本發(fā)明涉及一組玉米snp位點(diǎn)基因分型引物探針及其在玉米品種鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

snp(singlenucleotidepolymorphism)，即單核苷酸多態(tài)性，具有分布密度高、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、檢測通量高、數(shù)據(jù)容易整合和標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)，被認(rèn)為是最有效dna標(biāo)記方法之一，在作物的品種鑒定中得到應(yīng)用，也被國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟(upov)被推薦作為品種鑒定和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的優(yōu)選標(biāo)記。目前針對snp的分型檢測方法有多種，不同的方法在檢測通量及成本上差異較大，其中taqman基因分型法是比較經(jīng)濟(jì)適用的方法之一，具有位點(diǎn)擴(kuò)展性性強(qiáng)、操作便捷、結(jié)果容易分析等特點(diǎn)，尤其適合大量樣本的少量snp位點(diǎn)分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一組玉米snp位點(diǎn)基因分型引物探針及其在玉米品種鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種用于檢測33個(gè)snp位點(diǎn)的產(chǎn)品在玉米品種鑒定中的應(yīng)用；

所述33個(gè)snp位點(diǎn)如下所示：

第1個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs128678258，該snp為a/g多態(tài)；

第2個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs128788177，該snp為a/g多態(tài)；

第3個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs129008749，該snp為a/g多態(tài)；

第4個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs129055420，該snp為a/c多態(tài)；

第5個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131185612，該snp為a/c多態(tài)；

第6個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs129114598，該snp為a/g多態(tài)；

第7個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs129285561，該snp為a/g多態(tài)；

第8個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131186467，該snp為a/g多態(tài)；

第9個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs129443475，該snp為a/g多態(tài)；

第10個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs132041642，該snp為a/g多態(tài)；

第11個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs132209776，該snp為c/t多態(tài)；

第12個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs129616828，該snp為a/c多態(tài)；

第13個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs132150359，該snp為a/g多態(tài)；

第14個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130066060，該snp為a/g多態(tài)；

第15個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130125228，該snp為a/g多態(tài)；

第16個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130215161，該snp為a/g多態(tài)；

第17個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130409889，該snp為a/c多態(tài)；

第18個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130361778，該snp為a/g多態(tài)；

第19個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs725555507，該snp為a/g多態(tài)；

第20個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130394765，該snp為a/g多態(tài)；

第21個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs132452441，該snp為a/g多態(tài)；

第22個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs725779351，該snp為a/g多態(tài)；

第23個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130645454，該snp為a/g多態(tài)；

第24個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130863902，該snp為a/t多態(tài)；

第25個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130767984，該snp為a/g多態(tài)；

第26個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131668819，該snp為a/g多態(tài)；

第27個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131182586，該snp為a/g多態(tài)；

第28個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131185073，該snp為a/g多態(tài)；

第29個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs130995365，該snp為a/c多態(tài)；

第30個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131086386，該snp為a/c多態(tài)；

第31個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131185345，該snp為a/c多態(tài)；

第32個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs131787736，該snp為a/g多態(tài)；

