dá)量；

圖11顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后il-6的表達(dá)量，其中，與pha組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖12顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后il-1β的表達(dá)量，其中，與pha組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖13顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后il-4的表達(dá)量；

圖14顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨與pha同時作用于pbmc細(xì)胞48h后il-17a的表達(dá)量，其中，與pha組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖15顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2作用48h，cd4、cd8表達(dá)水平；

圖16顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2作用72h，cd4、cd8表達(dá)水平；

圖17顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨或作用于thp-1細(xì)胞48h后cd86的表達(dá)量；

圖18顯示本發(fā)明的源于血紅蛋白的活性多肽α1、α2單獨或作用于thp-1細(xì)胞48h后hlaii的表達(dá)量，其中，與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖19顯示三種肽單獨作用于外周血單個核細(xì)胞il-17a的表達(dá)水平，其中與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖20顯示三種肽單獨作用于外周血單個核細(xì)胞ifn-γ的表達(dá)水平；

圖21顯示三種肽單獨作用于外周血單個核細(xì)胞tnf-α的表達(dá)水平；

圖22顯示三種肽單獨作用于外周血單個核細(xì)胞il-2的表達(dá)水平；

圖23顯示三種肽單獨作用于外周血單個核細(xì)胞il-6的表達(dá)水平；

圖24顯示.三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞il-17a的表達(dá)水平，其中，與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖25顯示三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞il-6的表達(dá)水平，其中，與對照組比較，*表示“p<0.05，差異顯著”，**表示“p<0.01，差異極顯著”；

圖26顯示三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞il-2的表達(dá)水平；

圖27顯示三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞ifn-γ的表達(dá)水平；

圖28顯示三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞il-10的表達(dá)水平；

圖29顯示三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞il-4的表達(dá)水平；

圖30顯示三種肽與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞tnf-α的表達(dá)水平；

圖31顯示三種肽單獨作用于單個核細(xì)胞后，cd4⁺t細(xì)胞和cd8⁺t細(xì)胞的百分含量；

圖32顯示三種肽與pha共同作用于單個核細(xì)胞后，cd4⁺t細(xì)胞和cd8⁺t細(xì)胞的百分含量；

圖33顯示thp-1細(xì)胞經(jīng)三種肽刺激后il-1β的表達(dá)水平；

圖34顯示thp-1細(xì)胞經(jīng)三種肽刺激后tnf-α的表達(dá)水平；

圖35顯示thp-1細(xì)胞表面cd86的表達(dá)水平；

圖36顯示thp-1細(xì)胞表面hlaii類分子的表達(dá)水平。

具體實施方式

實施例

下文中，本發(fā)明將參考實施例來更詳細(xì)描述。以下實施例是對發(fā)明的進一步說明，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是，這些實施例和說明僅用于說明性目的，并不構(gòu)成對本發(fā)明實質(zhì)內(nèi)容的限制。

在沒有進一步詳細(xì)說明的情況下，本文引述的全部公開物通過引用將它們的全部結(jié)合在此。

下列實施例中使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均為商業(yè)可得。

一、人胎盤材料的獲得：

產(chǎn)婦體檢標(biāo)準(zhǔn)：病人血清學(xué)檢測，乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)抗體檢查陽性；乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體均為陰性結(jié)果的病人。

人胎盤組織的檢測標(biāo)準(zhǔn)：人胎盤組織檢測，乙型肝炎病毒表面抗原(hbsag)抗體檢查陽性；乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體均為陰性結(jié)果的胎盤材料。

凡患有惡性腫瘤、免疫缺陷病、急性傳染病、人工流產(chǎn)、死胎、各種畸形兒及肉眼檢查外觀不正常、保存運輸不當(dāng)而變質(zhì)者均不得使用。

人胎盤材料的獲取、運輸和儲存：將新鮮人胎盤從無菌的接生或手術(shù)領(lǐng)域，直接放入無菌低溫(0℃-4℃)的保溫容器中，在低溫的條件下運輸至gmp車間或glp實驗室；在無菌條件下，將胎盤的附屬結(jié)構(gòu)去除，即除筋膜、臍帶、胎盤組織的母體面等；留下胎盤組織，用注射用水沖洗、瀝干、剪碎、稱重，置無菌容器內(nèi)，專門的儲存低溫冰箱中(-20℃)。

