本發(fā)明涉及一種厭氧產(chǎn)氫菌與好氧菌呼吸互作好氧產(chǎn)氫方法，屬于發(fā)酵產(chǎn)氫技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的厭氧菌培養(yǎng)方法主要包括化學(xué)方法(利用還原作用強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收，或用還原氧化型物質(zhì)降低氧化－還原電勢(shì))，物理學(xué)方法(利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法、以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣)和生物學(xué)方法(培養(yǎng)基中含有植物組織消耗氧氣，或?qū)捬蹙c需氧菌空同培養(yǎng)在一個(gè)平皿上)。
生物發(fā)酵法制氫是一種穩(wěn)定的，無需外界光源，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的制取氫氣方法。2005年邢德峰等分離并獲得了乙醇型發(fā)酵的主要產(chǎn)氫功能細(xì)菌，并確立新的種屬——哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(ethanoligenensharbinense)，其中菌株yuan-3是從生物制氫反應(yīng)器中分離得到的一株嚴(yán)格厭氧的高效產(chǎn)氫菌株，它是已報(bào)導(dǎo)的唯一一株具有自凝集能力的產(chǎn)氫細(xì)菌，代謝末端產(chǎn)物為乙醇、乙酸、h2、co2，最大比產(chǎn)氫率可達(dá)1.9mol/mol-glucose，但是此種方法需要持續(xù)不斷的采用煮沸培養(yǎng)基再通入氮?dú)獯得摽諝獾姆椒?qū)除培養(yǎng)基中的氧氣，或者采用高成本的厭氧培養(yǎng)箱等，此種方法不僅操作繁瑣，條件苛刻，而且不利于生物制氫的擴(kuò)大化。
銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1是一種廣泛存在于自然界的兼性厭氧細(xì)菌，在實(shí)驗(yàn)室中采用lb培養(yǎng)基在好氧條件下培養(yǎng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決現(xiàn)有技術(shù)中需要持續(xù)不斷的采用煮沸培養(yǎng)基再通入氮?dú)獯得摽諝獾姆椒?qū)除培養(yǎng)基中的氧氣，該方法操作繁瑣，條件苛刻，不利于生物制氫的擴(kuò)大化，煮沸和曝氣過程中還容易造成試劑損失，進(jìn)而產(chǎn)生氫氣不純等問題，本發(fā)明旨在為產(chǎn)氫細(xì)菌的培養(yǎng)提供一種新途徑，提供一種厭氧產(chǎn)氫菌與好氧菌呼吸互作好氧產(chǎn)氫方法，具體涉及一種利用兼性菌與嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)氫細(xì)菌使用未經(jīng)厭氧處理的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)制取氫氣方法，采用的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(ethanoligenensharbinense)yuan-3和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1呼吸互作好氧制氫氣的方法，該方法是將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和銅綠假單胞菌pao1進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)是將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和銅綠假單胞菌pao1進(jìn)行共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)是將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3的菌粉和銅綠假單胞菌pao1的菌粉接種至滅菌后的液體培養(yǎng)基中，放置在35℃恒溫培養(yǎng)室中密封培養(yǎng)1小時(shí)～50小時(shí)后開始產(chǎn)生氫氣，收集氫氣。
進(jìn)一步地，所述方法按照如下步驟進(jìn)行：
一、厭氧培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3至培養(yǎng)瓶底部形成白色球狀菌膠團(tuán)且上清液澄清，離心，棄除上清液，冷凍干燥，獲得哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3的菌粉；
二、好氧培養(yǎng)銅綠假單胞菌pao1至菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2，離心，棄除上清液，冷凍干燥，獲得銅綠假單胞菌pao1的菌粉；