第33個(gè)snp位點(diǎn)的rs號為rs128621968，該snp為a/c多態(tài)。

所述“用于檢測33個(gè)snp位點(diǎn)的產(chǎn)品”為引物探針組合；所述引物探針組合由33個(gè)引物探針組組成；

引物探針組1由引物組1和探針組1組成；所述引物組1由引物f1和引物r1組成；所述引物f1為序列表的序列1所示的單鏈dna分子；所述引物r1為序列表的序列2所示的單鏈dna分子；所述探針組1由探針p1-1和探針p1-2組成；所述探針p1-1為序列表的序列3所示的單鏈dna分子；所述探針p1-2為序列表的序列4所示的單鏈dna分子；所述探針p1-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p1-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組2由引物組2和探針組2組成；所述引物組2由引物f2和引物r2組成；所述引物f2為序列表的序列5所示的單鏈dna分子；所述引物r2為序列表的序列6所示的單鏈dna分子；所述探針組2由探針p2-1和探針p2-2組成；所述探針p2-1為序列表的序列7所示的單鏈dna分子；所述探針p2-2為序列表的序列8所示的單鏈dna分子；所述探針p2-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p2-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組3由引物組3和探針組3組成；所述引物組3由引物f3和引物r3組成；所述引物f3為序列表的序列9所示的單鏈dna分子；所述引物r3為序列表的序列10所示的單鏈dna分子；所述探針組3由探針p3-1和探針p3-2組成；所述探針p3-1為序列表的序列11所示的單鏈dna分子；所述探針p3-2為序列表的序列12所示的單鏈dna分子；所述探針p3-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p3-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組4由引物組4和探針組4組成；所述引物組4由引物f4和引物r4組成；所述引物f4為序列表的序列13所示的單鏈dna分子；所述引物r4為序列表的序列14所示的單鏈dna分子；所述探針組4由探針p4-1和探針p4-2組成；所述探針p4-1為序列表的序列15所示的單鏈dna分子；所述探針p4-2為序列表的序列16所示的單鏈dna分子；所述探針p4-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p4-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組5由引物組5和探針組5組成；所述引物組5由引物f5和引物r5組成；所述引物f5為序列表的序列17所示的單鏈dna分子；所述引物r5為序列表的序列18所示的單鏈dna分子；所述探針組5由探針p5-1和探針p5-2組成；所述探針p5-1為序列表的序列19所示的單鏈dna分子；所述探針p5-2為序列表的序列20所示的單鏈dna分子；所述探針p5-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p5-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組6由引物組6和探針組6組成；所述引物組6由引物f6和引物r6組成；所述引物f6為序列表的序列21所示的單鏈dna分子；所述引物r6為序列表的序列22所示的單鏈dna分子；所述探針組6由探針p6-1和探針p6-2組成；所述探針p6-1為序列表的序列23所示的單鏈dna分子；所述探針p6-2為序列表的序列24所示的單鏈dna分子；所述探針p6-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p6-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組7由引物組7和探針組7組成；所述引物組7由引物f7和引物r7組成；所述引物f7為序列表的序列25所示的單鏈dna分子；所述引物r7為序列表的序列26所示的單鏈dna分子；所述探針組7由探針p7-1和探針p7-2組成；所述探針p7-1為序列表的序列27所示的單鏈dna分子；所述探針p7-2為序列表的序列28所示的單鏈dna分子；所述探針p7-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p7-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組8由引物組8和探針組8組成；所述引物組8由引物f8和引物r8組成；所述引物f8為序列表的序列29所示的單鏈dna分子；所述引物r8為序列表的序列30所示的單鏈dna分子；所述探針組8由探針p8-1和探針p8-2組成；所述探針p8-1為序列表的序列31所示的單鏈dna分子；所述探針p8-2為序列表的序列32所示的單鏈dna分子；所述探針p7-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p7-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組9由引物組9和探針組9組成；所述引物組9由引物f9和引物r9組成；所述引物f9為序列表的序列33所示的單鏈dna分子；所述引物r9為序列表的序列34所示的單鏈dna分子；所述探針組9由探針p9-1和探針p9-2組成；所述探針p9-1為序列表的序列35所示的單鏈dna分子；所述探針p9-2為序列表的序列36所示的單鏈dna分子；所述探針p9-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p9-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組10由引物組10和探針組10組成；所述引物組10由引物f10和引物r10組成；所述引物f10為序列表的序列37所示的單鏈dna分子；所述引物r10為序列表的序列38所示的單鏈dna分子；所述探針組10由探針p10-1和探針p10-2組成；所述探針p10-1為序列表的序列39所示的單鏈dna分子；所述探針p10-2為序列表的序列40所示的單鏈dna分子；所述探針p10-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p10-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組11由引物組11和探針組11組成；所述引物組11由引物f11和引物r11組成；所述引物f11為序列表的序列41所示的單鏈dna分子；所述引物r11為序列表的序列42所示的單鏈dna分子；所述探針組11由探針p11-1和探針p11-2組成；所述探針p11-1為序列表的序列43所示的單鏈dna分子；所述探針p11-2為序列表的序列44所示的單鏈dna分子；所述探針p11-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p11-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組12由引物組12和探針組12組成；所述引物