本發(fā)明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種制備神經(jīng)干細胞的方法。

背景技術：

神經(jīng)干細胞是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，它可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細胞。根據(jù)分化潛能的時序分為：主要存在胚胎時期的神經(jīng)管上皮細胞、放射狀膠質神經(jīng)元和神經(jīng)母細胞，其中，放射狀膠質神經(jīng)元主要存在于幼年時期，可以分裂并同時產(chǎn)生神經(jīng)元前體細胞或是膠質細胞；神經(jīng)母細胞主要存在于成年動物體中，可以產(chǎn)生神經(jīng)前體細胞、神經(jīng)元和各類神經(jīng)膠質細胞。根據(jù)部位主要分兩類：神經(jīng)嵴干細胞和中樞神經(jīng)干細胞。目前將具有分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞及少突膠質細胞的能力，能自我更新并足以提供大量腦組織細胞的細胞都統(tǒng)稱為神經(jīng)干細胞。

在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療方面，除了傳統(tǒng)的藥物、手術及康復治療外，近年來細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究得到了廣泛開展，主要包括骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞與神經(jīng)干細胞移植等。2009年，研究者成功的將人胚胎干細胞注射到脊髓損傷的大鼠體內(nèi)，從而使大鼠恢復了運動能力，但直接注射胚脂干細胞存在形成腫瘤的風險，經(jīng)過大量實驗證明，利用神經(jīng)干細胞進行細胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病是有效且安全的選擇，神經(jīng)干細胞不具有成瘤性，具有向神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞分化的潛能；是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，不被免疫系統(tǒng)識別，具有低免疫源性；其組織融合性好，可以與宿主的神經(jīng)組織良好融合，并在宿主體內(nèi)長期存活，是最理想的細胞移植材料。因此，業(yè)內(nèi)一直致力于神經(jīng)干細胞的臨床應用研究。

神經(jīng)干細胞可以由胚胎干細胞、誘導多能干細胞和其它干細胞分化而來。胚胎干細胞是從哺乳動物的囊胚內(nèi)細胞群和原始的生殖細胞著床前胚胎內(nèi)細胞團中分離出來的一種全能性的多功能神經(jīng)干細胞，這種細胞可以在體外進行擴增培養(yǎng)，因此，提供無致瘤性、且能夠在體外快速增殖、穩(wěn)定傳代、大量培養(yǎng)神經(jīng)干細胞成為目前的當務之急。

神經(jīng)干細胞的體外培養(yǎng)一直是一個比較困難的課題，其難點在于兩點，一是所需試劑和因子的濃度配比需要摸索，花費了大量的時間和精力才能達到最佳的配方；二是傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)是通過懸浮培養(yǎng)神經(jīng)球，觀察神經(jīng)球數(shù)量倍增后，通過離心，擴瓶培養(yǎng)達到傳代的目的。這種懸浮培養(yǎng)的方法，神經(jīng)干細胞增殪緩慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很難收獲大量的神經(jīng)干細胞。因此這使得相關的科研工作者很難得到大量的神經(jīng)干細胞來進行相關的研究工作。為解決傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞體外培養(yǎng)是通過懸浮培養(yǎng)神經(jīng)球，觀察神經(jīng)球數(shù)量倍增后，通過離心，擴瓶培養(yǎng)達到傳代的目的，這種懸浮培養(yǎng)的方法，神經(jīng)干細胞增殖緩慢，而且活力很差，非常容易凋亡，很難收獲大量的神經(jīng)干細胞等問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種制備神經(jīng)干細胞的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明制備神經(jīng)干細胞的方法，包括如下步驟：

l、在無菌條件取得腦神經(jīng)組織放入神經(jīng)組織保存液中，并在4～12。c的溫度條件下密封保存；

2、將步驟l中的神經(jīng)組織從神經(jīng)組織保存滾中取出，并使用神經(jīng)組織洗滌液漂洗；

3、將步驟2中漂洗后的神經(jīng)組織切成碎塊，并加入2-3倍體積的神經(jīng)組織分解液，同時放入35～40。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化分解45～60分鐘，每隔3～5分鐘取出震蕩一次；