三、將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和銅綠假單胞菌pao1接種(接種是每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1)至滅菌后的液體培養(yǎng)基中，放置在35℃恒溫室密封培養(yǎng)1～50小時(shí)后即可開始產(chǎn)氣，收集氫氣。
進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基中包括10g/l-20g/l蔗糖或乳糖或葡萄糖。
更進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基中包括15g/l蔗糖或乳糖或葡萄糖。
進(jìn)一步地，所述的液體培養(yǎng)基中還包括0mmol/l-15mmol/l的l-半胱氨酸。
更進(jìn)一步地，所述的液體培養(yǎng)基中還包括5mmol/l-10mmol/l的l-半胱氨酸。
最優(yōu)選地，所述的液體培養(yǎng)基中還包括5mmol/l的l-半胱氨酸。
進(jìn)一步地，每1l所述液體培養(yǎng)基中還包括4g蛋白胨，1g酵母提取物，2g牛肉膏，4gnacl，1.0gk2hpo4，0.2gmgcl2·6h2o。
進(jìn)一步地，所述接種是是每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1。
更進(jìn)一步地，所述接種是是每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.1g銅綠假單胞菌pao1。
進(jìn)一步地，所述密封培養(yǎng)的過程中采用搖床或者磁力攪拌器攪拌培養(yǎng)。
更進(jìn)一步地，所述搖床培養(yǎng)的條件為：35℃，轉(zhuǎn)速170rpm。
更進(jìn)一步地，所述磁力攪拌器攪拌的條件為：35℃、3cm磁力攪拌子、轉(zhuǎn)速為70rpm。
進(jìn)一步地，所述共培養(yǎng)是按照如下步驟進(jìn)行的：
進(jìn)一步地，所述哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3的菌粉可以通過如下方法獲得，采用厭氧培養(yǎng)法，具體為：采用經(jīng)過滅菌后的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3，將接種后的厭氧瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)至培養(yǎng)瓶底部形成白色球狀菌膠團(tuán)且上清液澄清，離心，棄除上清液，冷凍干燥，獲得哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3的菌粉；其中每1l所述液體培養(yǎng)基中包括10g葡萄糖，3g蛋白胨，3gnacl，1.0gk2hpo4，0.2gmgcl2·6h2o，0.2％(體積)刃天青0.2ml，l-半胱氨酸0.5g，微量元素和維生素。
進(jìn)一步地，所述銅綠假單胞菌pao1的菌粉可以通過如下方法獲得，采用好氧培養(yǎng)法，具體為：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)銅綠假單胞菌pao1，將接種后的錐形瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2，離心，棄除上清液，冷凍干燥，獲得銅綠假單胞菌pao1的菌粉；其中每1l所述液體培養(yǎng)基中包括10g蛋白胨，3g酵母提取物，4gnacl，微量元素和維生素。
本發(fā)明利用兼性菌消耗密閉系統(tǒng)中的氧氣，為厭氧產(chǎn)氫菌提供適宜的生存環(huán)境，使得產(chǎn)氫菌可以在未經(jīng)厭氧處理的培養(yǎng)體系中進(jìn)行產(chǎn)氫，碳源可以使用只有產(chǎn)氫菌可以利用的蔗糖或乳糖，因此減輕了底物競(jìng)爭(zhēng)；本發(fā)明l-半胱氨酸為一種重要的還原劑，加入體系中可以提高產(chǎn)氫速率并在一定范圍內(nèi)可以提高氫氣產(chǎn)率，但在傳統(tǒng)方法的煮沸和曝氣過程中，此種試劑會(huì)有很大程度的損失(10％－40％)。
本發(fā)明有益效果：
本發(fā)明為產(chǎn)氫細(xì)菌的培養(yǎng)提供了一種新途徑，本發(fā)明利用兼性菌與嚴(yán)格厭氧的產(chǎn)氫細(xì)菌使用未經(jīng)厭氧處理的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)制取氫氣，與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明省略了煮沸和曝氣過程，避免了煮沸和曝氣過程中的試劑損失。本發(fā)明在發(fā)酵過程中由于瓶中的氧氣被兼性菌消耗，在密閉的體系中，此部分負(fù)壓由后續(xù)生成的氫氣和二氧化碳填補(bǔ)，因此最終收集得到的氫氣純度更高，產(chǎn)率更大，并具有操作簡(jiǎn)便，適合擴(kuò)大化的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明大大提高了產(chǎn)氫速率和產(chǎn)率，以15g/l蔗糖為碳源，添加5mmol/ll-半胱氨酸，在培養(yǎng)20h左右開始產(chǎn)生氫氣，40h左右達(dá)到最大產(chǎn)氫速率72.6ml/l-培養(yǎng)基·h，整個(gè)過程的平均產(chǎn)氫速率為38.3ml/l-培養(yǎng)基·h，最終可獲得的氫氣產(chǎn)率為2.58mol-氫氣/mol-蔗糖。
