本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法。

背景技術(shù)：

大豆胞囊線蟲(chóng)病(soybeancystnematode，scn)是由大豆胞囊線蟲(chóng)(heteroderaglycineslchinohe)引起的一種世界性大豆病害，在世界各大豆主要生產(chǎn)國(guó)如美國(guó)、巴西、阿根廷、中國(guó)等均廣泛分布。據(jù)統(tǒng)計(jì)，scn每年可造成大豆減產(chǎn)7％～10％，嚴(yán)重地塊可達(dá)15-50％，甚至絕產(chǎn)，每年造成約10-15億美元的經(jīng)濟(jì)損失。scn在我國(guó)東北和黃淮海大豆主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，其中又尤以黑龍江省、吉林省中西部及內(nèi)蒙古的鹽堿地、白漿土和沙壤土地發(fā)生較為嚴(yán)重，每年危害面積達(dá)2.0×106hm²以上。除危害大豆外，scn還危害小豆，赤小豆、飯豆、菜豆等170多種作物。

大豆胞囊線蟲(chóng)是一種定居型內(nèi)寄生線蟲(chóng)，主要通過(guò)2齡幼蟲(chóng)侵染大豆根部維管束，危害大豆生長(zhǎng)發(fā)育，造成植株發(fā)育不良，根系減少，根上附有白色的球狀物，莖和葉變淡黃色，豆莢和種子萎縮癟小，甚至不結(jié)莢。大豆胞囊線蟲(chóng)是嚴(yán)格的專性寄生物，存在明顯的寄主分化現(xiàn)象，不同生理小種致病性存在明顯差異。按照riggs等提出的分類標(biāo)準(zhǔn)，scn存在16個(gè)生理小種。目前在我國(guó)已發(fā)現(xiàn)1、2、3、4、5、7、14號(hào)小種，其中東北大豆產(chǎn)區(qū)主要是3號(hào)小種，另外還有1號(hào)、4號(hào)和14號(hào)；黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)主要以1號(hào)和4號(hào)小種為主。

scn作為一類土傳病害，其分布與大豆種植區(qū)域高度重疊，是一種極難防治的土傳病害。由于目前尚無(wú)有效可使用的化學(xué)殺線蟲(chóng)劑，生產(chǎn)上主要通過(guò)種植抗性品種和田間輪作控制scn的發(fā)生與危害。由于胞囊在土壤中存活時(shí)間較長(zhǎng)(9-10年)，采用輪作等方式雖然可以減少大豆產(chǎn)量損失，但并不能完全控制scn的危害，實(shí)際應(yīng)用效果有限。目前生產(chǎn)上利用的抗線蟲(chóng)大豆品種主要來(lái)源于peking、pi88788等少數(shù)幾個(gè)抗源品種，其中，具有peking或pi88788血緣的品種占所有抗線蟲(chóng)大豆品種的97％以上，抗性遺傳基礎(chǔ)極為狹窄。同時(shí)，由于大豆胞囊線蟲(chóng)生理小種較為復(fù)雜，易造成線蟲(chóng)產(chǎn)生抗性，目前已報(bào)道多個(gè)胞囊線蟲(chóng)生理小種對(duì)pi88788血緣的抗線蟲(chóng)品種產(chǎn)生了抗性。因此，如何進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型抗線蟲(chóng)資源，拓寬抗性資源遺傳基礎(chǔ)，加快抗線蟲(chóng)大豆品種的選育是我國(guó)抗病大豆育種中面臨的主要問(wèn)題之一。