1、乙肝轉(zhuǎn)移因子的制備

(1)人胎盤材料的預(yù)處理

產(chǎn)婦體檢標(biāo)準(zhǔn)：病人血清學(xué)檢測，乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)陽性；乙型肝炎病毒hbsag，hbeag，hbeab，hbcab、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體(梅毒、淋病等)均為陰性結(jié)果的病人。

選用乙型肝炎病毒表面抗體(hbsab)陽性，乙型肝炎病毒(hbsag，hbeag，hbeab，hbcab)、丙型肝炎病毒(hcv)、艾滋病毒(hiv)、性病病原體均為陰性的胎盤。且患有惡性腫瘤、免疫缺陷病、急性傳染病、人工流產(chǎn)、死胎、各種畸形兒及肉眼檢查外觀不正常、保存運輸不當(dāng)而變質(zhì)者均不得使用。

凡患有惡性腫瘤、免疫缺陷病、急性傳染病、人工流產(chǎn)、死胎、各種畸形兒及肉眼檢查外觀不正常、保存運輸不當(dāng)而變質(zhì)者均不得使用。

將新鮮人胎盤從無菌手術(shù)室獲得后，直接放入無菌低溫(0℃-4℃)的保溫容器中，并在低溫的條件下存儲和運輸。

在無菌條件下，去除胎盤附屬結(jié)構(gòu)(臍帶、羊膜)所得胎盤組織用注射用水沖洗、瀝干，切成小塊(約1cm²)，置無菌容器內(nèi)，低溫(-20℃)存儲。

(2)勻漿調(diào)配

取上述冷凍的胎盤組織塊，于20-30℃條件下復(fù)溫，隨后加入含有0.1mol/l(約0.6％)的氯化鈉的注射用水，胎盤：鹽水(w/w)＝1：(2～4)。在溫度為4～10℃的條件下，將混合物在膠體磨中均質(zhì)10～15min。在高倍顯微鏡(1000倍)下觀察，觀察不到完整的細(xì)胞。

(3)有效成分的提取和病毒的滅活處理

將上述勻漿于10℃恒溫條件下，浸提有效成分1h。

之后再將勻漿置于55℃～65℃，連續(xù)均勻水浴10小時，完成病毒滅活。滅活后的勻漿冷卻至10℃以下。

(4)離心處理

將勻漿轉(zhuǎn)移至離心容器中，在溫度為4℃～10℃、轉(zhuǎn)速為3000-12000rpm的條件下離心30～100分鐘，收集并調(diào)節(jié)上清液ph在6.5～7.5之間。

(5)超濾處理

將上清液經(jīng)80～200kd的中空超濾纖維柱超濾，濾液再用5～20kd的中空超濾纖維柱超濾，收集濾液，該濾液即抗乙肝轉(zhuǎn)移因子原液。

(6)除菌處理

將所得原液用生理鹽水或注射用水稀釋調(diào)配后(多肽>0.5mg/ml)，經(jīng)過0.22μm的除菌濾芯過濾，獲得抗乙肝轉(zhuǎn)移因子半成品。

