本發(fā)明涉及一種檢測(cè)一組痛風(fēng)易感基因snp位點(diǎn)基因型的方法。
背景技術(shù)：
：人abcg2基因位于染色體4q22-q23，abcg2五號(hào)外顯子的rs2231142(c.421c>a)與尿酸鹽水平和痛風(fēng)具有相關(guān)性，而最新研究發(fā)現(xiàn)該多態(tài)a/a基因型頻率與漢族男性和女性的痛風(fēng)發(fā)生均有顯著的相關(guān)性，漢族痛風(fēng)女性患者中等位基因a的頻率為0.422，遠(yuǎn)高于對(duì)照組(0.293)。abcg2基因snp位點(diǎn)rs72552713是該基因14號(hào)外顯子，研究發(fā)現(xiàn)abcg2基因snp位點(diǎn)rs72552713(c.376c>t,p.gln126ter)的ct基因型、t等位基因與痛風(fēng)和高血酸尿癥的發(fā)生顯著相關(guān)，而且攜帶該突變的痛風(fēng)患者具有發(fā)病早、病程早期即表現(xiàn)出頻繁發(fā)作和多關(guān)節(jié)受累的臨床特點(diǎn)。bcas3基因rs11653176，cnih2基因rs4073582，gckr基因rs1260326，kcnq1rs179785，位于12號(hào)染色體myl2和cux2基因間隔區(qū)rs2188380和rfx3基因rs12236871與痛風(fēng)易感性相關(guān)。痛風(fēng)(gout)是由嘌呤代謝紊亂和腎小管源性的尿酸排泄障礙而引起關(guān)節(jié)及某些器官損害的一種代謝疾病。由于生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，歐美等痛風(fēng)患病率有1.4-3.9％，中國(guó)的發(fā)病率為0.15-1.14％。痛風(fēng)早期的臨床表現(xiàn)為間斷發(fā)作性急性關(guān)節(jié)炎，主要為單關(guān)節(jié)受累，腫痛一般持續(xù)7-10天，可通過(guò)藥物或自發(fā)緩解，間歇期無(wú)癥狀。隨著病程的延長(zhǎng)，痛風(fēng)發(fā)作次數(shù)、受累關(guān)節(jié)數(shù)逐漸增加，間歇期也開(kāi)始出現(xiàn)癥狀，同時(shí)關(guān)節(jié)或皮膚軟組織中痛風(fēng)石形成，嚴(yán)重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)毀損或致殘，出現(xiàn)腎臟結(jié)石、慢性腎損傷等，最終可能發(fā)展成慢性腎功能衰竭。高血酸尿癥(hyperuricemia，hua)、飲酒、代謝綜合征、高血壓、肥胖、利尿劑的服用等危險(xiǎn)因素都與痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前關(guān)于痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但大量研究表明是痛風(fēng)是一種由環(huán)境和遺傳因素共同作用引起的多基因遺傳病，目前已知的痛風(fēng)相關(guān)基因有slc2a9、abcg2等。研究發(fā)現(xiàn)高血酸尿癥人群中僅有10％左右的人可能發(fā)展成痛風(fēng)，說(shuō)明不直接參與尿酸代謝的基因也可能與痛風(fēng)易感性有關(guān)。鑒于痛風(fēng)對(duì)患者引起的嚴(yán)重危害和沉重的負(fù)擔(dān)，對(duì)痛風(fēng)易感基因的篩查和研究日益受到人們的關(guān)注。高分辨率熔解曲線(highresolutionmelting,hrm)是在常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)過(guò)程中飽和熒光染枓如evagreen與dna雙鏈結(jié)合，當(dāng)通過(guò)加熱升溫使dna雙鏈解離時(shí)，熒光染料從局部解鏈的dna分子上釋放，由于突變、snp位點(diǎn)雙鏈堿基間不匹配會(huì)使雙鏈dna在此位點(diǎn)首先解開(kāi)，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中的熒光強(qiáng)度，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間軸曲線上便可判斷是否存在突變或snp。不同位點(diǎn)、雜合子與否、gc含量、擴(kuò)增子長(zhǎng)度等都會(huì)影響熔解曲線的峰形，所以hrm分析能夠有效區(qū)分不同突變位點(diǎn)、snp位點(diǎn)和擁有不同gc含量的擴(kuò)增片段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明公開(kāi)了檢測(cè)樣品中rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的hrm方法。本發(fā)明公開(kāi)了用于擴(kuò)增和檢測(cè)樣品上述8個(gè)snp的引物序列，所述的引物序列為如下八對(duì)中的任意一對(duì)或多對(duì)：上游引物下游引物rs22311425'-gatgggcactctgacggt-3'5'-gttgttgcaagccgaagagc-3'rs725527135'-cgcgacctgccaatttcaa-3'5'-tcagccaaagcacttaccca-3'rs116531765'-gggtggctcttctctccca-3'5'-tcttgccggatgacagtgag-3'rs40735825'-ggagtcctgatggcagacac-3’5'-ctgcaggacggtggaagtac-3'rs12603265'-agagaagaccaaccacatccag-3'5'-acctgggtccctttgtcac-3'rs1797855'-acttcatgtacgtggacggg-3'5'-cccatccgctggttcatttg-3'rs21883805'-ttccagttcctccacattctt-3'5'-ttacagcaacccttggaatct-3'rs122368715'-tgagtaaacagtatgatgtggct-3'5'-catgtgtgggctccagtataa-3'或上述引物的衍生序列，所述衍生序列為向5’端和/或3’端方向延伸一致數(shù)個(gè)堿基或刪減一致數(shù)個(gè)堿基得到的序列。