rna沉默(rnainterference，rnai)是植物抵抗外來(lái)核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子等)入侵以保持自身基因組完整性的一種防御機(jī)制。雙鏈rna(double-strandedrna，dsrna)導(dǎo)入細(xì)胞后被切割成21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的短核苷酸雙鏈，在其它作用因子的參與下能夠特異地與其同源的mrna結(jié)合并導(dǎo)致該同源mrna降解，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源基因發(fā)生沉默。rnai作為一種簡(jiǎn)單有效的基因敲除的工具，已廣泛應(yīng)用于秀麗隱桿線蟲(chóng)(c.elegans)等多種線蟲(chóng)基因功能研究及轉(zhuǎn)基因研究。目前，國(guó)際上已完成基因組測(cè)序工作的線蟲(chóng)有10種(nematode.net)，其中2種為植物寄生線蟲(chóng)，包括北方根結(jié)線蟲(chóng)(meloidogynehapla)和南方根結(jié)線蟲(chóng)(m.incognita)。截至2011年，nematode.net數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)有超過(guò)一千萬(wàn)個(gè)ests序列和二十多萬(wàn)個(gè)來(lái)自50多種線蟲(chóng)的基因組序列。盡管目前h.glycines基因組測(cè)序工作尚未完成，但利用已有的ests數(shù)據(jù)庫(kù)信息，結(jié)合模式生物c.elegans生物學(xué)數(shù)據(jù)信息，篩選與大豆胞囊線蟲(chóng)寄生、發(fā)育及繁殖等相關(guān)的關(guān)鍵基因，開(kāi)展大豆胞囊線蟲(chóng)基因功能驗(yàn)證和轉(zhuǎn)基因研究提供了極大的便利。

目前已發(fā)現(xiàn)h.glycines和c.elegans基因組中共有8334個(gè)基因存在保守性，其中1508個(gè)基因在c.elegans中為致死基因。通過(guò)dsrna溶液浸泡或毛狀根表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步研究這些致死基因在h.glycines中的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)，抑制這些基因的表達(dá)可以顯著降低胞囊線蟲(chóng)的胞囊或雌蟲(chóng)數(shù)量。urwin等(2002)利用半胱氨酸蛋白酶編碼基因(hgcp-i)dsrna溶液浸泡線蟲(chóng)后，寄生胞囊線蟲(chóng)雌蟲(chóng)和胞囊數(shù)都顯著降低。klink等(2009)利用毛狀根表達(dá)系統(tǒng)研究了核糖體蛋白3a(hg-rps-3a)、核糖體蛋白4(hg-rps-4)、剪接體蛋白(hg-spk-1)及突觸小泡蛋白(hg-snb-1)的抑制表達(dá)對(duì)h.glycines的影響。結(jié)果表明，抑制上述4個(gè)基因的表達(dá)，均可以顯著降低毛狀根中胞囊線蟲(chóng)的雌蟲(chóng)數(shù)量。li等(2010)利用毛狀根表達(dá)系統(tǒng)對(duì)h.glycines的3個(gè)靶基因(y25、prp-17、cpn-1)進(jìn)行rnai研究表明，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因毛狀根中的胞囊數(shù)量降低79-95％。此外，huang等(2006年)將線蟲(chóng)寄生必需的分泌肽-16d10基因反向重復(fù)序列導(dǎo)入擬南芥，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)4種根結(jié)線蟲(chóng)均產(chǎn)生較高的抗性。steeves等(2006)將h.glycines精子蛋白基因msp的一段反向重復(fù)序列構(gòu)建到rnai表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化大豆。接種鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大豆植株根部胞囊數(shù)比對(duì)照降低68％?？梢?jiàn)，rnai介導(dǎo)h.glycines基因沉默技術(shù)不僅可以為胞囊線蟲(chóng)抗性育種研究提供了更為廣泛的抗源基因。同時(shí)，通過(guò)選擇高度保守的rnai靶序列，也為兼抗多個(gè)胞囊線蟲(chóng)生理小種提供了一條更為有效的技術(shù)途徑。

目前，有關(guān)rnai介導(dǎo)h.glycines基因沉默的研究主要集中在基因功能驗(yàn)證方面，尚未見(jiàn)到利用胞囊線蟲(chóng)hg-snb1基因片段培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)資料?；谏鲜隼斫?，本研究通過(guò)rnai介導(dǎo)胞囊線蟲(chóng)hg-snb1基因沉默，獲得了對(duì)scn抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因大豆。在此研究基礎(chǔ)上，提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，本發(fā)明對(duì)于培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)植物(特別是大豆)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法為將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。

其中，所述dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合形成培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述根特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)下游基因或dna片段在植物根中的特異性表達(dá)。

其中，該載體還包括含有dna片段的質(zhì)粒，dna片段包括dna片段1，dna片段2，以及位于所述dna片段1和dna片段2之間的間隔序列；且所述dna片段1和dna片段2反向互補(bǔ)。

其中，所述dna片段從上游至下游依次包括如下元件：根特異性啟動(dòng)子、dna片段1、間隔序列、dna片段2和終止子。

其中，所述在目標(biāo)植物中表達(dá)dna片段的實(shí)現(xiàn)方式有：將上述任一所述質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)植物。