組12由引物f12和引物r12組成；所述引物f12為序列表的序列45所示的單鏈dna分子；所述引物r12為序列表的序列46所示的單鏈dna分子；所述探針組12由探針p12-1和探針p12-2組成；所述探針p12-1為序列表的序列47所示的單鏈dna分子；所述探針p12-2為序列表的序列48所示的單鏈dna分子；所述探針p12-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p12-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組13由引物組13和探針組13組成；所述引物組13由引物f13和引物r13組成；所述引物f13為序列表的序列49所示的單鏈dna分子；所述引物r13為序列表的序列50所示的單鏈dna分子；所述探針組13由探針p13-1和探針p13-2組成；所述探針p13-1為序列表的序列51所示的單鏈dna分子；所述探針p13-2為序列表的序列52所示的單鏈dna分子；所述探針p13-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p13-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組14由引物組14和探針組14組成；所述引物組14由引物f14和引物r14組成；所述引物f14為序列表的序列53所示的單鏈dna分子；所述引物r14為序列表的序列54所示的單鏈dna分子；所述探針組14由探針p14-1和探針p14-2組成；所述探針p14-1為序列表的序列55所示的單鏈dna分子；所述探針p14-2為序列表的序列56所示的單鏈dna分子；所述探針p14-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p14-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組15由引物組15和探針組15組成；所述引物組15由引物f15和引物r15組成；所述引物f15為序列表的序列57所示的單鏈dna分子；所述引物r15為序列表的序列58所示的單鏈dna分子；所述探針組15由探針p15-1和探針p15-2組成；所述探針p15-1為序列表的序列59所示的單鏈dna分子；所述探針p15-2為序列表的序列60所示的單鏈dna分子；所述探針p15-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p15-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組16由引物組16和探針組16組成；所述引物組16由引物f16和引物r16組成；所述引物f16為序列表的序列61所示的單鏈dna分子；所述引物r16為序列表的序列62所示的單鏈dna分子；所述探針組16由探針p16-1和探針p16-2組成；所述探針p16-1為序列表的序列63所示的單鏈dna分子；所述探針p16-2為序列表的序列64所示的單鏈dna分子；所述探針p16-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p16-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組17由引物組17和探針組17組成；所述引物組17由引物f17和引物r17組成；所述引物f17為序列表的序列65所示的單鏈dna分子；所述引物r17為序列表的序列66所示的單鏈dna分子；所述探針組17由探針p17-1和探針p17-2組成；所述探針p17-1為序列表的序列67所示的單鏈dna分子；所述探針p17-2為序列表的序列68所示的單鏈dna分子；所述探針p17-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p17-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組17由引物組17和探針組17組成；所述引物組17由引物f17和引物r17組成；所述引物f17為序列表的序列65所示的單鏈dna分子；所述引物r17為序列表的序列66所示的單鏈dna分子；所述探針組17由探針p17-1和探針p17-2組成；所述探針p17-1為序列表的序列67所示的單鏈dna分子；所述探針p17-2為序列表的序列68所示的單鏈dna分子；所述探針p17-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p17-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組18由引物組18和探針組18組成；所述引物組18由引物f18和引物r18組成；所述引物f18為序列表的序列69所示的單鏈dna分子；所述引物r18為序列表的序列70所示的單鏈dna分子；所述探針組18由探針p18-1和探針p18-2組成；所述探針p18-1為序列表的序列71所示的單鏈dna分子；所述探針p18-2為序列表的序列72所示的單鏈dna分子；所述探針p18-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p18-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組19由引物組19和探針組19組成；所述引物組19由引物f19和引物r19組成；所述引物f19為序列表的序列73所示的單鏈dna分子；所述引物r19為序列表的序列74所示的單鏈dna分子；所述探針組19由探針p19-1和探針p19-2組成；所述探針p19-1為序列表的序列75所示的單鏈dna分子；所述探針p19-2為序列表的序列76所示的單鏈dna分子；所述探針p19-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p19-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組20由引物組20和探針組20組成；所述引物組20由引物f20和引物r20組成；所述引物f20為序列表的序列77所示的單鏈dna分子；所述引物r20為序列表的序列78所示的單鏈dna分子；所述探針組20由探針p20-1和探針p20-2組成；所述探針p20-1為序列表的序列79所示的單鏈dna分子；所述探針p20-2為序列表的序列80所示的單鏈dna分子；所述探針p20-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p20-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組21由引物組21和探針組21組成；所述引物組21由引物f21和引物r21組成；所述引物f21為序列表的序列81所示的單鏈dna分子；所述引物r21為序列表的序列82所示的單鏈dna分子；所述探針組21由探針p21-1和探針p21-2組成；所述探針p21-1為序列表的序列83所示的單鏈dna分子；所述探針p21-2為序列表的序列84所示的單鏈dna分子；所述探針p21-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p21-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組22由引物組22和探針組22組成；所述引物組22由引物