(7)注射劑的制備

將半成品用2倍生理鹽水稀釋，使溶液中多肽的含量達(dá)到0.5mg/ml，進一步分裝得液體針劑或粉針劑。

二、抗乙肝轉(zhuǎn)移因子中源于血紅蛋白的活性多肽的獲得和分析

樣品經(jīng)過上述多肽分離提取之后，制劑成為注射液或粉針劑，樣品分析按照lcms/ms常規(guī)的氨基酸分析技術(shù)，由美國prottech公司(prottech，inc.)實施。nanollcms/ms技術(shù)參考jwu,xluo,ljyan的文獻(xiàn)：twodimensionalbluenative/sds-pagetoidentifymitochondrialcomplexisubunitsmodifiedby4-hydroxynonenal(hne).frontiersinphysiology,2015。高效液相色譜柱用75mm內(nèi)徑的反相c18柱；數(shù)據(jù)分析采用prottech公司的數(shù)據(jù)分析方法。按照樣品經(jīng)過分離獲得的指紋圖譜，將含量最高的主要峰段進行氨基酸序列分析，獲得2個主峰的氨基酸序列(圖1)。進一步對多肽的來源進行分析，發(fā)現(xiàn)這些多肽來源于血紅蛋白。確定本發(fā)明中的5個多肽的氨基酸序列，再經(jīng)過對質(zhì)譜中的多肽序列與人血紅蛋白序列比對，結(jié)果顯示其中的2個多肽來源于人血紅蛋白α亞基，另外3個多肽來源于人血紅蛋白β亞基。具體的序列比對結(jié)果如下。

與人血紅蛋白α亞基氨基酸序列的比對:

mvlspadktnvkaawgkvgahageygaealermflsfpttktyfphfdlshgsaqvkghgkkvadaltnavahvddmpnalsalsdlhahklrvdpvnfkllshcllvtlaahlpaeftpavhasldkflasvstvltskyr(seqidno:7)；

與人血紅蛋白β亞基氨基酸序列的比對：

mvhltpeeksavtalwgkvnvdevggealgrllvvypwtqrffesfgdlstpdavmgnpkvkahgkkvlgafsdglahldnlkgtfatlselhcdklhvdpenfrllgnvlvcvlahhfgkeftppvqaayqkvvagvanalahkyh(seqidno:8)。

如下面詳細(xì)描述的，經(jīng)過對這些多肽的活性進行研究，證實了這些多肽對人外周血細(xì)胞具有免疫刺激活性。

三、血紅蛋白活性多肽的合成

1、實驗組多肽設(shè)計

1.1血紅蛋白α亞基多肽的合成，從基因庫中獲取血紅蛋白α亞基的全氨基酸序列。見sp|p69905|hba_humanhemoglobinsubunitalphaos＝homosapiensgn＝hba1pe＝1sv＝2。序列為：

mvlspadktnvkaawgkvgahageygaealermflsfpttktyfphfdlshgsaqvkghgkkvadaltnavahvddmpnalsalsdlhahklrvdpvnfkllshcllvtlaahlpaeftpavhasldkflasvstvltskyr(seqidno:7)。根據(jù)上述比對結(jié)果，獲得以下兩段多肽。

α1：ageygaealermfl(14aa)(seqidno:1)

α2：adaltnavahvddmpnalsalsd(23aa)(seqidno:2)

1.2血紅蛋白beta亞基多肽的合成，從基因庫中獲取血紅蛋白beta亞基的全氨基酸序列。見sp|p68871|hbb_humanhemoglobinsubunitbetaos＝homosapiensgn＝hbbpe＝1sv＝2。序列為：

mvhltpeeksavtalwgkvnvdevggealgrllvvypwtqrffesfgdlstpdavmgnpkvkahgkkvlgafsdglahldnlkgtfatlselhcdklhvdpenfrllgnvlvcvlahhfgkeftppvqaayqkvvagvanalahkyh(seqidno:8)。根據(jù)上述比對結(jié)果，獲得以下三段多肽。

β1：avtalwgkvnvdevggeal(19aa)(seqidno:3)

β2：ypwtqrffesfgdlst(16aa)(seqidno:4)

β3：lahhfgkeftppvqaay(17aa)(seqidno:5)

2、對照組

胸腺是t細(xì)胞發(fā)育分化、成熟的場所，胸腺多肽是胸腺微環(huán)境中的重要成分，在t細(xì)胞的發(fā)育分化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

胸腺五肽:rkdvy(5aa)(seqidno:6)

