專利名稱：利用標(biāo)記物組合鈣防衛(wèi)蛋白和血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物從糞便樣品評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌的方法
利用標(biāo)記物組合鈣防衛(wèi)蛋白和血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物 從糞便樣品評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌的方法本發(fā)明涉及幫助評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌的方法。所述方法特別用于在體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸 癌的存在與否。所述方法例如通過(guò)分析生化標(biāo)記物來(lái)實(shí)施，包括測(cè)量糞便樣品中血紅蛋白/ 觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白的濃度，并將所測(cè)得的濃度與結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān) 聯(lián)。基于本發(fā)明的方法，為了進(jìn)一步改進(jìn)結(jié)腸直腸癌的測(cè)定，可以與所述血紅蛋白/觸珠蛋 白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白一起測(cè)定糞便樣品中的一種或多種其它標(biāo)記物的水平，并將其與 結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及在結(jié)腸直腸癌的早期診斷中采用包括血紅蛋 白/觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白的標(biāo)記物組，并且教導(dǎo)了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑 品.O
背景技術(shù)：
癌癥仍然是公共健康的主要挑戰(zhàn)，盡管在檢測(cè)和治療已經(jīng)取得了進(jìn)步。在各種類 型的癌癥中，結(jié)腸直腸癌(=CRC)是西方人中最為常見(jiàn)的癌癥之一。癌癥的分期是所述疾病在范圍、階段、和嚴(yán)重程度方面的分類。其將癌癥患者進(jìn)行 分組，使得能夠歸納出預(yù)后和治療選擇。當(dāng)今， !系統(tǒng)是最廣泛使用的癌癥解剖學(xué)范圍的分類。它代表了一種國(guó)際上 接受的、統(tǒng)一的分類系統(tǒng)。其中有三個(gè)基本的變量T(原發(fā)腫瘤的范圍)，N(區(qū)域淋巴 結(jié)的狀態(tài))以及M(遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的存在與否)。所述 !標(biāo)準(zhǔn)公布于UICC(International Union Against Cancer), Sobin, L. H. , ffittekind, Ch.(編輯)，TNM Classification of Malignant Tumours，.五片反，1997。尤其重要的是將CRC早期診斷轉(zhuǎn)化成更好的預(yù)后。結(jié)腸直腸的惡性腫瘤是由良性 腫瘤，即腺瘤引發(fā)的。因而，最好的預(yù)后能使得患者在腺瘤階段就被診斷出。早在TyNc^Mtl 或T1-3、N0、M0期被診斷的患者，如果加以適當(dāng)治療，則相比較于當(dāng)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移已經(jīng)發(fā)生才被 診斷出的患者的僅10%的5年存活率來(lái)說(shuō)，診斷后存活5年的機(jī)會(huì)高于90%。人們?cè)趯ふ矣糜谠u(píng)價(jià)CRC存在與否的方法，其尤其適用于在癌變前(腺瘤)狀態(tài) 下或者在毫不存在轉(zhuǎn)移(近處或遠(yuǎn)處都沒(méi)有)的腫瘤階段，即在UICC I、II或III類下，靈 敏地檢測(cè)CRC。癌癥被檢測(cè)/診斷越早；總體存活率越好。這對(duì)于CRC是特別符合的。在腫瘤的 發(fā)展階段中的預(yù)后是不良的。在診斷后五年內(nèi)超過(guò)三分之一的患者將死于進(jìn)行性疾病，相 應(yīng)于約40%的五年存活率。當(dāng)前的治療僅僅治愈一部分患者，對(duì)于在疾病的早期階段診斷 的那些患者明顯具有最好的效果。對(duì)于作為公眾健康難題的CRC，重要的是開(kāi)發(fā)對(duì)于結(jié)腸直腸癌的更有效的篩選和 預(yù)防措施。當(dāng)前對(duì)于結(jié)腸直腸癌可用的最早期的檢測(cè)過(guò)程涉及使用便血測(cè)試或內(nèi)窺鏡操作。 然而，在檢測(cè)出便血之前一般必須有顯著的腫瘤大小。對(duì)于根據(jù)糞便樣品的CRC檢測(cè)，當(dāng)前 的技術(shù)已經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間是基于愈創(chuàng)木脂的糞便潛隱血測(cè)試。
作為根據(jù)糞便的CRC篩選測(cè)定，愈創(chuàng)木脂測(cè)試是當(dāng)前最廣泛使用的。然而，愈 創(chuàng)木脂測(cè)試具有不良的靈敏度和不良的特異性?；谟鷦?chuàng)木脂的糞便潛隱血測(cè)試的靈 敏度是 26%，其意味著具有惡性病變的74%的患者將仍未被測(cè)出(Ahlquist，D. Α.， Gastroenterol. Clin. North Am. 26(1997)41-55)。前癌性和癌性病變的可視化是早期檢測(cè)的最好方法，但是結(jié)腸鏡檢查是侵入性 的，具有顯著的費(fèi)用、風(fēng)險(xiǎn)和并發(fā)癥(Silvis，S. Ε.，等人，JAMA235 (1976) 928-930 ；Geenen, J.E·，等 A, Am. J. Dig. Dis. 20 (1975) 231-235 ；Anderson, W. F.,等人，J. Natl. Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
在各種疾病的診斷中，大便或糞便樣品常規(guī)地用于測(cè)試寄生蟲(chóng)、脂肪、潛血、病毒、 細(xì)菌以及其它微生物和化學(xué)物質(zhì)的存在。糞便采集是非侵入性的，因而理論上理想地用于測(cè)試兒科或老年患者、用于遠(yuǎn)離 就診地點(diǎn)的測(cè)試、用于頻繁復(fù)查以及用于測(cè)定很可能存在于消化道中的分析物的存在。根據(jù)本發(fā)明的診斷方法是基于來(lái)自個(gè)體的糞便樣品。所述糞便樣品經(jīng)過(guò)提取，從 這些處理后的糞便中通過(guò)特異性組合試劑來(lái)分別特定地測(cè)量血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物 和鈣防衛(wèi)蛋白。然而，由于多種原因，應(yīng)用免疫測(cè)定技術(shù)來(lái)分析糞便樣品被證明有困難。分析物不是分布在整個(gè)糞便樣本中，而傾向于更集中在早先與腸細(xì)胞或者甚至癌 細(xì)胞接觸的糞便樣本的外表面。這就是為什么EP 0 817 968提出使用截面糞便樣品用于 進(jìn)一步的分析的原因。EP 0 817 968的焦點(diǎn)在于糞便樣本中包含的DNA的診斷。糞便操作是令人不快的和生物危險(xiǎn)的。處理糞便的過(guò)程已經(jīng)證明是為難的和經(jīng)常 是復(fù)雜的，需要幾個(gè)操作步驟，例如過(guò)濾或離心。稱重、提取、離心和保存樣品是困難的，除 非是在配備有適合的設(shè)備和熟練技術(shù)人員的臨床實(shí)驗(yàn)室中。糞便樣品中的分析物通常是不穩(wěn)定的；認(rèn)為這對(duì)于多肽或蛋白質(zhì)是特別實(shí)際的。 已知糞便的組分干擾了固相的免疫測(cè)定。在固相上固定的免疫反應(yīng)物可能被糞便組分吸 附?？赡馨l(fā)生非特異性反應(yīng)。為了提高免疫測(cè)定技術(shù)用于測(cè)量糞便樣品中的蛋白質(zhì)分析物的商業(yè)使用，必需解 決許多難題。例如，分析物必需盡可能高效地溶解，糞便中分析物的不穩(wěn)定性必需被處理， 來(lái)自糞便組分的干擾必需盡可能降低，糞便的廣泛操作、設(shè)備污染和檢測(cè)設(shè)備需求必需被 最小化。