f22和引物r22組成；所述引物f22為序列表的序列85所示的單鏈dna分子；所述引物r22為序列表的序列86所示的單鏈dna分子；所述探針組22由探針p22-1和探針p22-2組成；所述探針p22-1為序列表的序列87所示的單鏈dna分子；所述探針p22-2為序列表的序列88所示的單鏈dna分子；所述探針p22-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p22-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組23由引物組23和探針組23組成；所述引物組23由引物f23和引物r23組成；所述引物f23為序列表的序列89所示的單鏈dna分子；所述引物r23為序列表的序列90所示的單鏈dna分子；所述探針組23由探針p23-1和探針p23-2組成；所述探針p23-1為序列表的序列91所示的單鏈dna分子；所述探針p23-2為序列表的序列92所示的單鏈dna分子；所述探針p23-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p23-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組24由引物組24和探針組24組成；所述引物組24由引物f24和引物r24組成；所述引物f24為序列表的序列93所示的單鏈dna分子；所述引物r24為序列表的序列94所示的單鏈dna分子；所述探針組24由探針p24-1和探針p24-2組成；所述探針p24-1為序列表的序列95所示的單鏈dna分子；所述探針p24-2為序列表的序列96所示的單鏈dna分子；所述探針p24-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p24-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組25由引物組25和探針組25組成；所述引物組25由引物f25和引物r25組成；所述引物f25為序列表的序列97所示的單鏈dna分子；所述引物r25為序列表的序列98所示的單鏈dna分子；所述探針組25由探針p25-1和探針p25-2組成；所述探針p25-1為序列表的序列99所示的單鏈dna分子；所述探針p25-2為序列表的序列100所示的單鏈dna分子；所述探針p24-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p25-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組26由引物組26和探針組26組成；所述引物組26由引物f26和引物r26組成；所述引物f26為序列表的序列101所示的單鏈dna分子；所述引物r26為序列表的序列102所示的單鏈dna分子；所述探針組26由探針p26-1和探針p26-2組成；所述探針p26-1為序列表的序列103所示的單鏈dna分子；所述探針p26-2為序列表的序列104所示的單鏈dna分子；所述探針p26-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p26-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組27由引物組27和探針組27組成；所述引物組27由引物f27和引物r27組成；所述引物f27為序列表的序列105所示的單鏈dna分子；所述引物r27為序列表的序列106所示的單鏈dna分子；所述探針組27由探針p27-1和探針p27-2組成；所述探針p27-1為序列表的序列107所示的單鏈dna分子；所述探針p27-2為序列表的序列108所示的單鏈dna分子；所述探針p27-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p27-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組28由引物組28和探針組28組成；所述引物組28由引物f28和引物r28組成；所述引物f28為序列表的序列109所示的單鏈dna分子；所述引物r28為序列表的序列110所示的單鏈dna分子；所述探針組28由探針p28-1和探針p28-2組成；所述探針p28-1為序列表的序列111所示的單鏈dna分子；所述探針p28-2為序列表的序列112所示的單鏈dna分子；所述探針p28-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p28-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組29由引物組29和探針組29組成；所述引物組29由引物f29和引物r29組成；所述引物f29為序列表的序列113所示的單鏈dna分子；所述引物r29為序列表的序列114所示的單鏈dna分子；所述探針組29由探針p29-1和探針p29-2組成；所述探針p29-1為序列表的序列115所示的單鏈dna分子；所述探針p29-2為序列表的序列116所示的單鏈dna分子；所述探針p29-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p29-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組30由引物組30和探針組30組成；所述引物組30由引物f30和引物r30組成；所述引物f30為序列表的序列117所示的單鏈dna分子；所述引物r30為序列表的序列118所示的單鏈dna分子；所述探針組30由探針p30-1和探針p30-2組成；所述探針p30-1為序列表的序列119所示的單鏈dna分子；所述探針p30-2為序列表的序列120所示的單鏈dna分子；所述探針p30-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p30-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組31由引物組31和探針組31組成；所述引物組31由引物f31和引物r31組成；所述引物f31為序列表的序列121所示的單鏈dna分子；所述引物r31為序列表的序列122所示的單鏈dna分子；所述探針組31由探針p31-1和探針p31-2組成；所述探針p31-1為序列表的序列123所示的單鏈dna分子；所述探針p31-2為序列表的序列124所示的單鏈dna分子；所述探針p31-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p31-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組32由引物組32和探針組32組成；所述引物組32由引物f32和引物r32組成；所述引物f32為序列表的序列125所示的單鏈dna分子；所述引物r32為序列表的序列126所示的單鏈dna分子；所述探針組32由探針p32-1和探針p32-2組成；所述探針p32-1為序列表的序列127所示的單鏈dna分子；所述探針p32-2為序列表的序列128所示的單鏈dna分子；所述探針p32-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p32-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)；