3、多肽合成

多肽合成采用fmoc固相合成法，使用csbio公司的cs336多肽合成儀，由c端到n端逐步依次將氨基酸連接而成。

四、對合成的活性多肽的免疫學(xué)檢測

1、材料與方法

單個核細(xì)胞(pbmc)來源于健康獻(xiàn)血者外周血。正常人肝素抗凝血經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分離液(比重1.077)密度梯度離心(參見《免疫學(xué)檢驗》，2006年8月第一版)后，取單個核細(xì)胞層，洗滌后用rpmi-1640完全培養(yǎng)基(購自bbi公司)(含10％胎牛血清(購自themofisher公司)，100u/ml青霉素、鏈霉素)重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶個/ml，于37℃5％二氧化碳恒溫孵箱中培養(yǎng)。

巨噬細(xì)胞株thp-1(人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系)購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。thp-1細(xì)胞培養(yǎng)于rpmi-1640完全培養(yǎng)基中，于37℃5％二氧化碳恒溫孵箱中培養(yǎng)傳代。

α1、α2、β1、β2、β3分別代表人工合成的多肽；t5代表胸腺5肽。

2.多肽對細(xì)胞的作用：

分離的pbmc細(xì)胞以1×10⁶個/ml濃度接種于24孔板，分別以5、10、20、40mg/ml的濃度將待測肽加入各孔，其中一組培養(yǎng)48小時后收集細(xì)胞和上清。另一組在加入肽6小時后，再每孔加入pha3μg/ml,共培養(yǎng)48h后收集細(xì)胞和上清。實驗重復(fù)2次，每次雙復(fù)孔。

將擴增好的thp-1細(xì)胞以1×10⁶個/ml濃度接種于12孔板，分別以5、10、20、40mg/ml的終濃度將待測肽加入各孔中，培養(yǎng)24小時后收集細(xì)胞和上清，實驗重復(fù)3次，每次雙復(fù)孔。

3.檢測

收集的單個核細(xì)胞在不同的管中，分別加入抗cd3-apc、cd4-fitc和cd8-pe標(biāo)記抗體，每種抗體20μl，室溫避光孵育30min，離心洗滌后加入500μlpbs，懸起細(xì)胞，避光保存；thp-1細(xì)胞加入hla-dr-apc和cd86-pe標(biāo)記抗體，室溫避光孵育30min，離心洗滌后加入500μlpbs，懸起細(xì)胞，避光保存；用流式細(xì)胞儀進行檢測。

收集上清，按照cba試劑盒說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測il-2、il-6、il-4、il-10、tnf-α、il-17a和il-1β細(xì)胞因子蛋白表達(dá)水平。

4.統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用spss16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。各種細(xì)胞因子在經(jīng)肽刺激后的表達(dá)量的測量數(shù)據(jù)與對照組間的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的單因素方差分析。p<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

五.多肽α1、α2免疫活性檢測結(jié)果及結(jié)果分析

將α1和α2兩種肽作用于人巨噬細(xì)胞株thp-1和外周血單個核細(xì)胞，用流式技術(shù)檢測這些細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子的表達(dá)水平，評價兩種多肽的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，α1在40、80μg/ml的濃度時顯著刺激巨噬細(xì)胞hla-dr分子的表達(dá)，α2在各濃度均刺激hla-dr分子的表達(dá)，以80μg/ml最為顯著。α1和α2單獨刺激單個核細(xì)胞48小時后，炎癥因子il-6、il-1β、tnf-α和il-10表達(dá)均增加，尤以α1在10μg/ml濃度時最為顯著。α1和α2與pha共同刺激外周血單個核細(xì)胞，在48小時顯著促進il-6、il-4和il-17a和il-1β表達(dá)。結(jié)果表明兩種肽能提高巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能，并促進單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子。提示兩種肽對免疫細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用，對臨床免疫治療藥物的開發(fā)具有重要意義，但機制還有待于進一步研究。

兩種多肽α1、α2和對照t5作用于外周血單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞之后的細(xì)胞因子的表達(dá)變化

1.兩種肽單獨作用于單個核細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子結(jié)果：

如圖3所示，兩種肽單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時內(nèi)促進il-10表達(dá)，α1在5μg/ml、10μg/ml濃度時較為顯著，分別達(dá)到7.24±1.35pg/ml、84.17±38.92pg/ml。兩種肽單獨刺激外周血單個核細(xì)胞72h后il-10未檢測出；48和72小時后il-4、ifn-γ和il-17a均未檢測出。