4、向步驟3中消化分解后的液體中加入繼代細胞培養(yǎng)液，均勻混合后，混合液通過200目的細胞篩，收集過濾液，并使過濾液在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘，其中，繼代細胞培養(yǎng)液是神經(jīng)組織分解液體積的2倍；

5、離心后的過濾液去掉上清液，加入原代細胞培養(yǎng)液，使溶液中的細胞濃度為2×105個／毫升，并保持溶液中細胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)后即得到po代神經(jīng)干細胞。

進一步的，利用步驟5中培養(yǎng)得到的po代神經(jīng)干細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)的方法包括以下步驟：

(1)pl代神經(jīng)干細胞的懸浮培養(yǎng)：①繼續(xù)培養(yǎng)po代神經(jīng)干細胞，當po代神經(jīng)干細胞聚集成球后，將其在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘；②離心后的培養(yǎng)液去掉上清液，加入繼代細胞培養(yǎng)液，并使培養(yǎng)液中的細胞濃度為1×105個／毫升，接種培養(yǎng)后即得到pl代神經(jīng)干細胞；

(2)p2代神經(jīng)干細胞的貼壁培養(yǎng)：繼續(xù)培養(yǎng)pl代神經(jīng)干細胞，當pl代神經(jīng)干細胞密度達到80%時，將繼代細胞培養(yǎng)液倒出，加入細胞洗滌液，震蕩洗滌后將細胞洗滌液倒出，重復洗滌2次后，加入細胞消化液，同時放入35～40。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化30秒后取出，加入繼代細胞培養(yǎng)液貼壁傳代培養(yǎng)后即得到p2代神經(jīng)干細胞；

(3)p3代神經(jīng)干細胞的貼壁培養(yǎng)：①繼續(xù)培養(yǎng)p2代神經(jīng)干細胞，p2代神經(jīng)干細胞密度達到80%時，將繼代細胞培養(yǎng)液倒出，加入細胞洗滌液，震蕩洗滌后將細胞洗滌液倒出，重復洗滌2次后，加入細胞消化液，同時放入35～40。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化30秒后取出，加入繼代細胞培養(yǎng)液并使細胞懸浮，將培養(yǎng)液在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘，去掉上清液，再次將培養(yǎng)液在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘，去掉上清液，加入細胞凍存液，使培養(yǎng)液中的細胞濃度為1×l05～3×105個／亳升，并將培養(yǎng)液在-80。c的溫度條件下凍存；②取出凍存的p2代神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液，放入至37～42。c水浴鍋中快速震蕩使其融化，加入繼代細胞培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)后即得到p3代神經(jīng)干細胞。

其中，繼代細胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細胞的含血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎培養(yǎng)基、50～250ug/ml的胎牛血清、10～20ng/ml的bfgf、10～20ng/ml的egf、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。所述神經(jīng)組織保存液為含有鏈霉素50～250ug/ml、青霉素50～250ug/ml的rpmi-1640、dmem、q-mem、dmem/f12中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織洗滌液為含有青霉素50～250ug/ml、鏈霉素50～250ug/ml的生理鹽水、pbs、d-hanks中的一種。神經(jīng)組級分解液為含膠原酶i／膠原酶iv1～2mg/ml、脫氧核糖核酸10.1～0.2mg／ml的dmem、dmem/f12、mem、rpmi-1640中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。

細胞洗滌液為pbs/d-hanks。原代細胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細胞的無血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎培養(yǎng)基、10～20ng/ml的bfgf、10～20ng/ml的egf、15～25ug/ml的b27、10～15ug/ml的n2、0.5～2.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5～2.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。細胞消化液為含1.5～2.5mg/ml的胰蛋白酶、0.1～0.25mg/ml的edta的pbs。細胞凍存液為含dms050～200mg／ml的神經(jīng)干細胞胎牛血清生長培養(yǎng)基。