引物探針組33由引物組33和探針組33組成；所述引物組33由引物f33和引物r33組成；所述引物f33為序列表的序列129所示的單鏈dna分子；所述引物r33為序列表的序列130所示的單鏈dna分子；所述探針組33由探針p33-1和探針p33-2組成；所述探針p33-1為序列表的序列131所示的單鏈dna分子；所述探針p33-2為序列表的序列132所示的單鏈dna分子；所述探針p33-1的5’端連接有熒光基團(tuán)a，3’端連接有淬滅基團(tuán)；所述探針p33-2的5’端連接有熒光基團(tuán)b，3’端連接有淬滅基團(tuán)。

所述熒光基團(tuán)a和熒光基團(tuán)b為不同的熒光基團(tuán)。

所述熒光基團(tuán)a具體可為fam。

所述熒光基團(tuán)b具體為vic或hex。

所述熒光基團(tuán)a和熒光基團(tuán)b可以互換。

所述淬滅基團(tuán)為tamra。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物探針組合。

本發(fā)明還保護(hù)所述引物探針組合在玉米品種鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)含有所述引物探針組合的試劑盒，所述試劑盒的用途為鑒定玉米品種。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定玉米品種的方法(方法甲)，包括如下步驟：檢測待測玉米品種在所述33個(gè)snp位點(diǎn)上的基因型；根據(jù)基因型確定待鑒定玉米的品種。

本發(fā)明還保護(hù)一種鑒定玉米品種的方法(方法乙)，包括如下步驟：提取待鑒定玉米品種的基因組dna；利用所述引物探針組合對所述基因組dna分別進(jìn)行所述33個(gè)snp位點(diǎn)的檢測，從而獲得待測玉米品種在所述33個(gè)snp位點(diǎn)上的基因型數(shù)據(jù)；根據(jù)基因型數(shù)據(jù)確定待鑒定玉米的品種。

所述方法乙具體包括如下步驟：(1)提取待鑒定玉米的基因組dna；(2)以步驟(1)得到的基因組dna為模板，依次采用所述引物探針組合中的每個(gè)snp位點(diǎn)對應(yīng)的各條引物探針對模板進(jìn)行snp-taqmanpcr擴(kuò)增；(3)對步驟(2)得到的擴(kuò)增的熒光信號進(jìn)行收集和分析，獲得待測玉米品種在所述33個(gè)snp位點(diǎn)上的基因型數(shù)據(jù)，根據(jù)基因型數(shù)據(jù)確定待鑒定玉米的品種。