如圖4所示，兩種肽單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-2產(chǎn)生量比對照均有減少。

如圖5所示，兩種肽單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-6產(chǎn)生量明顯增加，α1在5μg/ml、10μg/ml濃度時最為顯著，分別達(dá)到2719±52.76pg/ml、15307±108.42pg/ml；α2在5μg/ml濃度時最為顯著，達(dá)到2719±112.23pg/ml；t5在5μg/ml濃度時最為顯著，達(dá)到3460±238.46pg/ml。

如圖6所示，兩種肽α1、α2單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-1β產(chǎn)生量較對照均有增加，α1在10μg/ml濃度時比對照明顯增加最多，最為顯著；α1在5μg/ml時次之，產(chǎn)生量為70.86±19.68pg/ml。

如圖7所示，兩種肽α1、α2單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-1β產(chǎn)生量明顯增加，α1在10μg/ml濃度時最為顯著，達(dá)到338.46±102.65pg/ml。

2.兩種肽α1、α2與pha同時作用于外周血單個核細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞因子特點：

兩種肽α1、α2與pha同時作用于單個核細(xì)胞48和72小時后，72h后除il-4、ifn-γ和il-17a未檢測出外，其余細(xì)胞因子均產(chǎn)生。

兩種肽α1、α2與pha同時作用于單個核細(xì)胞48和72小時后，與對照組相比il-2、il-10、tnf-α的產(chǎn)生均無顯著差異，見圖8-10。

如圖11所示，兩種肽α1、α2與pha共同刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-6產(chǎn)生量較pha對照組433±32.61pg/ml明顯增加,差異顯著。

如圖12所示，兩種肽α1、α2單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-1β較pha組的515.81±59.68pg/ml產(chǎn)生量明顯增加，α1在40μg/ml濃度時顯著，達(dá)到1087.04±97.56pg/ml；α2在各濃度時均顯著，分別達(dá)到1081±65.39、1014±105.3、1036±115.8、981±134.76pg/ml；t5在10μg/ml濃度時顯著，達(dá)到1199.81±358.47pg/ml；肽在20μg/ml濃度時未檢測出。

兩種肽α1、α2與pha同時作用于單個核細(xì)胞48小時后，與對照組相比il-4的產(chǎn)生量略有增加，但均無顯著差異，見圖13。

如圖14所示，兩種肽α1、α2單獨刺激單個核細(xì)胞在48小時后il-1β較pha組的0pg/ml產(chǎn)生量明顯增加，α1在各濃度時均顯著；α2在各濃度時均顯著；t5在20μg/ml濃度時顯著，達(dá)到1199.81±358.47pg/ml。

3.兩種肽α1、α2單獨或與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞cd4、cd8細(xì)胞的表達(dá)水平：

用流式技術(shù)儀檢測經(jīng)兩種肽作用的單個核細(xì)胞cd3+t細(xì)胞中cd4+t和cd8+t細(xì)胞的百分含量。與空白對照組相比，無顯著差異，如圖15-16所示。說明兩種肽對單個核細(xì)胞中兩個細(xì)胞亞群的總量和分化無顯著影響，即它們在體外不能促進cd4和cd8細(xì)胞亞群的分化。

4兩種肽α1、α2作用于thp-1細(xì)胞的結(jié)果

4.1.thp-1細(xì)胞經(jīng)兩種肽α1、α2刺激24小時和48小時后細(xì)胞因子的表達(dá)：

thp-1細(xì)胞經(jīng)兩種肽α1、α2刺激24和48小時后，收集上清，cba法檢測上清中il-1β和tnf-α的表達(dá)，檢測結(jié)果均為0，說明兩種肽α1、α2均不能刺激thp-1細(xì)胞產(chǎn)生該兩種細(xì)胞因子。