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的方法，該結(jié)果可用于基因snp位點(diǎn)相關(guān)的痛風(fēng)易患性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，該方法包括如下步驟：(1)構(gòu)建重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒：所述重組陰性質(zhì)粒的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中seqidno.1-seqidno.8，所述重組陽(yáng)性質(zhì)粒的核苷酸序列參見(jiàn)序列表中seqidno.9-seqidno.16；(2)提取待測(cè)樣本的外周血基因組dna，對(duì)重組陰性質(zhì)粒、重組陽(yáng)性質(zhì)粒和待測(cè)樣本的dna均進(jìn)行pcr擴(kuò)增和hrm分析，收集數(shù)據(jù)；pcr擴(kuò)增引物序列為上面提及的序列對(duì)或這些序列對(duì)的衍生序列，所述衍生序列為向5’端和/或3’端方向延伸一致數(shù)個(gè)堿基或刪減一致數(shù)個(gè)堿基得到的序列；作為優(yōu)選，所述pcr擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)體系為：作為優(yōu)選，所述pcr擴(kuò)增時(shí)的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s；40個(gè)循環(huán)。作為優(yōu)選，所述hrm分析的條件為：94℃90s；60℃30s；83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。(3)根據(jù)收集數(shù)據(jù)繪制高分辨率熔解曲線，根據(jù)重組陰性質(zhì)粒、重組陽(yáng)性質(zhì)粒的熔解曲線判斷待測(cè)樣本snp位點(diǎn)的基因型：如果與重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線重合，則痛風(fēng)易感基因位點(diǎn)rs2231142的基因型為cc；rs72552713的基因型為cc；rs11653176的基因型為tt；rs4073582的基因型為gg；rs1260326的基因型為tt；rs179785的基因型為gg；rs2188380的基因型為tt；rs12236871的基因型為aa；如果與重組陽(yáng)性質(zhì)粒的熔解曲線重合，則痛風(fēng)易感基因snp位點(diǎn)rs2231142的基因型為aa；rs72552713的基因型為tt；rs11653176的基因型為cc；rs4073582的基因型為aa；rs1260326的基因型為cc；rs179785的基因型為aa；rs2188380的基因型為cc；rs12236871的基因型為gg；如果在重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒之間的，則痛風(fēng)易感基因位點(diǎn)rs2231142的基因型為ca，rs72552713的基因型為ct；rs11653176的基因型為ct；rs4073582的基因型為ga；rs1260326的基因型為ct；rs179785的基因型為ag；rs2188380的基因型為ct；rs12236871的基因型為ga。本發(fā)明還提供一種試劑盒，所述的試劑盒內(nèi)包含有上述引物對(duì)或其衍生序列、重組陰性質(zhì)粒、重陽(yáng)性質(zhì)粒和pcr試劑。所述的試劑盒用于輔助評(píng)估痛風(fēng)易患性。本發(fā)明的有益效果在于，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)rs2231142，rs72552713，rs11653176，rs4073582，rs1260326，rs179785，rs2188380的基因型，靈敏度高，特異性好，檢測(cè)迅速；應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)上述8個(gè)痛風(fēng)易感基因位點(diǎn)基因型的分型與測(cè)序結(jié)果完全一致，能夠用于痛風(fēng)易患性的輔助判斷。附圖說(shuō)明附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。以rs2231142為例，在附圖中：圖1為本發(fā)明的hrm方法靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖2為樣本用本發(fā)明的hrm方法分析結(jié)果。圖3為樣本的rs2231142(c.421c>a)位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果；其中a為野生型序列，b為雜合突變型序列，c為純合突變型序列。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)闡述，以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下面實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。所用引物和所用序列合成及測(cè)序工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。