其中，在轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中含有所述dna片段，其主要在植物根細(xì)胞中特異表達(dá)，并直接或間接調(diào)控寄生大豆胞囊線蟲(chóng)內(nèi)源基因的表達(dá)。

其中，所述目標(biāo)植物和轉(zhuǎn)基因植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物為大豆。

本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，本發(fā)明將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對(duì)于培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)植物(特別是大豆)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為重組質(zhì)粒pcambia3301-cpn1rnai的結(jié)構(gòu)示意圖

圖2為t1代pat/bar試紙條陽(yáng)性植株pcr鑒定結(jié)果.m：dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，1：質(zhì)粒pcambia3301-cpn1rnai，2：非轉(zhuǎn)化植株，3：ddh20對(duì)照，4～8為pat/bar試紙條陽(yáng)性植株c845、c815、c810、c842、c847圖

圖3為t1代轉(zhuǎn)基因大豆southern雜交鑒定結(jié)果.m：dna標(biāo)準(zhǔn)分子量，1：質(zhì)粒pcambia3301-cpn1rnai，2：非轉(zhuǎn)化植株，3～7為t1代轉(zhuǎn)基因植株c810、c815、c845、c842、c847.植物基因組dna(50μg)用ecori酶切后，用dig標(biāo)記cpn1基因探針進(jìn)行檢測(cè)圖；

圖4為t3代轉(zhuǎn)基因大豆植株接種大豆胞囊線蟲(chóng)3號(hào)生理小種鑒定圖；

圖5為dna片段的seq-1序列圖；

圖6為根特異性啟動(dòng)子的seq-2序列圖；

圖7為質(zhì)粒中dna片段的seq-3序列圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地表述本發(fā)明，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地描述。

本發(fā)明的培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法為將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。

在本實(shí)施例中，所述dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合形成培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述根特異性啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)下游基因或dna片段在植物根中的特異性表達(dá)。所述dna片段如圖5中的seq-1所示，所述根特異性啟動(dòng)子序列如圖6中的seq-2所示。

在本實(shí)施例中，該載體還包括含有dna片段的質(zhì)粒，dna片段包括dna片段1，dna片段2，以及位于所述dna片段1和dna片段2之間的間隔序列；且所述dna片段1和dna片段2反向互補(bǔ)。dna片段如圖7中的seq-3所示。

在本實(shí)施例中，所述dna片段從上游至下游依次包括如下元件：根特異性啟動(dòng)子、dna片段1、間隔序列、dna片段2和終止子。

在本實(shí)施例中，所述dna片段可以通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cdna片段，或是通過(guò)人工合成獲得；所述根特異性啟動(dòng)子可以通過(guò)pcr擴(kuò)增獲得，或是通過(guò)人工合成獲得。

在本實(shí)施例中，所述在目標(biāo)植物中表達(dá)dna片段的實(shí)現(xiàn)方式有：將上述任一所述質(zhì)粒導(dǎo)入目標(biāo)植物。

在本實(shí)施例中，在轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中含有所述dna片段，其主要在植物根細(xì)胞中特異表達(dá)，并直接或間接調(diào)控寄生大豆胞囊線蟲(chóng)內(nèi)源基因的表達(dá)。

在本實(shí)施例中，所述目標(biāo)植物和轉(zhuǎn)基因植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物為大豆。更具體可為栽培大豆，所述質(zhì)粒可通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、花粉管介導(dǎo)法等導(dǎo)入目標(biāo)植物。

本發(fā)明中dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合或是上述任一質(zhì)粒在培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。另外，dna片段與根特異性啟動(dòng)子的組合或是上述任一質(zhì)粒在制備大豆胞囊線蟲(chóng)生防制劑中的應(yīng)用。大豆胞囊線蟲(chóng)具體可為大豆胞囊線蟲(chóng)3號(hào)生理小種，盡管本發(fā)明僅利用大豆胞囊線蟲(chóng)3生理號(hào)小種進(jìn)行了接種鑒定，但所述dna片段為保守序列，具有廣譜性，所以對(duì)其它大豆胞囊線蟲(chóng)生理小種也具有相同的抑制效果。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，具有如下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明將dna片段與根特異性啟動(dòng)子組合導(dǎo)入目標(biāo)植物，使所述dna片段主要在目標(biāo)植物根中特異表達(dá)，獲得對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)抗性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對(duì)于培育抗大豆胞囊線蟲(chóng)植物(特別是大豆)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法。實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可通過(guò)商業(yè)途徑獲得。