4.2.thp-1細(xì)胞表面分子的表達(dá)：

在thp-1細(xì)胞經(jīng)兩種肽刺激24和48小時后，收集細(xì)胞，流式技術(shù)檢測細(xì)胞表面cd86和hla-dr分子的表達(dá)。

在24和48小時刺激后，cd86分子的表達(dá)無顯著變化，見圖17。

而hla-dr分子在刺激24小時后，α1在40、80μg/ml濃度時均顯著，分別達(dá)到32.26±4.28、42.6±5.64pg/ml；α2在5、10、80μg/ml濃度時均顯著，達(dá)到38.51±4.29、38.78±6.48、41.4±2.46pg/ml；t5在10、20μg/ml濃度時顯著，達(dá)到35.3±5.18、41.53±2.36pg/ml。α2在各濃度該分子的表達(dá)均顯著增加，但在48小時均無明顯改變，見圖18。

討論

1.該研究是以雙盲的研究方法，研究α1、α2多肽對免疫細(xì)胞功能的影響。作為初篩實驗，我們選用健康人的外周血單個核細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞株thp-1為研究對象，以不同濃度刺激兩類細(xì)胞。研究α1、α2多肽對單個核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群分化、產(chǎn)生細(xì)胞因子的種類變化，分析α1、α2多肽對thp-1細(xì)胞株表面分子表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生種類。最終結(jié)果顯示α1、α2兩種肽能刺激健康人外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子(il-6、il-1β和tnf-α)和抗炎因子(il-10)，且與pha共同作用時能促進促炎因子(il-6、il-4和il-17a和il-1β)的表達(dá)。同時能促進thp-1細(xì)胞株hlaii分子的表達(dá)。這些結(jié)果說明，兩種肽可能以某種機制調(diào)節(jié)者免疫細(xì)胞的激活，對炎癥反應(yīng)有一定的調(diào)節(jié)作用，但具體機制有待于進一步研究。

2.該研究結(jié)果顯示出α1、α2多肽對單個核細(xì)胞有激活作用，對thp-1細(xì)胞有促進提呈的作用。但機制還不清楚。

六.三種多肽β1、β2、β3和對照t5免疫活性檢測結(jié)果及結(jié)果分析

本文在體外研究三種肽對人巨噬細(xì)胞株thp-1和外周血單個核細(xì)胞中的t細(xì)胞表面分子的表達(dá)以及激活作用的影響，評價其對免疫細(xì)胞的作用效果。結(jié)果顯示，三種肽中只有β1刺激外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生il-17a，無論單獨作用還是與pha共同作用，但只在10μg/ml的濃度時單獨刺激這些細(xì)胞與對照組相比有顯著差異，在20μg/ml濃度時與pha共同作用有顯著差異。另外，在與pha共同作用時，還能促進il-6的產(chǎn)生，在40、80μg/ml的濃度作用有顯著差異。β1還能促進thp-1細(xì)胞產(chǎn)生il-1β，以40、80μg/ml濃度作用最為明顯。這些結(jié)果表明β1能促進巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子il-1β，并促進t細(xì)胞產(chǎn)生il-17a和il-6。提示β1對免疫細(xì)胞具有一定的促炎作用，而對兩類細(xì)胞的分化沒有影響。其它兩種肽對兩類細(xì)胞均無明顯作用。

三種肽β1、β2、β3和對照t5作用于外周血單個核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞之后的細(xì)胞因子的表達(dá)變化

1.三種肽β1、β2、β3作用于外周血單個核細(xì)胞后的細(xì)胞因子的表達(dá)變化

三種肽β1、β2、β3單獨作用于外周血單個核細(xì)胞后，除il-4、il-10未檢出的細(xì)胞因子外，其余被檢測的細(xì)胞因子il-17a、ifn-γ、tnf-α、il-2、il-6在48h均被檢測出。

與對照組7.54±0.15pg/ml相比，只有il-17a經(jīng)β1刺激48小時后的產(chǎn)生量稍有增加，但只有10μg/ml的濃度下有顯著差異，表達(dá)量為11.68±1.58pg/ml。結(jié)果見圖19-圖23。