本發(fā)明的優(yōu)點是：提供了一種更加穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)方法，通過原代神經(jīng)干細胞懸浮培養(yǎng)，達到純化細胞的目的，之后加入血清進行細胞貼壁培養(yǎng)，極大的加強了神經(jīng)干細胞的活性，提高了神經(jīng)干細胞的增殖速度。使神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)更加的穩(wěn)定，更容易建成相應的神經(jīng)干細胞系，可以收獲大量的神經(jīng)干細胞而不會出現(xiàn)像傳統(tǒng)培養(yǎng)方法那樣因沒有足夠的神經(jīng)干細胞而不能進行相關科研工作的尷尬情況，培養(yǎng)過程中可以更加直觀的觀察細胞動態(tài)，可以做一些懸浮細胞無法進行的鑒定工作，并且本發(fā)明的制備方法更加簡單，便于操作，節(jié)省了大量的工作時間，方法簡單，操作容易，非常適合科研工作的使用，節(jié)省了科研工作人員大量的時間和精力。

具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細描迷。

本發(fā)明實施例所采用的，包括神經(jīng)組織保存液、神經(jīng)組織洗滌液、神經(jīng)組織分解液、細胞洗滌液、原代細胞培養(yǎng)液、細胞消化液、繼代細胞培養(yǎng)液、細胞凍存液等，其中，繼代細胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細胞的含血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎培養(yǎng)基、50ug/ml的胎牛血清、long／ml的bfgf、long／ml的egf、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。繼代細胞培養(yǎng)液為獲得的神經(jīng)干細胞貼壁培養(yǎng)液，使神經(jīng)干細胞得以貼壁培養(yǎng)，具有更強的活性。所述的神經(jīng)組織保存液為含有鏈霉素50ug/ml、青霉素50ug／ml的rpmi-1640、dmem、a-mem、dmem/f12中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織保存液的作用是保證神經(jīng)組織在取樣后的活性以及滅菌。神經(jīng)組織洗滌液為含有青霉素50ug/ml、鏈霉素50ug/ml的生理鹽水、pbs、d-hanks中的一種。神經(jīng)組織洗滌液的作用是洗滌神經(jīng)組織并除去血液以及滅菌。神經(jīng)組織分解液為含膠原酶i／膠原酶ivlmg／ml、脫氧核糖核酸io.img／ml的dmem、dmem/f12、mem、rpmi-1640中的一種或兩種以上混合的培養(yǎng)基。神經(jīng)組織分解液的作用是消化神經(jīng)組織，獲得單細胞懸液。細胞洗滌液為pbs/d-hanks。細胞洗滌液的作用是洗滌獲得的干細胞去除各種液體殘留。原代細胞培養(yǎng)液為神經(jīng)干細胞的無血清生長培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由loooml的基礎培養(yǎng)基、long／ml的bfgf、long／ml的egf、15ug/ml的b27、loug／ml的n2、0.5mmol/ml的谷氨酰胺、0.5mmol/ml的丙酮酸鈉混合組成。原代細胞培養(yǎng)液為無血清生長培養(yǎng)基，用于懸浮神經(jīng)干細胞形成神經(jīng)球。細胞消化液為含1.5mg/ml的胰蛋白酶、0.img／ml的edta晌pbs。細胞消化液的作用是細胞傳代時，消化貼壁的神經(jīng)干細胞。細胞凍存液為含dms050mg/ml的神經(jīng)干細胞胎牛血清生長培養(yǎng)基。細胞凍存液的作用是凍存獲得的神經(jīng)干細胞。

其制備神經(jīng)干細胞的方法如下，

l、在無菌條件取得神經(jīng)組織放入神經(jīng)組織保存液中，并在4。c的溫度條件下密封保存；

2、將步驟l中的神經(jīng)組織從神經(jīng)組織保存液中取出，并使用神經(jīng)組織洗滌液漂洗；

3、將步驟2中漂洗后的腦神經(jīng)組織切成碎塊，并加入2倍體積的神經(jīng)組織分解液，同時放入35。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化分解45分鐘，每隔3分鐘取出震蕩一次；