加大l-半胱氨酸的濃度可獲得更大的產(chǎn)氣速率，但會(huì)犧牲一定的氫氣轉(zhuǎn)化率，本發(fā)明培養(yǎng)基c中l(wèi)-半胱氨酸采用5mmol/l～10mmol/l的濃度，既可以獲得較大的產(chǎn)氫速率，又能獲得較大的氫氣轉(zhuǎn)化率，如以10g/l葡萄糖為碳源(底物)，平均產(chǎn)氫速率20.3ml/l-培養(yǎng)基·h～26.2ml/l-培養(yǎng)基·h，最大產(chǎn)氫速率38.7ml/l-培養(yǎng)基·h～50.7ml/l-培養(yǎng)基·h，氫氣轉(zhuǎn)化率為0.97mol-氫氣/mol-葡萄糖～1.05mol-氫氣/mol-葡萄糖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。
以下實(shí)施例中哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(ethanoligenensharbinense)yuan-3和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1
實(shí)施例1：以蔗糖為碳源進(jìn)行共培養(yǎng)產(chǎn)氫
本實(shí)施例提供了一種利用哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(ethanoligenensharbinense)yuan-3和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1呼吸互作好氧制氫氣的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)：
一、采用厭氧培養(yǎng)法培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基a培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3，將接種后的厭氧瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，40小時(shí)后在培養(yǎng)瓶底部凝集形成白色球狀菌膠團(tuán)，上清液保持澄清，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄除上清液；
二、采用好氧培養(yǎng)法培養(yǎng)銅綠假單胞菌pao1：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基b培養(yǎng)銅綠假單胞菌，將接種后的錐形瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，4小時(shí)后在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄除上清液；
三、將步驟一處理后的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和步驟二處理后的銅綠假單胞菌pao1冷凍干燥，然后將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和銅綠假單胞菌pao1接種(接種是每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1)至經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基c中，放置在35℃恒溫室培養(yǎng)，用多通道磁力攪拌器攪拌(3cm磁力攪拌子、轉(zhuǎn)速170rmp)，瓶口用一次性使用靜脈輸液針連接氣袋，根據(jù)不同的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，在培養(yǎng)1～50小時(shí)后即可開始產(chǎn)氣，收集氫氣。
本實(shí)施例中步驟一、二和三中的培養(yǎng)基a,b,c在配置完成后需經(jīng)過120攝氏度高壓蒸汽滅菌，維持時(shí)間為15分鐘。
本實(shí)施例步驟一中培養(yǎng)yuan-3的時(shí)間不局限于40小時(shí)，培養(yǎng)達(dá)到細(xì)菌凝集成白色球狀菌膠團(tuán)沉積在底部，上清液澄清時(shí)即可用于步驟三的接種。步驟二中培養(yǎng)pao1的時(shí)間不局限于4小時(shí)，培養(yǎng)達(dá)到菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2即可用于步驟三的接種。
本實(shí)施例步驟三中多通道磁力攪拌器攪拌還可以采用搖床培養(yǎng)的方式替代，培養(yǎng)條件為35℃、170r/min。步驟一和步驟二中的恒溫?fù)u床培養(yǎng)也可采用磁力攪拌的方式替代。
步驟一中培養(yǎng)基a由葡萄糖、蛋白胨、nacl、k2hpo4、mgcl2·6h2o、刃天青(0.2％體積)、l-半胱氨酸、維生素、微量元素和水組成，其中每1l培養(yǎng)基a中含有10g葡萄糖,3g的蛋白胨,3g的nacl，1.0g的k2hpo4,0.2g的mgcl2·6h2o，刃天青(0.2％)0.2ml，0.5gl半胱氨酸。