2.三種肽β1、β2、β3與pha同時作用于外周血單個核細(xì)胞后產(chǎn)生的細(xì)胞因子特點：

三種肽β1、β2、β3與pha同時作用于單個核細(xì)胞48后，均檢測出細(xì)胞因子。

只有β1能刺激il-17a的產(chǎn)生，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析只在20μg/ml濃度時與pha組比較有顯著差異，表達(dá)量為17.47±6.26pg/ml，見圖24。

il-6的產(chǎn)生在β1各濃度均高于pha組0.9±0.2pg/ml，只在40、80μg/ml濃度時顯著高于對照組，il-6表達(dá)量為2.3±0.3pg/ml、6.5±1.3pg/ml，見圖8。其它細(xì)胞因子無顯著變化，見圖26-圖30。

3.三種肽β1、β2、β3單獨或與pha共同作用于外周血單個核細(xì)胞cd4、cd8細(xì)胞亞群的變化：

用流式技術(shù)儀檢測經(jīng)三種肽β1、β2、β3作用的單個核細(xì)胞cd3+t細(xì)胞中cd4+t和cd8+t細(xì)胞的百分含量，見圖31、圖32。與空白對照組相比，無顯著差異，說明三種肽β1、β2、β3對單個核細(xì)胞中兩個細(xì)胞亞群的總量和分化無顯著影響，即它們在體外不能促進cd4和cd8細(xì)胞亞群的分化。肽與pha共同作用于單個核細(xì)胞后，盡管百分比有變化，但與對照組相比，均無顯著差異。

4.三種肽β1、β2、β3作用于thp-1細(xì)胞的結(jié)果

4.1.thp-1細(xì)胞經(jīng)三種肽β1、β2、β3刺激24小時后細(xì)胞因子的表達(dá)：

thp-1細(xì)胞經(jīng)三種肽β1、β2、β3刺激24小時后，收集上清，elisa法檢測上清中il-12p70、il-1β和tnf-α的表達(dá)，結(jié)果顯示il-12p70未檢測出，il-1β和tnf-α均檢測出。

見圖33，只有β1對il-1β的產(chǎn)生有影響，且在40μg/ml的濃度時，表達(dá)量為23.9±2.6pg/ml與pha組12.1±0.7pg/ml相比有顯著差異；在80μg/ml的濃度時，表達(dá)量為36.2±2.6pg/ml與pha組相比有極顯著差異。

4.2.thp-1細(xì)胞表面分子的表達(dá)：

在thp-1細(xì)胞經(jīng)三種肽β1、β2、β3刺激24h后，收集細(xì)胞，流式技術(shù)檢測細(xì)胞表面cd86和hlaii類分子的表達(dá)。結(jié)果如圖35-圖36。在刺激后，cd86和hlaii類分子的表達(dá)與對照組相比均無顯著變化。說明三種肽對巨噬細(xì)胞的提呈功能無影響。

討論

該研究是以雙盲的研究方法，研究β1、β2和β3對免疫細(xì)胞功能的影響。我們選用健康人的外周血單個核細(xì)胞和人巨噬細(xì)胞株thp-1為研究對象，以不同濃度刺激兩類細(xì)胞。研究β1、β2和β3對單個核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群分化、產(chǎn)生細(xì)胞因子的種類變化，分析β1、β2和β3對thp-1細(xì)胞株表面分子表達(dá)和細(xì)胞因子產(chǎn)生種類。最終結(jié)果顯示，β1、β2和β3均能刺激健康人外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。

β1能刺激健康人外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子il-17a，且與pha共同作用時更為明顯；另外，此肽在與pha共同作用時也能促進il-6的產(chǎn)生。同時能促進thp-1細(xì)胞株產(chǎn)生il-1β。這些結(jié)果說明，β1可能以某種機制激活巨噬細(xì)胞，具有促進炎癥反應(yīng)的作用。

以上所述僅是本發(fā)明的具體實施例而已，并非對本發(fā)明做任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以具體實施例公開如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述公開的技術(shù)內(nèi)容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。

序列表

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<120>源于血紅蛋白的免疫活性人胎盤多肽

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