所述snp-taqmanpcr反應(yīng)體系具體可為：snp-taqmanpcr反應(yīng)體系(5μl)：通用pcr混合液(genotypingmastermix)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司，貨號4371355)2.5μl，上游引物、下游引物、探針1和探針2各0.25μl(引物終濃度均為0.25μm,探針終濃度均為0.125μm)，模板0.5μl(dna含量為25-50ng)，ddh2o1.0μl，總體積5μl。

所述snp-taqmanpcr擴(kuò)增可在abi-viia7實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行，由儀器自帶的viia^tm7softwarev1.2.2軟件對擴(kuò)增的熒光信號進(jìn)行收集和分析(參照軟件使用說明書)。

本發(fā)明還保護(hù)一種用于鑒定玉米品種的試劑盒，包括所述引物探針組合及記載有所述方法乙的說明書。

以上任一所述玉米品種具體可為表1中所示的玉米品種。

本發(fā)明通過snp芯片技術(shù)篩選出適合玉米品種鑒定的多態(tài)性snp位點(diǎn)，根據(jù)snp位點(diǎn)dna序列信息設(shè)計(jì)taqman分型探針和引物，再利用taqman-snp分型技術(shù)對201個(gè)審定玉米品種進(jìn)行了鑒定分析，評價(jià)引物鑒別能力，構(gòu)建了一組適合玉米品種鑒定snp位點(diǎn)組合及快速分型方法，為玉米品種室內(nèi)快速鑒定提供技術(shù)支撐。

附圖說明

圖1為201個(gè)玉米品種pze-106073260位點(diǎn)的基因分型圖。

圖2為33個(gè)snp位點(diǎn)對201個(gè)玉米品種遺傳聚類分析結(jié)果。

圖3為33個(gè)snp位點(diǎn)對201個(gè)玉米品種遺傳聚類分析結(jié)果局部圖。

圖4為33個(gè)snp位點(diǎn)對201個(gè)玉米品種遺傳聚類分析結(jié)果局部圖。

圖5為33個(gè)snp位點(diǎn)對201個(gè)玉米品種遺傳聚類分析結(jié)果局部圖。

圖6為33個(gè)snp位點(diǎn)對201個(gè)玉米品種遺傳聚類分析結(jié)果局部圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。

實(shí)施例中的201個(gè)玉米品種見表1。表1中的所有品種均可從北京種子管理站農(nóng)作物標(biāo)準(zhǔn)樣品庫獲得。

表1201個(gè)玉米品種

實(shí)施例1、用于玉米品種鑒定的snp位點(diǎn)的開發(fā)

取京農(nóng)科728、農(nóng)大95、正大12、通丹24、京紫糯218、聯(lián)科96、京科528和甜單66共計(jì)8個(gè)玉米組合，24個(gè)材料(雜交種及父母本)作為位點(diǎn)篩選材料，按照illumina公司提供的基于光纖微珠芯片infinium技術(shù)的操作流程進(jìn)行，利用玉米illumina50k全基因組snp芯片對這24個(gè)玉米品種進(jìn)行分型鑒定，用iscan芯片掃描儀掃描分型結(jié)果，獲得原始數(shù)據(jù)。用genomestudio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得待測樣品snp位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)。

結(jié)果顯示，56110個(gè)snp位點(diǎn)平均數(shù)據(jù)獲得率(callrate值)為93.6％，其中52481個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性(表現(xiàn)為2或3種基因型),多態(tài)性位點(diǎn)比率為93.5％。根據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)據(jù)缺失率(低于5％)、基因型頻率(每種基因型頻率不小于5％)、重復(fù)性、信號強(qiáng)度、分型效果、以及是否符合遺傳規(guī)律，篩選出4956個(gè)snp位點(diǎn)作為玉米品種鑒定的候選位點(diǎn)，并從中挑選33個(gè)基因型分布較為均勻(每種基因型比率不小于10％)的snp位點(diǎn)(見表2)。

表2snp位點(diǎn)信息

實(shí)施例2、用于玉米品種鑒定的引物探針的開發(fā)