需要避免使用昂貴的設(shè)備和儀器的簡(jiǎn)單制備步驟來(lái)擴(kuò)展免疫測(cè)定測(cè)試過(guò)程的用 途，或至少是醫(yī)院和臨床實(shí)驗(yàn)室環(huán)境外的地點(diǎn)的這種免疫測(cè)定的采樣過(guò)程。在蛋白質(zhì)如血 紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白的檢測(cè)中有益的糞便樣品稀釋劑的實(shí)例在下文 中進(jìn)一步給出。WO 02/18931公開(kāi)了制備糞便樣本用于診斷測(cè)定的方法。描述了基于提取緩沖液 的改進(jìn)的提取過(guò)程，所述提取緩沖液基本上包含緩沖物質(zhì)、洗滌劑，優(yōu)選的兩性離子洗滌劑 以及阻斷劑。通過(guò)使用近來(lái)開(kāi)發(fā)的取樣裝置，糞便樣本的操作變得方便。例如，在EP 1 366 715 和EP 1 214 447中描述了適合的糞便采樣裝置。盡管自1990年代早期以來(lái)已經(jīng)描述了包含在糞便樣本中的蛋白質(zhì)的免疫學(xué)測(cè) 定，這種測(cè)定仍未在臨床例程中廣泛使用。例如，US 5，198，365描述了通過(guò)血紅蛋白的特異性免疫學(xué)測(cè)量，有可能檢測(cè)糞便樣品中血液的存在。對(duì)檢測(cè)糞便中CRC的愈創(chuàng)木脂測(cè)試法的另一種替代方法近期被公開(kāi)，其在于在 脫落到糞便中的結(jié)腸細(xì)胞中通過(guò)免疫組織化學(xué)法來(lái)檢測(cè)結(jié)腸直腸癌特異性抗原，“微小染 色體維持蛋白2” (MCM2)。由于研究規(guī)模小，基于結(jié)腸直腸癌檢測(cè)診斷值的結(jié)論是初步的。 然而，該測(cè)試對(duì)于檢測(cè)右側(cè)的結(jié)腸癌似乎只有有限的靈敏度(Davies，R. J.等.，Lancet 359(2002)1917-1919)。
US 5，455，160中描述了鈣防衛(wèi)蛋白是一種對(duì)糞便樣品CRC檢測(cè)的替代性生物 標(biāo)記物，相應(yīng)地其記載于Roseth，A. G.等人的科學(xué)文獻(xiàn)中(Scan d. J. Gastroentero. 1 27 (1992) 793-798 ；Scand. J. Gastroenterol. 28 (1993) 1073-1076)。盡管鈣防衛(wèi)蛋白是炎癥 疾病的標(biāo)記物，但其作為糞便CRC檢測(cè)標(biāo)記物的潛能記載于許多出版物中(J0hne，B.等.， Scand. J. Gastroenterol. 36 (2001) 291-296 ；Limburg, P. J.等·，Am. J. Gastroenterol. 9 8(2003)2299-2305 ；Hoff, G.等，Gut 53(2004) 1329-1333)。盡管鈣防衛(wèi)蛋白的靈敏度和 特異性相比免疫血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物較低，但對(duì)于診斷標(biāo)記物而言鈣防衛(wèi)蛋白相比 血紅蛋白或血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物也具有一些較優(yōu)的性質(zhì)。它均勻地分布在糞便中， 在室溫下穩(wěn)定，這使得郵寄所述樣品到實(shí)驗(yàn)室具有可行性，并且它看似不會(huì)干擾食物成分 或藥物化合物(Ton，H.等，Clin. Chim. Acta 292(2000)41-54)。然而。升高濃度的鈣防 衛(wèi)蛋白，S100A8和S100A9的異質(zhì)二聚體，在患有克羅恩病或炎癥性腸病的患者糞便樣品 中也同樣測(cè)得。這些結(jié)果與鈣防衛(wèi)蛋白在炎癥中較為普遍的角色一致(Ryckman，C.等， J. Immunol. 170(2003)3233-3242)。因此，在胃腸病學(xué)中利用鈣防衛(wèi)蛋白并不局限于檢測(cè) CRC,而是延及其他的疾病，尤其是炎癥性腸病，如Poullis，A等的綜述(J. Gastroenterol. Hepatol. 18(2003)756-762)。因而鈣防衛(wèi)蛋白看上去不是CRC的特異性標(biāo)記物。最近Sieg，Α.等人在 Int. J. Colorectal Dis. 14(1999)267-271 中調(diào)查了愈創(chuàng)木 脂測(cè)試的替代性診斷法的靈敏度和特異性。尤其比較了來(lái)自糞便樣品的血紅蛋白和血紅蛋 白-觸珠蛋白復(fù)合物的測(cè)量結(jié)果。已經(jīng)注意到，血紅蛋白測(cè)定在檢測(cè)結(jié)腸直腸腫瘤時(shí)具有 不令人滿意的靈敏度。而對(duì)在進(jìn)展癌期的癌癥進(jìn)行了檢測(cè)，其靈敏度是大約87%的早期腫 瘤沒(méi)有以足夠的靈敏度被檢測(cè)到。所述血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物測(cè)定在CRC早期檢測(cè)中 更加靈敏。然而，這種更加靈敏的檢測(cè)卻伴隨有差的特異性。在篩查測(cè)定中差的特異性不 幸地轉(zhuǎn)化為了大量不必要的二次檢查，如結(jié)腸鏡檢查，差準(zhǔn)確度的測(cè)定也不能滿足普遍接 受的篩查測(cè)定的需要。顯然需要提高對(duì)結(jié)腸直腸癌的早期測(cè)定和評(píng)價(jià)。本發(fā)明的任務(wù)是查明是否能夠改進(jìn)CRC評(píng)價(jià)，例如通過(guò)免疫學(xué)方法來(lái)檢測(cè)糞便樣 本中的分析物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并確立了通過(guò)生化標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存在與否的方法，包括 測(cè)量糞便樣品中至少血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的組合的濃度，其能夠幫助 克服上面提到的至少一些缺點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)是令人驚訝的，因?yàn)閮煞N單獨(dú)的標(biāo)記物看上去都 有特異性方面的問(wèn)題，并且還由于血紅蛋白(通常作為CRC較高特異性標(biāo)記物)和鈣防衛(wèi) 蛋白的組合與目前確定的標(biāo)記物組合相比，在95%特異性以及98%特異性下都表現(xiàn)出較 低的靈敏度。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及通過(guò)生化標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存在與否的方法，包括分別測(cè) 量糞便樣品中至少血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物的多肽濃度和鈣防衛(wèi)蛋白的多肽濃度，并且 將所測(cè)定的血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的濃度與結(jié)腸直腸癌的存在與否相 關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步，本發(fā)明公開(kāi)了將標(biāo)記物組，包括至少所述標(biāo)記物鈣防衛(wèi)蛋白和血紅蛋白/ 觸珠蛋白復(fù)合物，用于診斷結(jié)腸直腸癌。本發(fā)明還公開(kāi)了用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明方法的試劑盒，包括分別特異性地檢測(cè)所述 血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白所需的試劑，以及任選的用于實(shí)施各自測(cè)定的輔 助試劑。