步驟二中培養(yǎng)基b由蛋白胨，酵母提取物，nacl、維生素、微量元素和水組成，其中：每1l培養(yǎng)基b含有10g的蛋白胨，3g的酵母提取物，4g的nacl。
步驟三中培養(yǎng)基c由蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、nacl、k2hpo4,、mgcl2·6h2o、l-半胱氨酸、維生素、微量元素和水組成，其中：每1l培養(yǎng)基c中含有10g-20g的蔗糖,4g的蛋白胨,1g的酵母提取物,2g的牛肉膏,4g的nacl，1.0g的k2hpo4,0.2g的mgcl2·6h2o，5mmol-10mmol的l-半胱氨酸；其中蔗糖可以在10g-20g內(nèi)任意取值，l-半胱氨酸可以在5mmol-10mmol內(nèi)任意取值，均可以獲得較好的產(chǎn)氫效果，其中5mmol時(shí)產(chǎn)氫效果最好，本實(shí)施例以蔗糖為15g/l、l-半胱氨酸為5mmol，其他組分如上所述為例進(jìn)行說明。
培養(yǎng)基a和c中微量元素以g/l計(jì)，由如下成分組成：mgso4·7h2o3,feso4·7h2o0.1，znso4·7h2o0.1,h3bo30.01,n(ch2cooh)31.5,cacl2·2h2o0.1,na2moo40.01,cocl2·6h2o0.1,nicl2·6h2o0.024，na2wo4·2h2o0.025，mnso4·h2o0.5，cuso4·5h2o0.01，kal(so4)2·12h2o0.01，nacl1；維生素以g/l計(jì)，由如下成分組成：核黃素0.025，檸檬酸0.02，葉酸0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。
培養(yǎng)基a的配置方法為：先加入除l-半胱氨酸外的所有試劑，煮沸后稍做冷卻再加入l-半胱氨酸，溶解繼續(xù)煮沸，定容后將a分裝到250ml厭氧瓶中，每瓶100ml。用多通道曝氣針將高純氮?dú)馄厝肱囵B(yǎng)液中，直到培養(yǎng)液由暗紅色變?yōu)橄銠壣€(wěn)定五分鐘后將氣針取出，瓶口封死。
培養(yǎng)基b的配置方法為：溶解后將b分裝到150ml錐形瓶中，每瓶50ml，用皮筋將無菌透氣封口膜封在瓶口。
培養(yǎng)基c的配置方法為：溶解后將c分裝到250ml厭氧瓶中，每瓶100ml，直接封死。
本實(shí)施例在步驟一、二成功活化培養(yǎng)兩種細(xì)菌，在步驟三混合接種后，以蔗糖作為碳源的在培養(yǎng)20h左右開始產(chǎn)生氫氣，40h左右達(dá)到最大產(chǎn)氫速率，為72.6ml/l-培養(yǎng)基·h，整個(gè)過程的平均產(chǎn)氫速率為38.3ml/l-培養(yǎng)基·h，最終可獲得的氫氣產(chǎn)率為2.58mol-氫氣/mol-蔗糖。
本實(shí)施例中步驟三所述接種是以每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.1g銅綠假單胞菌pao1為例，開始產(chǎn)氫時(shí)間最短，能夠較早產(chǎn)氫，本實(shí)施例中還可以按照每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1進(jìn)行接種，兩種菌可以在上述范圍內(nèi)任意取值組合進(jìn)行產(chǎn)氫，均能獲得較好的產(chǎn)氫效果。
實(shí)施例2：以乳糖為碳源進(jìn)行共培養(yǎng)產(chǎn)氫
本實(shí)施例提供了一種利用哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(ethanoligenensharbinense)yuan-3和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1呼吸互作好氧制氫氣的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)：
一、采用厭氧培養(yǎng)法培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基a培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3，將接種后的厭氧瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，40小時(shí)后在培養(yǎng)瓶底部凝集形成白色小球，上清液保持澄清，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄除上清液，；
二、采用好氧培養(yǎng)法培養(yǎng)銅綠假單胞菌pao1：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基b培養(yǎng)銅綠假單胞菌，將接種后的錐形瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，4小時(shí)后在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄除上清液；