實(shí)施例1rs2231142標(biāo)準(zhǔn)品的制備要建立hrm分析方法，首先必須制備方法所需的外部標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含高度保守和特異性的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。本研究合成包含rs2231142(c.421c>a)位點(diǎn)的野生型和純合突變型dna序列，利用基因重組技術(shù)將其克隆到pmd18-t載體中，構(gòu)建出pmd18-t-rs2231142的野生型和純合突變型重組質(zhì)粒，并進(jìn)行相應(yīng)的pcr鑒定和測(cè)序鑒定，最后經(jīng)定量后作為待建立方法的標(biāo)準(zhǔn)品，為下一步的方法及評(píng)估奠定基礎(chǔ)。一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs2231142的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成rs2231142(c.421c>a)野生型和純合突變型dna序列，本發(fā)明合成的序列228bp(如seqidno.1)，序列如下：(1)野生型序列taaacagtcatggtcttagaaaagactcattatcattatgtctcattaaaatgctatttgccttaaggatgatgttgtgatgggcactctgacggtgagagaaaacttacagttctcagcagctcttcggcttgcaacaactatgacgaatcatgaaaaaaacgaacggattaacagggtcattcaagagttaggtctggataaagtggcagactccaaggtaatgtg(2)純合突變型序列(seqidno.9)taaacagtcatggtcttagaaaagactcattatcattatgtctcattaaaatgctatttgccttaaggatgatgttgtgatgggcactctgacggtgagagaaaacttaaagttctcagcagctcttcggcttgcaacaactatgacgaatcatgaaaaaaacgaacggattaacagggtcattcaagagttaggtctggataaagtggcagactccaaggtaatgtg2.連接反應(yīng)：將上述合成的dna片段與pmd18-t進(jìn)行連接，采用如下連接體系進(jìn)行配制：配制完成后置于16℃進(jìn)行過(guò)夜連接反應(yīng)。3.pmd18-t-rs2231142質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及pcr鑒定(1)從-80℃的超低溫冰箱中取出凍存的dh5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰盒上使其解凍。(2)取連接產(chǎn)物10μl加入50μl的dh5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘。(3)42℃水浴熱激90秒，熱激后立即置冰上冷卻2min。(4)于1.5mlep管中加入預(yù)冷的1ml的不含抗性的lb液體培養(yǎng)基吹打混勻后，37℃120轉(zhuǎn)輕搖培養(yǎng)90min。(5)將上述培養(yǎng)液短暫離心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含amp抗生素的lb平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過(guò)夜。(6)從平板上挑取單克隆菌落于500μlamp抗性lb液體培養(yǎng)基的1.5mlep管中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)5-6小時(shí)。(7)取1μl作為模板進(jìn)行菌液pcr鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的菌液加入到20ml的lb液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)搖。(8)用rs2231142的上下游引物擴(kuò)增上述稀釋菌液，pcr產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)檢測(cè)pcr產(chǎn)物鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：rs2231142-f5'-gatgggcactctgacggt-3'下游引物：rs2231142-r5'-gttgttgcaagccgaagagc-3'體系如下：擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取采用北京百泰克公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒，測(cè)定濃度和純度，同時(shí)取10ul純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。二、標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量(1)將步驟一得到的凍存的含有重組質(zhì)粒pmd18-t-rs2231142的大腸桿菌dh5a100ul接種于15ml氨芐抗性的lb液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)14-16h；(2)采用北京百泰克生物科技有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒；(3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(nd5000)對(duì)提取的質(zhì)粒測(cè)定濃度，根據(jù)a260/a280判斷質(zhì)粒的純度。