具體實(shí)施例方式在第一種實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)生化標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存在與 否的方法，包括測(cè)量糞便樣品中至少(a)血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和(b)鈣防衛(wèi)蛋白的 濃度，以及(c)將步驟(a)和(b)中測(cè)定的濃度與結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān)聯(lián)。術(shù)語(yǔ)“評(píng)價(jià)”用于表明，根據(jù)本發(fā)明的方法不是單獨(dú)地而是與其他變量一起，例如 結(jié)腸鏡檢查的確認(rèn)結(jié)果，幫助醫(yī)生來(lái)確立其結(jié)腸直腸癌(CRC)的診斷結(jié)果或者得出其治療 相關(guān)的結(jié)論。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該評(píng)價(jià)會(huì)涉及CRC的存在與否。如技術(shù)人員將明白那樣， 對(duì)于給定疾病而言，沒(méi)有單個(gè)生化標(biāo)記物、也沒(méi)有標(biāo)記物的組合具有100%特異性的同時(shí)具 有100%靈敏度的診斷能力，而確切的說(shuō)生化標(biāo)記物是用來(lái)以某種可能性或預(yù)測(cè)值來(lái)評(píng)價(jià) 疾病存在與否的。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的方法有助于評(píng)價(jià)CRC的存在與否。如技術(shù)人員將明白那樣，將標(biāo)記物水平與CRC的存在與否相關(guān)聯(lián)的步驟可以以不 同的方式實(shí)施和實(shí)現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，選擇參照群體并確立正常范圍。通過(guò)應(yīng)用適當(dāng)?shù)膮⒄杖?體，僅用常規(guī)性實(shí)驗(yàn)就可以確立糞便樣品中血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白的 正常范圍。通常認(rèn)為所述正常范圍在某種程度上但是是在有限程度上依賴于確立它的參照 群體。理想而優(yōu)選的參照群體數(shù)量要大，例如幾百到幾千人，并且在年齡、性別和任選的其 它感興趣變量方面相匹配。就絕對(duì)值而言的正常范圍，例如給定的濃度，還依賴于所采用的 測(cè)定法以及在生成所述測(cè)定時(shí)所使用的標(biāo)準(zhǔn)化。樣品部分中血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的給定水平通過(guò)來(lái)自相同 糞便樣品的等分測(cè)得并用給定的測(cè)定步驟確立。根據(jù)本發(fā)明的“標(biāo)記物”總是涉及上述生物分子的多肽形式，S卩，不是這種標(biāo)記物 的DNA或mRNA編碼。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，至少分別測(cè)定了存在于糞便樣品中的生物標(biāo)記物血紅蛋 白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的每一種的濃度，測(cè)量值在數(shù)學(xué)上相組合，所述標(biāo)記物 組合的組合值與CRC的存在與否相關(guān)聯(lián)。如技術(shù)人員將明白那樣，有許多方式來(lái)使用兩種或更多種標(biāo)記物的測(cè)量結(jié)果來(lái)改 進(jìn)檢查中的診斷問(wèn)題。在一種十分簡(jiǎn)單但通常仍然很有效的方法中，如果樣品對(duì)被檢標(biāo)記 物的至少一種呈陽(yáng)性，則認(rèn)為是陽(yáng)性結(jié)果。這種情況可以是，例如當(dāng)診斷傳染性疾病如AIDS 時(shí)的情況。但是，常常是評(píng)價(jià)標(biāo)記物的組合。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，對(duì)標(biāo)記物組的標(biāo)記物的測(cè)量值，例如，對(duì)血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的測(cè)量值，在數(shù)學(xué)上進(jìn)行組 合，并將組合值與被診斷的問(wèn)題相關(guān)聯(lián)。 標(biāo)記物值可以通過(guò)現(xiàn)有數(shù)學(xué)方法的任何適當(dāng)?shù)臓顟B(tài)進(jìn)行組合。用于將標(biāo)記物組合 關(guān)聯(lián)到疾病上的公知數(shù)學(xué)方法采用例如以下方法判別分析(DA)(即，線性、二次方程、正 則化DA) ,Kernel算法(即SVM)、非參數(shù)算法(即k近鄰分類法)、PLS (偏最小二乘法)、基 于樹(shù)的算法(即邏輯回歸、CART、隨機(jī)森林算法、Boosting/Bagging算法)、廣義線性模型 (即邏輯回歸)、基于主成分的算法(即SIMCA)、廣義加法模型、基于模糊邏輯的算法、基于 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方法。技術(shù)人員在選擇適當(dāng)方法來(lái)評(píng)估本發(fā)明的標(biāo)記物組合方面沒(méi) 有任何問(wèn)題。優(yōu)選地，用于將本發(fā)明的標(biāo)記物組合與例如CRC的存在與否相關(guān)聯(lián)的方法選 自DA(即，線性、二次方程、正則化DA)、Kernel算法(即SVM)、非參數(shù)算法(即k近鄰分類 法)、PLS (偏最小二乘法)、基于樹(shù)的算法(即邏輯回歸、CART、隨機(jī)森林算法、Boosting算 法)或廣義線性模型(即邏輯回歸)。這些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的相關(guān)詳細(xì)內(nèi)容在以下參考文獻(xiàn)中找 至丨J :Ruczinski,I.等，J. ofComputational and Graphical Statistics 12 (2003)475-511 ； Friedman, J. 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Chem. 39(1993)561-577)。ROC 圖是在整個(gè)觀察到的數(shù) 據(jù)范圍內(nèi)從連續(xù)變化的決策閾值取得的全部的成對(duì)靈敏度/特異性的曲線圖。實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的臨床表現(xiàn)依賴于其診斷準(zhǔn)確度，或者將受試者正確分類到臨床相關(guān) 亞組中的能力。診斷準(zhǔn)確度測(cè)量的是所述測(cè)試正確區(qū)分被檢受試者的兩種不同情況的能 力。這種情況是例如健康與疾病或者良性與惡性疾病。在每種情況下，通過(guò)在決策閾值的完整范圍上標(biāo)繪出靈敏度對(duì)比1-特異性，ROC 標(biāo)繪圖描繪了兩種分布之間的重疊。在Y軸上是靈敏度，或者真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)[定義為(真陽(yáng) 性測(cè)試結(jié)果的數(shù)量)/(真陽(yáng)性的數(shù)量+假陰性測(cè)試結(jié)果的數(shù)量)]。這也被稱作疾病或狀 況存在下的陽(yáng)性。它單獨(dú)地從受影響的亞群中計(jì)算。在X軸上是假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)，或1-特異性 [定義為(假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)量)/(真陰性的數(shù)量+假陽(yáng)性結(jié)果的數(shù)量)]。它是特異性的指 數(shù)，完全從未受影響的亞群中計(jì)算。因?yàn)槭褂脕?lái)自兩個(gè)不同亞群的測(cè)試結(jié)果完全獨(dú)立地計(jì) 算真陽(yáng)性和假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)，ROC標(biāo)繪圖獨(dú)立于樣品中的疾病發(fā)病率。在ROC標(biāo)繪圖上的每個(gè)點(diǎn)代表了相應(yīng)于特定的決策閾值的靈敏度Λ-特異性配對(duì)。具有理想辨別力(在結(jié)果的兩個(gè) 分布中沒(méi)有重疊)的測(cè)試具有穿過(guò)左上角的ROC標(biāo)繪線，其中真陽(yáng)性分?jǐn)?shù)是1.0，或100% (理想的靈敏度)、假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)是0(理想的特異性)。沒(méi)有辨別力的測(cè)試的理論標(biāo)繪圖(兩 個(gè)組的結(jié)果相同的分布)是從左下角到右上角的45°對(duì)角線。大多數(shù)標(biāo)繪圖落入這兩個(gè)極 端之間。