三、將步驟一處理后的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和步驟二處理后的銅綠假單胞菌pao1冷凍干燥，將步驟一處理后的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和步驟二處理后的銅綠假單胞菌pao1冷凍干燥，然后將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和銅綠假單胞菌pao1接種(接種是每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1)至經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基c中，放置在35℃恒溫室培養(yǎng)，用多通道磁力攪拌器攪拌(3cm磁力攪拌子、轉(zhuǎn)速170rmp)，瓶口用一次性使用靜脈輸液針連接氣袋，根據(jù)不同的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，在培養(yǎng)1～50小時(shí)后即可開始產(chǎn)氣，收集氫氣。
本實(shí)施例中步驟一、二和三中的培養(yǎng)基a,b,c在配置完成后需經(jīng)過120攝氏度高壓蒸汽滅菌，維持時(shí)間為15分鐘。
本實(shí)施例步驟一中培養(yǎng)yuan-3的時(shí)間不局限于40小時(shí)，培養(yǎng)達(dá)到細(xì)菌凝集成白色小球沉積在底部，上清液澄清時(shí)即可用于步驟三的接種。步驟二中培養(yǎng)pao1的時(shí)間不局限于4小時(shí)，培養(yǎng)達(dá)到菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2即可用于步驟三的接種。
本實(shí)施例步驟三中多通道磁力攪拌器攪拌還可以采用搖床培養(yǎng)的方式替代，培養(yǎng)條件為35℃、170r/min。步驟一和步驟二中的恒溫?fù)u床培養(yǎng)也可采用磁力攪拌的方式替代。
步驟一中培養(yǎng)基a由葡萄糖、蛋白胨、nacl、k2hpo4、mgcl2·6h2o、刃天青(0.2％體積)、l-半胱氨酸、維生素、微量元素和水組成，其中每1l培養(yǎng)基a中含有10g葡萄糖,3g的蛋白胨,3g的nacl，1.0g的k2hpo4,0.2g的mgcl2·6h2o，刃天青(0.2％)0.2ml，0.5gl半胱氨酸。
步驟二中培養(yǎng)基b由蛋白胨，酵母提取物，nacl、維生素、微量元素和水組成，其中：每1l培養(yǎng)基b含有10g的蛋白胨，3g的酵母提取物，4g的nacl。
步驟三中培養(yǎng)基c由乳糖、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、nacl、k2hpo4,、mgcl2·6h2o、l-半胱氨酸、維生素、微量元素和水組成，其中：每1l培養(yǎng)基c中含有10g-20g的乳糖,4g的蛋白胨,1g的酵母提取物,2g的牛肉膏,4g的nacl，1.0g的k2hpo4,0.2g的mgcl2·6h2o，5mmol-10mmol的l-半胱氨酸；其中乳糖可以在10g-20g內(nèi)任意取值，l-半胱氨酸可以在5mmol-10mmol內(nèi)任意取值，均可以獲得較好的產(chǎn)氫效果，其中5mmol/l時(shí)產(chǎn)氫效果最好，本實(shí)施例以乳糖為15g/l、l-半胱氨酸為5mmol/l，其他組分如上所述為例進(jìn)行說明。
培養(yǎng)基a和c中微量元素以g/l計(jì)，由如下成分組成：mgso4·7h2o3,feso4·7h2o0.1，znso4·7h2o0.1,h3bo30.01,n(ch2cooh)31.5,cacl2·2h2o0.1,na2moo40.01,cocl2·6h2o0.1,nicl2·6h2o0.024，na2wo4·2h2o0.025，mnso4·h2o0.5，cuso4·5h2o0.01，kal(so4)2·12h2o0.01，nacl1；維生素以g/l計(jì)，由如下成分組成：核黃素0.025，檸檬酸0.02，葉酸0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。
培養(yǎng)基a的配置方法為：先加入除l-半胱氨酸外的所有試劑，煮沸后稍做冷卻再加入l-半胱氨酸，溶解繼續(xù)煮沸，定容后將a分裝到250ml厭氧瓶中，每瓶100ml。用多通道曝氣針將高純氮?dú)馄厝肱囵B(yǎng)液中，直到培養(yǎng)液由暗紅色變?yōu)橄銠壣?，穩(wěn)定五分鐘后將氣針取出，瓶口封死。
培養(yǎng)基b的配置方法為：溶解后將b分裝到150ml錐形瓶中，每瓶50ml，用皮筋將無菌透氣封口膜封在瓶口。
培養(yǎng)基c的配置方法為：溶解后將c分裝到250ml厭氧瓶中，每瓶100ml，直接封死。
本實(shí)施方式在步驟一、二成功活化培養(yǎng)兩種細(xì)菌，在步驟三混合接種后，以乳糖作為碳源的在培養(yǎng)40h左右開始產(chǎn)生氫氣，但初期產(chǎn)氣速率上升緩慢，160h左右達(dá)到最大產(chǎn)氫速率，為53.0ml/l-培養(yǎng)基·h，整個(gè)過程的平均產(chǎn)氫速率為18.6ml/l-培養(yǎng)基·h，最終可獲得的氫氣產(chǎn)率為2.43mol-氫氣/mol-乳糖。