質(zhì)粒phannibal-attb1：公眾可以從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所獲得。

質(zhì)粒pcambia3301：公眾可以從商業(yè)途徑獲得。

栽培大豆品種williams82：公眾可以從國(guó)家作物種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.cgris.net/query/croplist.php)獲得。

大豆胞囊線蟲(chóng)3號(hào)生理小種：為我國(guó)東北大豆產(chǎn)區(qū)scn主要生理小種，公眾可以從吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得。參考文獻(xiàn)：段玉璽周博陳立杰吳海燕.抗大豆胞囊線蟲(chóng)3號(hào)生理小種(scn3)核心種質(zhì)代表性分析.大豆科學(xué)，2008，3：366-372.

實(shí)施例中所用到的各種培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1。ms合成鹽購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)為m5524。b5合成鹽購(gòu)自sigma公司，貨號(hào)為g5768。

表1.培養(yǎng)基配方

實(shí)施例1.大豆胞囊線蟲(chóng)hg-cpn-1基因片段及大豆根特異性啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)

利用線蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(nematode.net)及大豆胞囊線蟲(chóng)ests數(shù)據(jù)庫(kù)信息，發(fā)現(xiàn)大豆胞囊線蟲(chóng)基因hg-cpn-1存在保守序列。在該保守區(qū)內(nèi)最終確定了序列長(zhǎng)度為418bp的片段，如seq-1所示。預(yù)期通過(guò)seq-1所示片段編碼的rna抑制胞囊線蟲(chóng)。

利用phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)、大豆公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//soybase.org/)，根據(jù)大豆根特異表達(dá)基因glyma.11g236700.1上游序列設(shè)計(jì)特異性引物gmp-f1/gmp-r1。以大豆栽培品種williams82基因組dna為模板，利用kodfx高保真酶(日本toyobo公司)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr反應(yīng)條件為：95℃5min；(94℃30s，59℃45s，72℃2min)，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并測(cè)序。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1411bp，如seq-2所示。

gmp-f1：5’-tgaatcatatcttatcaactagttag-3’

gmp-r1：5’-cccaatggaagacatgttattctctgcaaaac-3’。

實(shí)施例2.rnai重組質(zhì)粒的構(gòu)建

(1)以seq-2所示的雙鏈dna分子為模板，采用gmp-f2-attb5r和gmp-r2組成引物對(duì)，用kodfx高保真酶進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

gmp-f2-attb5r：5’-cgagctcggggacaactttgtatacaaaagttgttgaatcaaagcttatcaactagttag-3’

gmp-r2：5’-ccgctcgagcccaatggaagacatgttattctctgcaaaac-3’

gmp-f2-attb5r和gmp-r2引物對(duì)中，下劃線標(biāo)注酶切識(shí)別序列，其中，“gagctc”為限制性內(nèi)切酶saci的酶切識(shí)別序列。“ctcgag”為限制性內(nèi)切酶xhoi的酶切識(shí)別序列，“ggggacaactttgtatacaaaagttgtt”為重組位點(diǎn)attb5r。

pcr反應(yīng)條件為：95℃2min；(94℃30s，56℃45s，72℃2min)，共35個(gè)循環(huán)；72℃10min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約為1.42kb。

(2)用限制性內(nèi)切酶saci和xhoi雙酶切步驟(1)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物。

(3)用限制性內(nèi)切酶saci和xhoi雙酶切質(zhì)粒phannibal-attb1，回收載體骨架序列。

(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架序列連接，得到重組質(zhì)粒phannibal-attb5r-gmp-attb1。