(如果ROC標(biāo)繪圖完整落在45°對(duì)角線之下，通過(guò)將“陽(yáng)性”的指標(biāo)從“大于”逆 轉(zhuǎn)成“低于”來(lái)容易地補(bǔ)救，反之亦然。)定性地，標(biāo)繪圖越靠近左上角，試驗(yàn)的總體精確度 越高。定量實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的診斷精確性的一個(gè)方便的目標(biāo)是通過(guò)單個(gè)數(shù)字表示它的性能。最常見(jiàn)的全局度量是ROC標(biāo)繪圖下的面積(曲線下面積=AUC)。按照慣例，這個(gè)面積永遠(yuǎn) ^ 0. 5 (如果不是，人們可以反轉(zhuǎn)決策規(guī)則使它這樣)。值在1. 0(兩個(gè)組的測(cè)試值的理想分 離)和0.5 (在測(cè)試值的兩個(gè)組之間沒(méi)有明顯的分布差異)之間。該面積不是僅取決于標(biāo) 繪圖的特定部分，例如最靠近對(duì)角線的點(diǎn)或在90%特異性的靈敏度，而是取決于整個(gè)標(biāo)繪 圖。這是ROC標(biāo)繪圖如何接近理想標(biāo)繪圖(面積=1.0)的定量的、描述性的表述。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于提高結(jié)腸直腸癌的診斷準(zhǔn)確度的方法，即， 患CRC的患者與對(duì)照，即沒(méi)患CRC的患者，這是通過(guò)如下進(jìn)行的通過(guò)測(cè)量樣品中至少血紅 蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的濃度并將所測(cè)定的濃度與CRC的存在與否相關(guān)聯(lián)。 這使得相比基于任何一種單獨(dú)標(biāo)記物的分類方法有所改進(jìn)，即更多的患者能夠在患有CRC 與健康對(duì)照之間進(jìn)行正確分類。包括血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的所述CRC 標(biāo)記物組當(dāng)然還可以用于評(píng)價(jià)患有CRC患者的疾病嚴(yán)重程度。如技術(shù)人員將明白那樣，可以使用一種或多種其它的生物標(biāo)記物來(lái)進(jìn)一步提高對(duì) CRC的評(píng)價(jià)。為了說(shuō)明這種使用血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白作為標(biāo)記物組中 的評(píng)價(jià)CRC的關(guān)鍵標(biāo)記物的其它潛能，術(shù)語(yǔ)“至少”被用于所附的權(quán)利要求中。換句話說(shuō)， 在CRC評(píng)價(jià)中，所測(cè)得的一種或多種其它標(biāo)記物的水平可以與血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物 和鈣防衛(wèi)蛋白的測(cè)量值相組合。與血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白一起使用的一種或多種其它標(biāo)記物 可以考慮作為CRC標(biāo)記物組的一部分，即適于進(jìn)一步改進(jìn)CRC評(píng)價(jià)的一系列標(biāo)記物。CRC標(biāo) 記物組中的標(biāo)記物總數(shù)優(yōu)選小于20種標(biāo)記物，更優(yōu)選小于15種標(biāo)記物，還優(yōu)選小于10種 標(biāo)記物，8種或更少的標(biāo)記物甚至更為優(yōu)選。優(yōu)選CRC標(biāo)記物組總共包含3、4、5或6種標(biāo)記 物。因而在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過(guò)生化標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存 在與否的方法，包括測(cè)量樣品中血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的濃度和另外的 一種或多種其它標(biāo)記物的濃度，以及將所述血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、鈣防衛(wèi)蛋白、和所 述一種或多種其它標(biāo)記物的濃度與結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，所述一種或多種其它標(biāo)記物選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組CEA、CYFRA 21-1, CA19-9, CA72-4、NNMT, PROC 和 SAHH。對(duì)“CYFRA 21-1”的測(cè)定特別測(cè)量了存在于循環(huán)中細(xì)胞角蛋白19的可溶片段。 對(duì)CYFRA 21-1的測(cè)量典型是基于兩種單克隆抗體(Bodenmuel Ier，H.等，Int. J.Biol. Markers 9(1994)75-81)。在德國(guó) RocheDiagnostics 的 CYFRA 21-1 測(cè)定中，使用了所述兩 種特異性單克隆抗體(KS19. 1和BM 19. 21)，并測(cè)量了分子量大約為30000道爾頓的細(xì)胞角蛋白19的可溶片段。測(cè)得的碳水化合物抗原19-9 (CA 19-9)值通過(guò)使用單克隆抗體1116-NS-19-9來(lái) 定義。測(cè)量了分子量大約為10000道爾頓的糖酯上的1116-NS-19-9反應(yīng)決定因子。該粘蛋 白對(duì)應(yīng)于Lewis-a血型決定因子半抗原，并且是多個(gè)粘膜細(xì)胞的成分。(KoproWSki，H.等.， Somatic Cell Genet. 5 (1979) 957-972)。CA 19-9 可以通過(guò)例如，用 Roche 的 11776193 號(hào) 產(chǎn)品按照生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)在Elecsys ； 分析儀上測(cè)得。CA72-4測(cè)定利用兩種單克隆抗體決定了血清中粘蛋白樣腫瘤相關(guān)糖蛋白TAG72。 所述單克隆B72. 3是針對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的富膜提取物培養(yǎng)得到的(Colcher，D.等.，Proc. Natl. Acad. Sci. 78 (1981) 3199-3203)。所述單克隆CC49對(duì)高度純化的TAG 72具有特異性。 CA72-4可以用Roche的11776258號(hào)產(chǎn)品按照生產(chǎn)說(shuō)明書(shū)在Elecsys⑥分析儀上測(cè)得。癌胚抗原(CEA)是單體糖蛋白(分子量大約180. 000道爾頓)，其可變碳水化 合物成分為大約 45-60% (Gold, P.和 Freedman S. 0.，J. Exp. Med. 121 (1965)439-462)。 高CEA濃度通常存在于結(jié)腸直腸腺癌的情況下(Fateh-Moghadam，Α.和Stieber，P.， Sensible use of tumor markers, BoehringerMannheim, Cat. No. 1536869 (Engl.), 1320947(German),ISBN 3-926725-07_9German/English,Juergen Hartmann Verlag GmbH, Marloffstein-Rathsberg(1993))。CEA 輕到中度的升高(很少> 10ng/mL)發(fā)生在 20-50% 的腸道、胰腺、肝臟和肺的良性疾病中(例如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、潰瘍性結(jié)腸炎、克 羅恩病、肺氣腫)(Fateh-Moghadam，Α.，和Stieber，P.，supra)。吸煙者也具有升高的CEA 值。CEA確定的主要指標(biāo)是結(jié)腸直腸癌的和后續(xù)治療管理。蛋白質(zhì)煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(NNMT ；Swiss-PROT :P40261)具有29. 6kDa的表觀 分子量和5. 56的等電點(diǎn)。最近發(fā)現(xiàn)(W0 2004/057336)NNMT在CRC的評(píng)價(jià)中很有用。WO 2004/057336中描述的免疫測(cè)定被用來(lái)測(cè)量本研究中的樣品(CRC，健康對(duì)照和非惡性結(jié)腸 病)。