針對實(shí)施例1篩選得到的33個(gè)snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和探針，具體如表3所示。

表3引物探針信息

每個(gè)snp位點(diǎn)均有1對引物(正反向)和2個(gè)taqman探針，在其中一個(gè)探針的5’末端用fam進(jìn)行標(biāo)記，另一個(gè)探針的5’末端用vic進(jìn)行標(biāo)記(或采用hex進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也可達(dá)到相同的效果)，2個(gè)探針的3’末端都用tamra進(jìn)行標(biāo)記。

表3中的各條引物和探針在使用時(shí)均以工作液的形式加入至反應(yīng)體系中，引物在工作液的濃度均為5μm，探針在工作液的濃度均為2.5μm。

實(shí)施例3、玉米品種鑒定

1、提取表1中各玉米品種的基因組dna。

2、以步驟1得到的基因組dna為模板，依次采用表3中每個(gè)snp位點(diǎn)對應(yīng)的各條引物探針對模板進(jìn)行snp-taqmanpcr擴(kuò)增。

snp-taqmanpcr反應(yīng)體系(5μl)：通用pcr混合液(genotypingmastermix)(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)中國公司，貨號4371355)2.5μl，上游引物、下游引物、探針1和探針2各0.25μl，模板0.5μl(dna含量為25-50ng)，ddh2o1.0μl。

擴(kuò)增反應(yīng)在abi-viia7實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀上進(jìn)行，由儀器自帶的viia^tm7softwarev1.2.2軟件對擴(kuò)增的熒光信號進(jìn)行收集和分析(參照軟件使用說明書)。采用powermarker3.25軟件計(jì)算snp位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(pic)，ntsys-pcversion2.0軟件計(jì)算品種間的遺傳相似性系數(shù)并進(jìn)行遺傳聚類分析。

201個(gè)玉米品種在表2中編號為20的pze-106073260位點(diǎn)的分型圖如圖1所示。遺傳聚類分析結(jié)果如圖2-圖6所示。圖2為整體的遺傳聚類分析結(jié)果。圖3-圖6為局部的遺傳聚類分析結(jié)果。圖3-圖6中，最右側(cè)數(shù)字對應(yīng)表2中的各品種編號。結(jié)果顯示201個(gè)玉米品種在33個(gè)snp位點(diǎn)分型均效果正常，平均數(shù)據(jù)獲得率為98.9％，多態(tài)性信息量(pic)變幅為0.26-0.375之間，平均為0.357(表2)，均為中高度多態(tài)性位點(diǎn)。201個(gè)玉米品種間遺傳相似性系數(shù)介于0.167-0.96之間，平均遺傳相似性系數(shù)為0.522，遺傳聚類分析結(jié)果顯示201個(gè)品種之間至少有1個(gè)以上差異位點(diǎn)，說明該33個(gè)snp位點(diǎn)組合具有較強(qiáng)的品種鑒別能力，能正確將201個(gè)玉米品種鑒別開，適合玉米品種鑒定。