(5)合成序列表的seq-1所示的雙鏈dna分子。

(6)以步驟(5)合成的雙鏈dna分子為模板，采用hg-cpn1-f1和hg-cpn1-r1組成的引物對(duì)

hg-cpn1-f1：5’-ccgggatccctcgagaaggcatcgatcaggctgtg-3’

hg-cpn1-r1：5’-ggttcgaaggtacctcgctttttgtatcctccgc-3’

hg-cpn1-f1：與hg-cpn1-r1：中，下劃線標(biāo)注酶切識(shí)別序列，其中“ggatcc”為限制性內(nèi)切酶bamhi的酶切識(shí)別序列，“ctcgag”為限制性內(nèi)切酶xhoi的酶切識(shí)別序列，“ttcgaa”為限制性內(nèi)切酶bstbi的酶切識(shí)別序列，“ggtacc”為限制性內(nèi)切酶kpni的酶切識(shí)別序列。

pcr反應(yīng)條件為：95℃2min；(94℃30s，56℃45s，72℃1min)，共30個(gè)循環(huán)；72℃5min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳回收純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小約為418bp。

(7)用限制性內(nèi)切酶xhoi和kpni雙酶切步驟(6)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物。

(8)用限制性內(nèi)切酶xhoi和kpni雙酶切質(zhì)粒phannibal-attb5r-gmp-attb1，回收載體骨架序列(約6.0kb)。

(9)將步驟(7)的酶切產(chǎn)物和步驟(8)的載體骨架序列連接，得到重組質(zhì)粒phannibal-gmp-revcpn1。

(10)用限制性內(nèi)切酶bamhi和bstbi雙酶切步驟(6)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，并回收酶切產(chǎn)物。

(11)用限制性內(nèi)切酶bamhi和bstbi雙酶切重組質(zhì)粒phannibal-gmp-revcpn1，回收載體骨架序列(約6.3kb)。

(12)將步驟(10)的酶切產(chǎn)物和步驟(11)的載體骨架序列連接，得到重組質(zhì)粒phannibal-gmp-cpn1rnai。

(13)用限制性內(nèi)切酶saci和bamhi雙酶切質(zhì)粒phannibal-gmp-cpn1rnai，回收約2.88kb酶切小片段(該片段自上游至下游依次包括大豆根特異啟動(dòng)子gmp，正義rna片段的編碼序列，間隔內(nèi)含子序列，反義rna片段的編碼序列。酶切dna片段兩端均為粘末端。

(14)用限制性內(nèi)切酶saci和bamhi雙酶切質(zhì)粒pcambia3301，回收載體骨架序列(約9.5kb)，dna酶切片段兩端均為粘末端。

(15)將步驟(13)的酶切小片段和步驟(14)的載體骨架序列連接，得到rnai重組質(zhì)粒pcambia3301-cpn1rnai。載體質(zhì)粒示意圖見(jiàn)圖1。

實(shí)施例3.抗大豆胞囊線蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物的獲得與鑒定

1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化

(1)采用凍融法將重組質(zhì)粒pcambia3301-cpn1rnai導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105，得到重組農(nóng)桿菌。

(2)用附表1中的ccm液體培養(yǎng)基重懸農(nóng)桿菌，得到od600nm＝0.5-0.8的菌懸液備用。

(3)選取栽培大豆williams82種子，在含有氯氣的密閉容器中滅菌12-16個(gè)小時(shí)。

(4)取步驟(3)中滅菌后的種子，種臍朝下置于gm培養(yǎng)基平板上，23℃暗培養(yǎng)24小時(shí)。

(5)用無(wú)菌解剖刀沿種臍切開(kāi)，并去掉腋芽，在腋芽上方子葉節(jié)位置輕微劃傷，然后置于步驟(2)得到的菌懸液中浸泡30-40分鐘。

(6)完成步驟(5)后，將種子移至鋪有無(wú)菌濾紙的ccm培養(yǎng)基平板上，23℃暗培養(yǎng)4-5天。

(7)完成步驟(6)后，將種子轉(zhuǎn)移至sim培養(yǎng)基上，25℃，16h(光)/8h(暗)條件下培養(yǎng)，每2-3周繼代1次。

(8)將誘導(dǎo)出叢生芽的外植體上的子葉切去，置于sem培養(yǎng)基平板上，25℃，16h(光)/8h(暗)條件下培養(yǎng)，每2-3周繼代1次，繼代時(shí)切去褐化的愈傷組織。

(9)當(dāng)再生芽生長(zhǎng)至4-8cm時(shí)，將再生芽切下，然后轉(zhuǎn)移至rm培養(yǎng)基平板上，25℃，16h(光)/8h(暗)條件下培養(yǎng)。