蛋白質(zhì)吡咯琳-5-羧酸鹽還原酶(PR0C ；Swiss-PROT :P32322)在文獻(xiàn)中也稱為 PYCRl0 PROC催化NAD(P)H依賴型吡咯琳-5-羧酸鹽轉(zhuǎn)化成脯氨酸。Merrill, Μ. J.等， J. Biol. Chem. 264(1989)9352-9358研究了人紅細(xì)胞吡咯琳-5-羧酸鹽還原酶的性質(zhì)。其結(jié) 論是除了在吡咯琳生物合成中催化必要的和最終的單向步驟的傳統(tǒng)角色之外，所述酶在一 些細(xì)胞類型包括人紅細(xì)胞的NADP (+)生成中扮演了生理角色。PROC近來(lái)被確認(rèn)為CRC的標(biāo) 記物(W0 2005/095978)。蛋白質(zhì)SAHH(S-腺苷高半胱氨酸水解酶；SWISS-PR0T :P23526)近來(lái)被確認(rèn)為結(jié) 腸直腸癌的標(biāo)記物(W0 2005/015221)。對(duì)應(yīng)克隆的人cDNA編碼48kDa的蛋白質(zhì)。SAHH 催化以下可逆反應(yīng)S-腺苷-L-高半胱氨酸+H20 ^腺苷+L-高半胱氨酸(Cantoni， G. L. ，Annu. Rev. Biochem.44(1975)435-451)。 Hershfield 禾口 Francke(Hershfield， Μ. S.和Francke，U.，Science 216(1982)739-742)將對(duì)應(yīng)的基因定位到染色體20上，之 后 Coulter-Karis 禾口 Hershfield(Coulter—Karis, D. Ε.禾口 Hershfield, Μ. S. , Ann. Hum. Genet. 53(1989) 169-175)測(cè)了 cDNA的全長(zhǎng)序列。近年來(lái)，SAHH的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析出 (Turner, Μ. Α.等· ，Cell. Biochem. Biophys. 33(2000) 101-125)。如技術(shù)人員將明白那樣，可以使用一種或多種其他的標(biāo)記物來(lái)進(jìn)一步提高診斷準(zhǔn) 確度，或在需要時(shí)，以特異性為代價(jià)提高診斷靈敏度或者反之。在一些診斷領(lǐng)域，例如HIV感染的檢測(cè)中，靈敏度是最為重要的。所需要的高靈敏度可以以特異性為代價(jià)獲得，這導(dǎo)致 了假陽(yáng)性情況數(shù)量的增加。在另一些情況下，例如作為簡(jiǎn)單的實(shí)例，當(dāng)評(píng)價(jià)血型抗原時(shí)，特 異性則是極為重要的。
根據(jù)本發(fā)明的方法看上去適用于篩查無(wú)癥狀個(gè)體中CRC的存在與否。這樣，特異 性以及靈敏度都是極為重要的。普遍認(rèn)為，用于篩查低發(fā)病率疾病如CRC的方法，特異性必 須至少為90%，甚至優(yōu)選為95%，還甚至優(yōu)選為98%或99%。換句話說(shuō)，在后一情況下， 假陽(yáng)性分?jǐn)?shù)應(yīng)當(dāng)分別為2%或更少，或或更小。這意味著在這樣高的特異性水平下，不 會(huì)因疏忽引起過(guò)多的昂貴后續(xù)檢查(由于假陽(yáng)性結(jié)果)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)生化 標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存在與否的方法具有至少90%的特異性，甚至更優(yōu)選為至少 95%。還優(yōu)選的是，所述特異性分別為至少98%或至少99%。根據(jù)本發(fā)明通過(guò)測(cè)量糞便樣品中至少血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白 來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌的存在與否的方法，在95%和98%的固定特異性水平下，具有提高 的CRC檢測(cè)靈敏度。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及在CRC診斷中使用標(biāo)記物組，所述組包括血紅蛋白/ 觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白。進(jìn)一步優(yōu)選的是使用包括血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、鈣 防衛(wèi)蛋白、和至少一種其它多肽標(biāo)記物的標(biāo)記物組，所述其它多肽標(biāo)記物選自以下物質(zhì)構(gòu) 成的組CEA、CYFRA 21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT, PROC 和 SAHH。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)生化標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存在 與否的方法采用了在下面將詳細(xì)說(shuō)明的針對(duì)糞便樣品的特別新型稀釋劑，所述方法包括測(cè) 量糞便樣品中至少血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的濃度。優(yōu)選的糞便樣品稀釋劑至少包括緩沖液、蛋白酶抑制劑和分析物釋放試劑，但不 限于例如清潔劑或離液劑。所述緩沖液在一些優(yōu)選實(shí)施方案中另外包括阻斷劑和/或防腐 劑。技術(shù)人員熟悉合適的緩沖液系統(tǒng)。優(yōu)選所述緩沖液或緩沖液系統(tǒng)選自以下物質(zhì) 構(gòu)成的組磷酸鹽緩沖液(PBS)、三羥甲基氨基乙烷(Tris)緩沖鹽水(TBS)、N-(2-羥乙 基)-哌嗪-N' -2-乙磺酸(HEPES)和3- (N-嗎啉代)丙磺酸(MOPS)。優(yōu)選所述緩沖液具 有20到200mM之間的摩爾濃度。糞便樣品稀釋劑的pH值優(yōu)選調(diào)節(jié)到pH6. 5到pH8. 5的pH值，更優(yōu)選為pH7. 0到 PH8. 0的pH值，進(jìn)一步優(yōu)選為pH7. 2到pH7. 7的pH值。對(duì)技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，選擇緩沖液成分 的適當(dāng)濃度以確保稀釋和混合所述糞便樣本與糞便樣品稀釋劑之后獲得預(yù)期的PH值沒(méi)有 任何困難。所述糞便樣品稀釋劑包括蛋白酶抑制劑。蛋白酶的數(shù)量一直在增加，而相應(yīng)的蛋 白酶抑制劑也如此。一類重要的蛋白酶是所謂的絲氨酸蛋白酶，在其活性位點(diǎn)具有氨基酸絲氨酸。公 知的絲氨酸蛋白酶實(shí)例有胰島素、糜蛋白酶、激肽釋放酶以及尿激酶。技術(shù)人員熟知某些 蛋白酶抑制劑對(duì)于絲氨酸蛋白酶具有活性。這種蛋白酶及其活性譜的抑制潛能例如記 載于來(lái)自提供商如 Serva、Heidelberg 或 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 的數(shù)據(jù)表 單。優(yōu)選所述絲氨酸蛋白酶抑制劑選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組AEBSF-HC1 (如Serva Cat. No. 12745)，APMSF-HC1 (如 Serva Cat. No. 12320)，抑肽酶(如 Roche Diagnostics, Cat.No. 10 981 532 001)，胰凝乳蛋白酶抑制劑(如 Roche Diagnostics, Cat. No. 11 004 638 001)，Pefabloc SC (如 Roche Diagnostics, Cat. No. 11 585916 001)，和 PMSF (如 Roche Diagnostics, Cat. No. 10 837 091 001)。另一類重要的蛋白酶是所謂的半胱氨酸蛋白酶，在其活性位點(diǎn)具有氨基酸半胱 氨酸。公知的半胱氨酸蛋白酶實(shí)例有木瓜蛋白酶和鈣蛋白酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知某些 蛋白酶抑制劑對(duì)于半胱氨酸蛋白酶具有活性。這些抑制劑中的一些也對(duì)絲氨酸蛋白酶 具有活性，例如PMSF可用作半胱氨酸蛋白酶的抑制劑以及絲氨酸蛋白酶的抑制劑。這 種蛋白酶及其活性譜的抑制潛能例如記載于來(lái)自提供商如Serva、Heidelberg或Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim的數(shù)據(jù)表單。優(yōu)選所述半胱氨酸蛋白酶抑制劑選自以下物質(zhì) 構(gòu)成的組亮抑酶肽(如 Roche Diagnostics, Cat. No. 11 034 626 001)，PMSF(見(jiàn)上)，和 E-64 (^HRoche Diagnostics, Cat. No. 10 874 523 001)。