本實(shí)施例中步驟三所述接種是以每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.1g銅綠假單胞菌pao1為例，開始產(chǎn)氫時(shí)間最短，能夠較早產(chǎn)氫，本實(shí)施例中還可以按照每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1進(jìn)行接種，兩種菌可以在上述范圍內(nèi)任意取值組合進(jìn)行產(chǎn)氫，均能獲得較好的產(chǎn)氫效果。
實(shí)施例3：以葡萄糖為底物發(fā)酵產(chǎn)氫
本實(shí)施例提供了一種利用哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌(ethanoligenensharbinense)yuan-3和銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)pao1呼吸互作好氧制氫氣的方法，按以下步驟實(shí)現(xiàn)：
一、采用厭氧培養(yǎng)法培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基a培養(yǎng)哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3，將接種后的厭氧瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，40小時(shí)后在培養(yǎng)瓶底部凝集形成白色小球，上清液保持澄清，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄除上清液，；
二、采用好氧培養(yǎng)法培養(yǎng)銅綠假單胞菌pao1：采用經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基b培養(yǎng)銅綠假單胞菌，將接種后的錐形瓶放在恒溫?fù)u床里在35℃、170rpm下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，4小時(shí)后在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2，8000轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄除上清液；
三、將步驟一處理后的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和步驟二處理后的銅綠假單胞菌pao1冷凍干燥，將步驟一處理后的哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和步驟二處理后的銅綠假單胞菌pao1冷凍干燥，然后將哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和銅綠假單胞菌pao1接種(接種是每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1)至經(jīng)過高溫蒸汽滅菌后的液體培養(yǎng)基c中，放置在35℃恒溫室培養(yǎng)，用多通道磁力攪拌器攪拌(3cm磁力攪拌子、轉(zhuǎn)速170rmp)，瓶口用一次性使用靜脈輸液針連接氣袋，根據(jù)不同的細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)，在培養(yǎng)1～50小時(shí)后即可開始產(chǎn)氣，收集氫氣。
本實(shí)施例中步驟一、二和三中的培養(yǎng)基a,b,c在配置完成后需經(jīng)過120攝氏度高壓蒸汽滅菌，維持時(shí)間為15分鐘。
本實(shí)施例步驟一中培養(yǎng)yuan-3的時(shí)間不局限于40小時(shí)，培養(yǎng)達(dá)到細(xì)菌凝集成白色小球沉積在底部，上清液澄清時(shí)即可用于步驟三的接種。步驟二中培養(yǎng)pao1的時(shí)間不局限于4小時(shí)，培養(yǎng)達(dá)到菌液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度達(dá)到0.9～1.2即可用于步驟三的接種。
本實(shí)施例步驟三中多通道磁力攪拌器攪拌還可以采用搖床培養(yǎng)的方式替代，培養(yǎng)條件為35℃、170r/min。步驟一和步驟二中的恒溫?fù)u床培養(yǎng)也可采用磁力攪拌的方式替代。
步驟一中培養(yǎng)基a由葡萄糖、蛋白胨、nacl、k2hpo4、mgcl2·6h2o、刃天青(0.2％體積)、l-半胱氨酸、維生素、微量元素和水組成，其中每1l培養(yǎng)基a中含有10g葡萄糖,3g的蛋白胨,3g的nacl，1.0g的k2hpo4,0.2g的mgcl2·6h2o，刃天青(0.2％)0.2ml，0.5gl半胱氨酸。
步驟二中培養(yǎng)基b由蛋白胨，酵母提取物，nacl、維生素、微量元素和水組成，其中：每1l培養(yǎng)基b含有10g的蛋白胨，3g的酵母提取物，4g的nacl。