(10)待抗性芽長(zhǎng)至3-5cm，且長(zhǎng)出健壯的根時(shí)，移至煉苗室馴化3-5天，然后轉(zhuǎn)移至溫室中生長(zhǎng)，得到t0代植株。

(11)對(duì)移栽至溫室的t0代植株進(jìn)行pat/bar試紙條(libertylinkstrips，envirologix，usa)檢測(cè)。試紙條檢測(cè)陽(yáng)性的植株即初步鑒定為轉(zhuǎn)基因植株。

2.轉(zhuǎn)基因大豆分子鑒定

(1)pat/bar試紙條試紙條檢測(cè)的陽(yáng)性t0代植株自交后即獲得t1代株系。采用500mg/l除草劑-草丁膦進(jìn)行噴施，7天后非轉(zhuǎn)基因苗出現(xiàn)葉片黃化或枯死現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)正常。

(2)剪取t1代pat/bar試紙條陽(yáng)性植株葉片進(jìn)行pcr檢測(cè)。提植株葉片的基因組dna，采用hg-cpn1-f2和hg-cpn1-r2組成的引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小為418bp。部分幼苗pcr鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

hg-cpn1-f2：5’-aaggcatcgatcaggctgtggcag-3’

hg-cpn1-r2：5’-tcgctttttgtatcctccgccac-3’

(3)剪取t1代轉(zhuǎn)基因植株葉片進(jìn)行southern雜交檢測(cè)。采用高鹽ctab法提取高純度大豆基因組dna。ecori酶切總dna(～50μg)后，用0.8％瓊脂糖凝膠分離酶切片段。采用高鹽轉(zhuǎn)移法，將酶切片段轉(zhuǎn)移至帶正電荷的hyboodtm-n+尼龍膜(amersham，usa)上。以重組質(zhì)粒pcambia3301-cpn1rnai為模板，采用hg-cpn1-f2和hg-cpn1-r2引物對(duì)擴(kuò)增cpn1基因片段，擴(kuò)增片段大小為418bp。利用dig隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(roche，usa)標(biāo)記探針。

采用roche公司的dighighprimednalabelinganddetectionstarterkitii試劑盒進(jìn)行分子雜交。雜交溫度為42℃，洗膜條件為2×ssc(含0.1％sds)，37℃條件下洗膜2次，每次5min；0.5×ssc(含0.1％sds)，66℃條件下洗膜2次，每次15min。然后利用bcip/nbt在雜交膜上化學(xué)顯色。部分轉(zhuǎn)基因大豆southern雜交檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

(4)收獲southern雜交陽(yáng)性的t1代植株自交后得到的種子，播種后長(zhǎng)出t2代幼苗，繼續(xù)采用500mg/l除草劑-草丁膦和pcr進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，直至獲得純合的轉(zhuǎn)基因株系。

4.轉(zhuǎn)基因大豆抗胞囊線蟲(chóng)鑒定

采用病土接種法(病土采自吉林省洮南地區(qū))，對(duì)t3代轉(zhuǎn)基因大豆株系c845、c815、c810、c842和c847進(jìn)行抗性鑒定，受體對(duì)照品種為栽培大豆品種williams82。采用golden(1970)確立的一套鑒別寄主，riggs(1988)給定的鑒定模式，確定接種土樣中胞囊線蟲(chóng)為3號(hào)小種。抗性分級(jí)參照shannon1992年提出鑒定大豆抗病性的ip標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，高抗0～9％(hr)，中抗10％～30％(mr)，中感31％～60％(ms)，高感大于60％(vs)。ip指數(shù)＝(供試品種的平均胞囊量/感病對(duì)照品種的平均胞囊量)×100?？剐澡b定試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)鑒定植株15株。

鑒定結(jié)果表明，與受體對(duì)照品種相比，轉(zhuǎn)基因大豆c845、c815、c810、c842和c847平均胞囊數(shù)量均顯著降低，表現(xiàn)為中抗(mr)。對(duì)照非轉(zhuǎn)基因大豆williams82表現(xiàn)為中感(平均胞囊數(shù)量為)。表明將重組rnai表達(dá)載體導(dǎo)入植物，可以顯著提高植物對(duì)大豆胞囊線蟲(chóng)的抗性?？剐澡b定結(jié)果見(jiàn)表2和圖4。

表2.t3代轉(zhuǎn)基因大豆抗scn鑒定結(jié)果

以上公開(kāi)的僅為本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，但是本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。