另一類重要的蛋白酶是所謂的金屬蛋白酶。金屬蛋白酶的特征在于在活性中心 含有金屬離子如Zn2+，Ca2+或Mn2+。公知的金屬蛋白酶實(shí)例有消化酶類，如羧肽酶A和B以 及嗜熱菌蛋白酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知某些蛋白酶抑制劑對(duì)于金屬蛋白酶具有活性。金 屬蛋白酶最容易被結(jié)合到所述金屬離子并與其形成金屬螯合復(fù)合物的物質(zhì)所鈍化。優(yōu)選， 使用乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二(氨基乙醚)四乙酸(EGTA)和/或1，2_ 二氨基環(huán)己 烷-N，N，N' ,N'-四乙酸(⑶ΤΑ)來(lái)鈍化所述金屬蛋白酶。金屬蛋白酶的其它適當(dāng)抑制劑 有膦酰二肽(=Ν_(α -鼠李糖吡喃氧羥基氧膦基)-L-亮氨酰-L色氨酸，二鈉鹽，如Roche Diagnostics Cat. No. 10 874 531 001)以及苯丁抑制素(如 Roche Diagnostics Cat. No. 10 874 515 001)。這些蛋白酶抑制劑及其活性譜的抑制潛能例如記載于來(lái)自提供商如 Serva^Heidelberg 或 Roche DiagnosticsGmbHjMannheim 的數(shù)據(jù)表單。優(yōu)選的金屬蛋白酶 抑制劑為EDTA、EGTA和/或苯丁抑制素。另一類重要的蛋白酶被稱為天冬氨(酸)蛋白酶。天冬氨酸蛋白酶的特征在于在 活性中心具有天冬氨酸殘基。公知的天冬氨酸蛋白酶實(shí)例有胃蛋白酶、組織蛋白酶D、凝乳 酶和腎素。技術(shù)人員熟知某些蛋白酶抑制劑對(duì)于天冬氨酸蛋白酶具有活性。優(yōu)選所述天冬 氨酸蛋白酶抑制劑為α 2-巨球蛋白(如Roche Diagnostics Cat. No. 10 602 442 001)和 抑胃酶肽(如 RocheDiagnostics Cat. No. 11 359 053 001)。對(duì)于某些應(yīng)用而言，可以通過(guò)使用糞便樣品稀釋劑來(lái)將根據(jù)本發(fā)明的方法加以應(yīng) 用，所述糞便樣品稀釋劑僅包括一種蛋白酶抑制劑，其通過(guò)例如阻斷某類蛋白酶來(lái)保護(hù)所 述目的多肽。優(yōu)選地，所述糞便樣品稀釋劑包括至少兩種不同的蛋白酶抑制劑，其活性針對(duì)兩 類選自以下組的蛋白酶絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。 還優(yōu)選這些酶種類的至少三種被適當(dāng)?shù)囊种苿┗旌弦核种?。?yōu)選所述糞便樣品稀釋劑包 含蛋白酶抑制劑混合液，其由分別針對(duì)絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和天冬 氨酸蛋白酶具有活性的蛋白酶抑制劑組成。優(yōu)選最多20種不同的蛋白酶抑制劑用于組成蛋白酶抑制劑混合液作為糞便樣品 稀釋劑。還優(yōu)選使用不超過(guò)15種不同的蛋白酶抑制。優(yōu)選10或更少種不同的蛋白酶抑制 劑包含在糞便稀釋劑中，這足以獲得足夠的蛋白酶抑制效果從而穩(wěn)定糞便樣品中的蛋白質(zhì) 類分析物。
優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組抑酶肽(aprotinin)、胰凝乳蛋 白酶抑制劑、亮抑酶肽、EDTA、EGTA、CDTA、抑胃酶肽A、苯甲基磺酰氟(PMSF)和Pefabloc ； SC。優(yōu)選所述蛋白酶抑制劑混合液含有胰凝乳蛋白酶抑制劑、亮抑酶肽、CDTA、抑胃酶 肽A、PMSF和Pefabloc SC，還優(yōu)選使用含有抑酶肽(aprotinin)、亮抑酶肽、EDTA和 Pefabloc SC的蛋白酶抑制劑混合液。優(yōu)選的糞便樣品稀釋劑還包括清 潔劑和/或離液劑。清潔劑通常分為陰離子清潔 齊U、陽(yáng)離子清潔劑、兩性離子清潔劑、非離子清潔劑。理想的用于根據(jù)本發(fā)明的糞便樣品稀 釋劑的清潔劑和/或離液劑必須能夠?qū)⒛繕?biāo)分析物從樣品中釋放出來(lái)，同時(shí)其應(yīng)當(dāng)使得分 析物穩(wěn)定化。令人驚訝的是，這種嚴(yán)格的要求可以通過(guò)使用不同的清潔劑或離液劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。 優(yōu)選用于根據(jù)本發(fā)明的糞便樣品稀釋劑的所述分析物釋放劑選自以下組的非離子清潔劑， 如 Brij 35 、Tween 20 丨 、Thesit ⑧、Triton XlOO 丨和 Nonidet P40 和 / 或選自以下組 的離液劑，如尿素、SCN、鹽酸胍(guadinium hydrochlride)等等。用糞便樣品作為樣品的 大多數(shù)方法都需要將糞便樣本直接轉(zhuǎn)移到所述測(cè)試系統(tǒng)中，例如傳移到愈創(chuàng)木脂測(cè)試的測(cè) 試區(qū)域中。該程序降低了其患者的依從率(compliance rate)。處理步驟越少以及糞便樣品的取樣和提取越強(qiáng)，則越好。一些近來(lái)的研究集中于幫助取樣和處理糞便樣品的裝置。EP1366715公開(kāi)了特殊 的采集管用于采集糞便樣品。該提取管主要包括(a)容器主體，其內(nèi)部中空，頂部開(kāi)口，并 且能夠接收緩沖液，(b)具有用于采集糞便樣品的螺紋狀小棒的頂帽，當(dāng)頂帽蓋在容器主體 頂端時(shí)，所述螺旋狀小棒軸向突出在所述容器主體內(nèi)，以及(c)在所述容器主體內(nèi)的中間 位置設(shè)置的分區(qū)隔斷，用以在所述容器主體內(nèi)分離出上部腔室和下部腔室，所述分區(qū)隔斷 具有適于允許所述螺旋狀小棒通過(guò)的軸向孔，以便將多余的糞便保持在所述上部腔室中并 允許所述小棒的螺旋部分通到所述底部腔室中。該提取管進(jìn)一步具有在底部開(kāi)口的容器主 體，其具有可移施加在所述容器主體底端的底帽，這樣所述提取管能夠直接用作主取樣管 被插入自動(dòng)分析儀的樣品支架板中(在去掉所述底帽并翻轉(zhuǎn)所述容器主體之后)。簡(jiǎn)單的 說(shuō)，EP1366715中公開(kāi)的管允許方便地處理定量的糞便樣品并具有這樣的優(yōu)點(diǎn)，即在適當(dāng)提 取之后，所述管可以被直接放到自動(dòng)分析儀的樣品支架中。讀者可以在上述說(shuō)明的專利中 找到該糞便取樣管的詳細(xì)內(nèi)容，其全部?jī)?nèi)容這里通過(guò)弓I用結(jié)合進(jìn)來(lái)。在WO 03/068398中描述了尖端的糞便取樣裝置，其也適于方便地取樣和處理 糞便樣品。在該WO申請(qǐng)中公開(kāi)的裝置特征明確被參考，這里通過(guò)引用包含其全文。在 WO 03/069343中，推薦提取糞便樣品，例如用根據(jù)WO 03/068398的裝置使用包含IOmM CHAPS ( = 3- [ (3-氯酰氨基丙基)_ 二甲氨基]-1-丙磺酸鹽)的提取緩沖液來(lái)采集，所述緩 沖液是兩性離子清潔劑。為了制備免疫測(cè)定試驗(yàn)的糞便樣品組合物，制備在糞便樣品稀釋劑中最多 IOwt. %，優(yōu)選0. Iwt. %到最多IOwt. %，更優(yōu)選0. 5到5wt. %的糞便樣品。優(yōu)選地，所述糞 便樣品與稀釋劑的混合在適當(dāng)?shù)娜庸苤兄苯又苽?，所述取樣管事先預(yù)裝有如上所述的糞 便樣品稀釋劑。所述糞便樣品優(yōu)選新鮮采集，并直接加到所述糞便樣品稀釋劑中。無(wú)需中間的存 放、運(yùn)輸和/或處理過(guò)程。血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的水平分別通過(guò)適當(dāng)?shù)臏y(cè)試方法測(cè)得。在臨床常規(guī)檢查中，這種方法在多數(shù)情況下采用針對(duì)靶抗原的抗體，即所謂的免疫測(cè)定?？?以實(shí)施包括乳膠凝集法、競(jìng)爭(zhēng)法和夾心免疫測(cè)定的多種免疫測(cè)定方法來(lái)檢測(cè)糞便樣品中的 蛋白質(zhì)類分析物，如果這種糞便樣品是例如上面詳細(xì)描述的那樣制備的話。優(yōu)選使用的免疫測(cè)定是非均勻免疫測(cè)定。還優(yōu)選所述蛋白質(zhì)類分析物的檢測(cè)利用 競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定的幫助或者利用所謂的夾心免疫測(cè)定的幫助來(lái)實(shí)現(xiàn)。