<110>北京市種子管理站

<120>一組snp位點(diǎn)基因分型引物探針及其在玉米品種鑒定中的應(yīng)用

<160>132

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

aagatctaaaatttacttctctgcagcca29

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ttttagtcccacagttgcttagctt25

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

ctgcttggaattctcct17

<210>4

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tgcttggacttctcct16

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

cagaagtttgttggtggcatagg23

<210>6

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ttgcgtgtgtatctaatccatgtca25

<210>7

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

cacgcaaggaaatc14

<210>8

<211>13

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

acgcgaggaaatc13

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

ccttgagaagctgcagtgact21

<210>10

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

tgaattgaacttattctgctgtgatgtatct31

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

cagcatgtcaatgactg17

<210>12

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

cagcatgtcagtgactg17

<210>13

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

ggtgaccgtggtgcaatg18

<210>14

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

caaaaggctgacaaagcaataagct25

<210>15

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

caagcaaaacattatggc18

<210>16

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

caagcaaaaccttatggc18

<210>17

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

ttcgacctgaactgatgctatgg23

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

gagacggcagagtggttattatgg24

<210>19

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

cactacagcaagtctc16

<210>20

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

cactacagccagtctc16

<210>21

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>21

ggcggtttagattcaccttcttcaa25

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

ggatgttcacgtcggcgata20

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>23

ctgtcattttctttaatggttt22

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>24

tgtcattttctttgatggttt21

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>25

ggtcggcgatctgaagaaagg21

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>26

gtattgacgtgcttgtctgtaaacg25

<210>27

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>27

atcaacccactgtctatt18

<210>28

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>28

aacccgctgtctatt15

<210>29

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>29

ccttgtccttgtctgtgagtgt22

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>30

gccgctgtgagaacactttc20

<210>31

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<400>31

ttcttcctctcaccaagct19

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>32

ttcctctcgccaagct16

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>33

cactgcagcctaaacctctct21

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<212>dna

<213>人工序列

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catgttgaacctgatcacgagtga24

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<212>dna

<213>人工序列

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aactaaccgcatgttgac18

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<211>14

<212>dna

<213>人工序列

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aaccgcgtgttgac14

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<212>dna

<213>人工序列

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gctgaggcacaattagtcatgtact25

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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tgcctcaacaactgttcttcaatt24

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<211>15

<212>dna

<213>人工序列

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<211>13

<212>dna

<213>人工序列

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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ccaagactcggtaattactctgtga25

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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cacggattacatgatgagtt20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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cacggattacataatgagtt20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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caccctcatccatcaagttgct22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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ccagatgaggtgcttgttgtga22

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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caagtggcactcgctgt17

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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cgcaacaaatttggtcggagtt22

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<212>dna

<213>人工序列

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caggtcattctcttccggtattctt25

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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accattgaacgccttc16

<210>52

<211>14

<212>dna

<213>人工序列

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cattgagcgccttc14

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<400>53

aagcctcggccagtacaag19

<210>54

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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agaaagggaaggaggaagaaggaa24

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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<211>14

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>16

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<213>人工序列

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列

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gcatgtcatgttcacagggaagat24

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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catggacgaaggtaaagtgattgg24

<210>74

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<210>78

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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agccactgctgcatttgtttc21

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>26

<212>dna

<213>人工序列

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<211>20

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<213>人工序列

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acctgaaatgtcacagtact20

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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ctgcatgtaacaacagttg19

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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ctgcatgtaacatcagttg19

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<212>dna

<213>人工序列

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tcccttgtccatctgttgttttctt25

<210>98

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<212>dna

<213>人工序列

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ctccaatccgtgctgcaatt20

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<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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ccttgttagagaaatccat19

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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cttgttagaggaatccat18

<210>101

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<212>dna

<213>人工序列

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ctggagcttttctgatgctgtttg24

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<212>dna

<213>人工序列

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tcatccaaaccaaagagacgatagg25

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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cttgcttggtgaaaag16

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<211>15

<212>dna

<213>人工序列

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<211>13

<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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cggagctgggatcaggtttt20

<210>110

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<210>113

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>人工序列

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<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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atgggttgattctatctc18

<210>117

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<212>dna

<213>人工序列

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caaacgggaagagcttcactga22

<210>118

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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ttgcatgtccgtgtgatcct20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

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tctatggagataacagaacg20

<210>120

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

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<400>120

tatggagatcacagaacg18

<210>121

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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<400>121

agtttaactggcggtggaagg21

<210>122

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

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<400>122

aactagcattccatgaaacaatagactca29

<210>123

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

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<223>

<400>123

cacttttttttgcaactac19

<210>124

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

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<400>124

ctttttttggcaactac17

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<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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<400>125

gcctgaagtggtaggtctacatagt25

<210>126

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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<400>126

ccaccccttcctcttctttaataca25

<210>127

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>127

cagtttttcccttaaataca20

<210>128

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>128

agtttttcccttgaataca19

<210>129

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<223>

<400>129

cagacagtggccaatgtactca22

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<211>21

<212>dna

<213>人工序列

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tgggaagatgaagcgcacaaa21

<210>131

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

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<400>131

cctgcccctttgtggc16

<210>132

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>132

ctgcccctgtgtggc15