4、向步驟3中消化分解后的液體中加入繼代細胞培養(yǎng)液，均勻混合盾，混合液通過200目的細胞篩，收集過濾液，并使過濾液在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘，其中，繼代細胞培養(yǎng)液是神經(jīng)組織分解液體積的2倍；

5、離心后的過濾液去掉上清液，加入原代細胞培養(yǎng)液，使溶液中的細胞濃度為2×105個／毫升，并保持溶液中細胞懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)后即得到po代神經(jīng)干細胞。

利用步驟5中培養(yǎng)得到的po代神經(jīng)干細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)的方法包括以下步驟：

(1)pl代神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)：①繼續(xù)培養(yǎng)po代神經(jīng)干細胞，當po代神經(jīng)干細胞聚集成球后，將其在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘；②離心后的培養(yǎng)液去掉上清液，加入繼代細胞培養(yǎng)液，并使培養(yǎng)液中的細胞濃度為l×105個／毫升，接種培養(yǎng)后即得到pl代神經(jīng)干細胞；

(2)p2代神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)：繼續(xù)培養(yǎng)pl代神經(jīng)干細胞，當pl代神經(jīng)干細胞密度5/11頁達到80%時，將繼代細胞培養(yǎng)液倒出，加入細胞洗滌液，震蕩洗滌后將細胞洗滌液倒出，重復洗滌2次后，加入細胞消化液，同時放入35。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化30秒后取出，加入繼代細胞培養(yǎng)液貼壁傳代培養(yǎng)后即得到p2代神經(jīng)干細胞；

(3)p3代神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)：①繼續(xù)培養(yǎng)p2代神經(jīng)干細胞，p2代神經(jīng)干細胞密度達到80%時，將繼代細胞培養(yǎng)液倒出，加入細胞洗滌液，震蕩洗滌后將細胞洗滌液倒出，重復洗滌2次后，加入細胞消化液，同時放入35。c的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化30秒后取出，加入

繼代細胞培養(yǎng)液并使細胞懸浮，將培養(yǎng)液在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘，去掉上清液，再次將培養(yǎng)液在1500轉／分鐘的條件下離心8分鐘，去掉上清液，加入細胞凍存液，使培養(yǎng)液中的細胞濃度為1×105個／毫升，并將培養(yǎng)液在-80。c的溫度條件下凍存；②取出凍存的p2代神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液，放入至37。c水浴鍋中快速震蕩使其融化，加入繼代細胞培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)后即得到p3代神經(jīng)干細胞。

本發(fā)明的培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)方法相比，原代細胞懸浮培養(yǎng)，而純化細胞之后，采取了貼壁培養(yǎng)的方式來獲得神經(jīng)干細胞。如此操作使得神經(jīng)干細胞的活性大大增強，使細胞的培養(yǎng)過程更加穩(wěn)定，使細胞可以進行更高代次的傳代甚至可以形成神經(jīng)干細胞系；可以收獲大量的神經(jīng)干細胞而不會出現(xiàn)像傳統(tǒng)培養(yǎng)方法那樣因沒有足夠的神經(jīng)干細胞而不能進行相關科研工作的尷尬情況；貼壁培養(yǎng)使得觀察細胞更直觀，可以做一些懸浮細胞無法進行的鑒定工作，如免疫組化等；并且本發(fā)明的制備方法更加簡單，便于操作，節(jié)省了大量的工作時間。

另外經(jīng)過試驗得知，使用實施例方法可以得到如下結果，可以在3周內(nèi)(21天)獲得pl代神經(jīng)干細胞2.3×107個，至p3代可得1×109個神經(jīng)干細胞，因此可以表明利用本試劑盒及該制備方法可以在短時間內(nèi)獲得大量的神經(jīng)干細胞。