對(duì)于技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，建立能夠檢測(cè)糞便樣品提取物中存在的靶抗原或靶分析物的 免疫測(cè)定沒(méi)有問(wèn)題。例如，這種檢測(cè)可以以?shī)A心類型的免疫測(cè)定來(lái)實(shí)施。典型地，將第一抗分析物抗體 直接或間接結(jié)合到固相上。換句話說(shuō)，所述結(jié)合到靶抗原上的第一抗體用作捕獲抗體。為 確定例如在人糞便樣品的提取物中的靶分析物，將所述提取物在適當(dāng)?shù)臈l件下溫育足以使 所述捕獲抗體與分析物結(jié)合的時(shí)間。為了檢測(cè)靶抗原，使用針對(duì)所述靶抗原的第二或檢測(cè) 抗體，其結(jié)合到不同于所述捕獲抗體識(shí)別的表位的表位上。與該第二抗體的溫育可以在與 所述第一抗體的溫育之前、之后或同時(shí)進(jìn)行。優(yōu)選所述檢測(cè)抗體以有助于直接或間接檢測(cè)的方式標(biāo)記。用于直接檢測(cè)，所述標(biāo)記基團(tuán)可以選自任何已知的可檢測(cè)標(biāo)記物基團(tuán)，例如染料、 發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)例如化學(xué)發(fā)光基團(tuán)，例如吖啶鐺酯類(acridiniumester)或二氧雜環(huán)丁烷 (dioxetane)，或者熒光染料，例如熒光素、香豆素、羅丹明、噁嗪、試鹵靈、花青及其衍生物。 標(biāo)記基團(tuán)的其它實(shí)例有發(fā)光金屬?gòu)?fù)合物，如釕或銪絡(luò)合物、酶類、例如用于ELISA或用于 CEDIA(克隆酶供體免疫測(cè)定，例如EP 0061888)，以及放射性同位素。間接檢測(cè)系統(tǒng)包括，例如檢測(cè)劑，如標(biāo)記有生物親和結(jié)合對(duì)(bioaffinebinding pair)的第一成員的檢測(cè)抗體。合適的結(jié)合對(duì)的實(shí)例有半抗原或抗原/抗體、生物素或生 物素類似物如氨基生物素、亞氨基生物素或脫硫生物素/親和素或連親和素、糖/外源凝集 素、核酸或核酸類似物/互補(bǔ)核酸以及受體/配體，例如類固醇激素受體/類固醇激素。優(yōu) 選地第一結(jié)合對(duì)成員包括半抗原、抗原和激素。尤其優(yōu)選的是半抗原如地高辛和生物素及 其類似物。這種結(jié)合對(duì)的第二成員例如，抗體、鏈親和素等等，通常被標(biāo)記以允許直接檢測(cè) 至IJ，例如用上面提到的標(biāo)記物。免疫測(cè)定是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。用于實(shí)施這種測(cè)定的方法以及實(shí)踐應(yīng) 用和程序總結(jié)于相關(guān)教科書(shū)中。相關(guān)教科書(shū)的實(shí)例有Tijssen，P.，Pr印aration of enzyme-antibody or other enzyme—macromolecule conjugates, In Practice and theory of enzyme immunoassays,Burdon, R. H.禾口v. Knippenberg,P. H. (eds. ),Elsevier, Amsterdam(1990), pp. 221—278),以及 Methods inEnzymology, Colowick, S. P.禾口 Caplan, N. 0. (eds. )，Academic Press)解決免疫檢測(cè)方法的各卷中，尤其是第70，73，74，84，92和 121 卷?；谏鲜黾S便樣品稀釋劑，可以以非常方便的方式處理糞便樣品。優(yōu)選所述標(biāo)記 物血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的至少一種從收集在如上所述的糞便樣品稀 釋劑中的糞便樣品測(cè)得。優(yōu)選兩種分析物都從收集在如上所述的糞便樣品稀釋劑中的糞便 樣品測(cè)得。還優(yōu)選在檢測(cè)鈣防衛(wèi)蛋白或血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物中或在檢測(cè)這兩種分析 物中，使用這種糞便樣品稀釋劑的優(yōu)選組合物。本發(fā)明還涉及用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒，包括分別特異性測(cè)量所述血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白所需的試劑。而在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述試劑盒包括用于實(shí)施測(cè)量血紅蛋白/觸珠蛋 白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白所需的試劑，和此外預(yù)裝有合適糞便樣品稀釋劑的糞便取樣裝置。提供以下實(shí)施例來(lái)幫助理解本發(fā)明，其真正的范圍在所附的權(quán)利要求中列出。應(yīng) 當(dāng)明白，在不背離本發(fā)明精神的情況下，所述程序中可以有所改變。實(shí)施例1糞便樣本的處理為了提高糞便樣品中不同目的分析物的測(cè)量，使用“優(yōu)化的提取緩沖液”。為處理 所述糞便樣品，通過(guò)加入蛋白酶抑制劑混合液(Mini CompleteEDTA-free,Roche,Germany) 到下面的緩沖液中來(lái)新鮮制備所述提取緩沖液TRIS0. 10mol/l, pH 8. 0檸檬酸0. 10mol/l尿素1. Omol/1CaCl2 0. 01mol/lBSA0. 50%解凍所述糞便樣品并轉(zhuǎn)移50_100mg每份樣品到糞便樣品制備試劑盒中 (cat. -no. 10745804 Roche, Germany)。按照糞便樣品的重量加入優(yōu)化的提取緩沖液，以予 以50倍稀釋。將所述樣品在軌道搖床上強(qiáng)力混合30分鐘，轉(zhuǎn)移到IOml試管(Sarstedt， Germany)中，并在1200g下離心10分鐘。用5 μ m的截止過(guò)濾器(Ultrafree -CL, Millipore, Germany)過(guò)濾上清液，等分并存放在_70°C下用于進(jìn)一步分析。這些糞便提取 物對(duì)于本研究中關(guān)注的所有生物標(biāo)記物適用。實(shí)施例2糞便提取物中分析物的穩(wěn)定性在利用實(shí)施例1所述提取方法制備的糞便提取物中，鈣防衛(wèi)蛋白似乎比血紅蛋 白-觸珠蛋白更加穩(wěn)定。當(dāng)糞便提取物在室溫下存放了 1或3天時(shí)，鈣防衛(wèi)蛋白的平均回 收率比血紅蛋白-觸珠蛋白的平均回收率要高并且表現(xiàn)出較低的分散性。在20份用于評(píng) 價(jià)穩(wěn)定性的樣品中，5份血紅蛋白-觸珠蛋白為陰性。表1 溫度應(yīng)激(temperature stress)下的平均回收率 實(shí)施例3結(jié)腸直腸癌中的臨床實(shí)用性研究通過(guò)分析來(lái)自于典型特征患者群體的糞便樣品來(lái)評(píng)價(jià)所述臨床實(shí)用性。對(duì)于每位患者，測(cè)量來(lái)自于相同排便動(dòng)作的兩份糞便樣品并分析其濃度。為了提高測(cè)定的靈敏度，兩 個(gè)成對(duì)樣品之一中測(cè)得的最大濃度用于進(jìn)一步的分析。還按照Z(yǔ)weig等人(如上所述)的 ROC分析來(lái)評(píng)價(jià)鈣防衛(wèi)蛋白和血紅蛋白-觸珠蛋白及其組合的診斷值。研究群體 所有的分析物都在大研究群體中測(cè)量(患者特征，參見(jiàn)表2)。大量的臨床典型 特征糞便樣品預(yù)期性地收集在多中心研究的框架中。用于對(duì)照集合的患者(進(jìn)行了結(jié)腸鏡 檢)在腸胃病科室中招募并代表平均風(fēng)險(xiǎn)的篩查群體。具有炎癥性腸道疾病和任何種類腺 瘤的患者被排除在對(duì)照集合之外。由于結(jié)腸直腸癌患者在篩查群體中的低患病率，來(lái)自于 癌癥患者的樣品在不同的手術(shù)科室中采集。結(jié)腸直腸癌的診斷通過(guò)醫(yī)生確診，其也為每位 癌癥患者提供病理分期結(jié)果。為了排除任何可能通過(guò)基于愈創(chuàng)木脂的FOBT預(yù)篩查而由患 者的常見(jiàn)診斷工作引入的偏差，所有由于可見(jiàn)的直腸出血或由于陽(yáng)性FOBT而初步檢測(cè)過(guò) 的CRC患者被排除在該集合外。