步驟三中培養(yǎng)基c由葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏、nacl、k2hpo4,、mgcl2·6h2o、l-半胱氨酸、維生素、微量元素和水組成，其中：每1l培養(yǎng)基c中含有10g-20g的葡萄糖,4g的蛋白胨,1g的酵母提取物,2g的牛肉膏,4g的nacl，1.0g的k2hpo4,0.2g的mgcl2·6h2o，5mmol-10mmol的l-半胱氨酸；其中葡萄糖可以在10g-20g內(nèi)任意取值，l-半胱氨酸可以在5mmol-10mmol內(nèi)任意取值，均可以獲得較好的產(chǎn)氫效果。
培養(yǎng)基a和c中微量元素以g/l計(jì)，由如下成分組成：mgso4·7h2o3,feso4·7h2o0.1，znso4·7h2o0.1,h3bo30.01,n(ch2cooh)31.5,cacl2·2h2o0.1,na2moo40.01,cocl2·6h2o0.1,nicl2·6h2o0.024，na2wo4·2h2o0.025，mnso4·h2o0.5，cuso4·5h2o0.01，kal(so4)2·12h2o0.01，nacl1；維生素以g/l計(jì)，由如下成分組成：核黃素0.025，檸檬酸0.02，葉酸0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。
培養(yǎng)基a的配置方法為：先加入除l-半胱氨酸外的所有試劑，煮沸后稍做冷卻再加入l-半胱氨酸，溶解繼續(xù)煮沸，定容后將a分裝到250ml厭氧瓶中，每瓶100ml。用多通道曝氣針將高純氮?dú)馄厝肱囵B(yǎng)液中，直到培養(yǎng)液由暗紅色變?yōu)橄銠壣€(wěn)定五分鐘后將氣針取出，瓶口封死。
培養(yǎng)基b的配置方法為：溶解后將b分裝到150ml錐形瓶中，每瓶50ml，用皮筋將無菌透氣封口膜封在瓶口。
培養(yǎng)基c的配置方法為：溶解后將c分裝到250ml厭氧瓶中，每瓶100ml，直接封死。
本實(shí)施方式在步驟一、二成功活化培養(yǎng)兩種細(xì)菌，在步驟三混合接種后，以乳糖作為碳源的在培養(yǎng)40h左右開始產(chǎn)生氫氣，但初期產(chǎn)氣速率上升緩慢，160h左右達(dá)到最大產(chǎn)氫速率，為53.0ml/l-培養(yǎng)基·h，整個(gè)過程的平均產(chǎn)氫速率為18.6ml/l-培養(yǎng)基·h，最終可獲得的氫氣產(chǎn)率為2.43mol-氫氣/mol-乳糖。
本實(shí)施例中步驟三所述接種是以每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.1g銅綠假單胞菌pao1為例，開始產(chǎn)氫時(shí)間最短，能夠較早產(chǎn)氫，本實(shí)施例中還可以按照每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g-0.2g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.08g-0.12g銅綠假單胞菌pao1進(jìn)行接種，兩種菌可以在上述范圍內(nèi)任意取值組合進(jìn)行產(chǎn)氫，均能獲得較好的產(chǎn)氫效果。
為了考察不同葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)氫效果的影響，本實(shí)施例在l-半胱氨酸濃度10mmol/l、每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.1g銅綠假單胞菌pao1的條件下，葡萄糖濃度g/l分別取10、15、20，其他步驟按照上述方法進(jìn)行，如表1所示說明不同葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)氫效果的影響。
表1不同葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)氫效果的影響
由表一可知，適當(dāng)增加底物濃度可增加氫氣產(chǎn)率，但底物利用率和最大產(chǎn)氫速率會(huì)受到不利影響，為獲得更高的氫氣產(chǎn)率，15g/l的葡萄糖為最適宜濃度。
為了考察不同l-半胱氨酸濃度對(duì)產(chǎn)氫效果的影響，本實(shí)施例在葡萄糖濃度為10g/l的條件下，每1l液體培養(yǎng)基中接入0.1g哈爾濱產(chǎn)乙醇桿菌yuan-3和0.1g銅綠假單胞菌pao1的條件下，l-半胱氨酸濃度(mmol/l)分別取0、5、10、15，其他步驟按照上述方法進(jìn)行，說明不同l-半胱氨酸濃度對(duì)產(chǎn)氫效果的影響。檢測(cè)結(jié)果如表2所示。
表2不同l-半胱氨酸濃度對(duì)產(chǎn)氫效果的影響
由表2可知：增加l-半胱氨酸濃度可以增加最大產(chǎn)氫速率，減少產(chǎn)氣時(shí)長(zhǎng)，并且在l-半胱氨酸濃度為5mmol/l時(shí)得到最大的氫氣產(chǎn)率。
本實(shí)施例與實(shí)施例1或2不同的是，若想獲得更大的生物量，l-半胱氨酸濃度可以選用更大直到15mmol/l的濃度，但會(huì)犧牲一部分氫氣產(chǎn)率。在葡萄糖濃度為15g/l，l-半胱氨酸濃度為5mmol/l的條件下，本實(shí)施方式在培養(yǎng)10h左右開始產(chǎn)生氫氣，最終可獲得的氫氣產(chǎn)率為1.11mol-氫氣/mol-葡萄糖。
雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。