因?yàn)檫@些會(huì)導(dǎo)致偏向血紅蛋白的優(yōu)點(diǎn)。從252名對(duì)照個(gè)體中獲得糞便樣品。其中132名通過(guò)結(jié)腸鏡檢被確診為GI健康 型，而剩下的對(duì)照樣品涵蓋了幾種相關(guān)的GI疾病。所述CRC群體包括了 101份來(lái)自UICC I-IV期(表3)的CRC樣品。對(duì)16名CRC患者，不清楚具體的分期。研究群體中的患者特征 =CRC UICC 分期分布 鈣防衛(wèi)蛋白、血紅蛋白-觸珠蛋白和其他糞便標(biāo)記物的組合評(píng)估了鈣防衛(wèi)蛋白和來(lái)自糞便提取物的其他生物標(biāo)記物的組合。所述標(biāo)記物鈣防 衛(wèi)蛋白、血紅蛋白、血紅蛋白和觸珠蛋白的異質(zhì)復(fù)合體和CEA通過(guò)商用ELISA來(lái)測(cè)量。用于 測(cè)量血紅蛋白、血紅蛋白/觸珠蛋白和鈣防衛(wèi)蛋白的測(cè)定法由德國(guó)R-Biopharm處獲得。鈣 防衛(wèi)蛋白ELISA由挪威Calpro SA生產(chǎn)，并在德國(guó)之外以PhiCal 測(cè)試的形式銷售。用于 測(cè)量CEA的測(cè)定從德國(guó)Roche Diagnostics獲得。盡管一些測(cè)定意在測(cè)量糞便提取物，但 對(duì)于CEA來(lái)說(shuō)糞便不是通常使用的樣品材料。因而，必須調(diào)整所述測(cè)定以便在提取的糞便 樣本中測(cè)量。所述樣品(糞便提取物)預(yù)先被稀釋20倍用于CEA測(cè)定，但其它方面所述測(cè) 定可按照生產(chǎn)商的推薦來(lái)進(jìn)行。測(cè)試時(shí)，如果標(biāo)記物組合提高CRC的診斷，則可通過(guò)貝葉斯邏輯回歸(BLR)來(lái)組 合所述標(biāo)記物。在BLR算法中，為了評(píng)估標(biāo)記物的組合，使用高斯優(yōu)先并將其在Alexander Genkin, David D. Lewis 禾口 David Madigan 的 BBR-軟件中實(shí)現(xiàn)(Large-scale Bayesian logistic regression for textcategorization, Technometrics)。使用下列設(shè)置無(wú)自 動(dòng)特征選擇、優(yōu)先變量固定在0. 05、無(wú)閾值協(xié)調(diào)、并通過(guò)歸一化處理來(lái)進(jìn)行輸入標(biāo)準(zhǔn)化。對(duì) 于數(shù)值處理，默認(rèn)設(shè)置收斂閾值0. 0005、1000迭代和無(wú)精確模式保持不變。利用基本算法 得出的結(jié)果通過(guò)在Monte-Carlo交叉驗(yàn)證設(shè)計(jì)下的100次運(yùn)行來(lái)評(píng)估。在每次運(yùn)行中，分 別選擇所有情況和對(duì)照的三分之二以作為訓(xùn)練集，通過(guò)Matlab R2006a內(nèi)置randsample 函數(shù)，以19022007初始值作為默認(rèn)隨機(jī)數(shù)生成器來(lái)實(shí)現(xiàn)。將所述基本算法用于訓(xùn)練集上以 生成診斷規(guī)則。有關(guān)估計(jì)的后續(xù)情況概率方面的閾值在訓(xùn)練集的對(duì)照上確定，以分別達(dá)到 95%或98%的特異性。然后將該診斷規(guī)則用于其它三分之一的數(shù)據(jù)以估計(jì)給定閾值下的靈 敏度和特異性。為了避免任何偏向血紅蛋白或血紅蛋白/觸珠蛋白，只有未做過(guò)在先FOBT預(yù)篩查 的CRC患者用于此評(píng)估。對(duì)于篩查測(cè)定，不僅ROC曲線的AUC是相關(guān)的。在篩查設(shè)置中非 常重要的要求是在高特異性下的足夠好的靈敏度。高特異性是關(guān)鍵的，因?yàn)榈吞禺愋詴?huì)引 起大量假陽(yáng)性結(jié)果并伴隨對(duì)患者不必要的后續(xù)步驟和痛苦。表4總結(jié)了評(píng)估的AUC值以及 分別在預(yù)設(shè)特異性95%和98%下的靈敏度。當(dāng)一些測(cè)得的單個(gè)標(biāo)記物通過(guò)BLR組合時(shí)，通 過(guò)曲線下95%面積的鈣防衛(wèi)蛋白與血紅蛋白-觸珠蛋白的組合獲得最高AUC值。另一方面，CRC檢測(cè)中的總靈敏度可以通過(guò)血紅蛋白-觸珠蛋白與鈣防衛(wèi)蛋白在兩種特異性水平 95%和98%下的組合來(lái)提高。在兩種情況下，鈣防衛(wèi)蛋白與血紅蛋白-觸珠蛋白組合的靈 敏度驚人地高于鈣防衛(wèi)蛋白與血紅蛋白的組合。這些標(biāo)記物組合能夠在檢測(cè)CRC時(shí)被認(rèn)為 非常重要，尤其是早期CRC檢測(cè)時(shí)?！鲇糜贑RC檢測(cè)的標(biāo)記物組合
權(quán)利要求
通過(guò)生化標(biāo)記物來(lái)體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌存在與否的方法，包括測(cè)量糞便樣品中至少下列物質(zhì)的濃度a)血紅蛋白-觸珠蛋白復(fù)合物，和b)鈣防衛(wèi)蛋白，以及c)將步驟a)和b)中測(cè)定的濃度與結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān)聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括測(cè)量至少一種選自以下物質(zhì)構(gòu)成的組的其他多 肽標(biāo)記物CEA、CYFRA 21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT、PR0C 和 SAHH。
3.包括至少血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白的標(biāo)記物組在結(jié)腸直腸癌診斷 中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，包括血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物、鈣防衛(wèi)蛋白和至少一種選 自以下物質(zhì)構(gòu)成的組的其他標(biāo)記物CEA、CYFRA21-1、CA19-9、CA72-4、NNMT、PR0C和SAHH。
5.用于實(shí)施根據(jù)權(quán)利要求1的方法的試劑盒，包括分別特異性地檢測(cè)所述血紅蛋白/ 觸珠蛋白復(fù)合物和鈣防衛(wèi)蛋白所需的試劑，以及任選的用于實(shí)施所述測(cè)量的輔助試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及幫助評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌的方法。所述方法特別用于在體外評(píng)價(jià)結(jié)腸直腸癌的存在與否。所述方法例如通過(guò)分析生化標(biāo)記物來(lái)實(shí)施，包括測(cè)量糞便樣品中血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白的濃度，并將所測(cè)得的濃度與結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān)聯(lián)。基于本發(fā)明的方法，為了進(jìn)一步提高結(jié)腸直腸癌的測(cè)定，可以與所述血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白一起測(cè)定糞便樣品中的一種或多種其它標(biāo)記物的水平，并將其與結(jié)腸直腸癌的存在與否相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及在結(jié)腸直腸癌的早期診斷中，采用包括血紅蛋白/觸珠蛋白復(fù)合物以及鈣防衛(wèi)蛋白的標(biāo)記物組，并且教導(dǎo)了用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N33/574GK101868729SQ200880116821
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2008年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月20日
發(fā)明者J·卡爾, N·威爾德, U·加查雷克 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司