實(shí)施例2abcg2rs72552713標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs72552713的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成abcg2rs72552713(c.376c>t)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列300bp，序列如下：(1)野生型序列tcttataggttattagatgtcttagctgcaaggaaagatccaagtggattatctggagatgttctgataaatggagcaccgcgacctgccaatttcaaatgtaattcaggttacgtggtacaagtaagtattagtgggtttgcattttctgtttcctctgtttctatatgggtaagtgctttggctgatagttcaatgtgcttccagttgattatgtgacatggtcctagaactgacgttctttacagcagcttttcttaatttctcatagacacttatgtgaaaaggcagggagaatct(2)純合突變型序列tcttataggttattagatgtcttagctgcaaggaaagatccaagtggattatctggagatgttctgataaatggagcaccgcgacctgccaatttcaaatgtaattcaggttacgtggtataagtaagtattagtgggtttgcattttctgtttcctctgtttctatatgggtaagtgctttggctgatagttcaatgtgcttccagttgattatgtgacatggtcctagaactgacgttctttacagcagcttttcttaatttctcatagacacttatgtgaaaaggcagggagaatct連接反應(yīng)，pmd18-t-rs72552713質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs72552713質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物abcg2-f和abcg2-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：abcg2-f5'-cgcgacctgccaatttcaa-3'下游引物：abcg2-r5'-tcagccaaagcacttaccca-3'實(shí)施例3bcas3rs11653176標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs11653176的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成bcas3rs11653176(c.2638+1514t>c)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列270bp，序列如下：(1)野生型序列g(shù)gaagggggcctaagtgaggaatgtggcttacggcacaggcttttgcctgcatctctggggtccctagccagcctcggctcacataaaccggagcccggtgccactggacccatccccggcagcctccctcttccgaggcctggaggagctcccgggtggctcttctctcccaccgccttctcaggagccccttggagcatctcactgtcatccggcaagaggatttgaaggtgcattgagtcacagctgtggaacttcagcctggcata(2)純合突變型序列g(shù)gaagggggcctaagtgaggaatgtggcttacggcacaggcttttgcctgcatctctggggtccctagccagcctcggctcacataaaccggagcccggtgccactggacccatccccggcagcctccctcttccgaggcctggaggagctcccgggtggctcttctctcccaccgcctcctcaggagccccttggagcatctcactgtcatccggcaagaggatttgaaggtgcattgagtcacagctgtggaacttcagcctggcata連接反應(yīng)，pmd18-t-rs11653176質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs11653176質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物bcas3-f和bcas3-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：bcas3-f5'-gggtggctcttctctccca-3'下游引物：bcas3-r5'-tcttgccggatgacagtgag-3'實(shí)施例4cnih2rs4073582標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs4073582的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成cnih2rs4073582(c.312-7g>a)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列350bp，序列如下：(1)野生型序列g(shù)cctcttctgtctgatgtttctgtgtgcagcagagtgggtgaccctgggcctcaacatccccctcctcttctaccacctctggaggtgagggtagcagctgccttggggaggctgagatggggaacaggggcaggatgggggtgggagtcctgatggcagacactcaggcccctgtctgccccaggtacttccaccgtcctgcagatggctctgaggtcatgtatgatgcggtctccatcatgaatgctgacattctcaactactgccagaaggagtcctggtgcaaacttgccttctacctgctctccttcttctattacctgtacaggtgaggccttgcccacagcag(2)純合突變型序列g(shù)cctcttctgtctgatgtttctgtgtgcagcagagtgggtgaccctgggcctcaacatccccctcctcttctaccacctctggaggtgagggtagcagctgccttggggaggctgagatggggaacaggggcaggatgggggtgggagtcctgatggcagacactcaggcccctgtctaccccaggtacttccaccgtcctgcagatggctctgaggtcatgtatgatgcggtctccatcatgaatgctgacattctcaactactgccagaaggagtcctggtgcaaacttgccttctacctgctctccttcttctattacctgtacaggtgaggccttgcccacagcag連接反應(yīng)，pmd18-t-rs4073582質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs4073582質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物cnih2-f和cnih2-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：cnih2-f5'-ggagtcctgatggcagacac-3'下游引物：cnih2-r5'-ctgcaggacggtggaagtac-3'實(shí)施例5gckrrs1260326標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs1260326的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成gckrrs1260326(c.1337t>c)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列300bp，序列如下：(1)野生型序列caggggagcaggaggaacagctgcacagccagcctttcgactctgatgccctccccttctcctagacaacctcacggaggtgcagactatagtggagcaggtgaaagagaagaccaaccacatccaggccctggcacacagcaccgtgggtcagaccttgctggtgagagtccagccgtgacaaagggacccaggtggcagttgcagccaggccttcctggagatgcctctcctgctcctctttctctctctccagatccctctgaagaagctctttccctccatcatcagcatcacatg(2)純合突變型序列caggggagcaggaggaacagctgcacagccagcctttcgactctgatgccctccccttctcctagacaacctcacggaggtgcagactatagtggagcaggtgaaagagaagaccaaccacatccaggccctggcacacagcaccgtgggtcagaccttgccggtgagagtccagccgtgacaaagggacccaggtggcagttgcagccaggccttcctggagatgcctctcctgctcctctttctctctctccagatccctctgaagaagctctttccctccatcatcagcatcacatg連接反應(yīng)，pmd18-t-rs1260326質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs1260326質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物gckr-f和gckr-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：gckr-f5'-agagaagaccaaccacatccag-3'下游引物：gckr-r5'-acctgggtccctttgtcac-3'實(shí)施例6kcnq1rs179785標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs179785的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成kcnq1rs179785(c.1515-8555g>a)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列228bp，序列如下：(1)野生型序列aatttgacctatccagaaacaacggctccttcagtgggctcagcccctgagaccactcagcctgggctgtgtgcccagcggcacttcatgtacgtggacggggcaggcgggcaggcgggcgtggaggagctaatgggtaagttaggcagcacattaacaaatgaaccagcggatgggggtggggagctcatctcattcatctacaaattattaacaataacttgttca(2)純合突變型序列aatttgacctatccagaaacaacggctccttcagtgggctcagcccctgagaccactcagcctgggctgtgtgcccagcggcacttcatgtacgtggacggggcaggcgggcaggcaggcgtggaggagctaatgggtaagttaggcagcacattaacaaatgaaccagcggatgggggtggggagctcatctcattcatctacaaattattaacaataacttgttca連接反應(yīng)，pmd18-t-rs179785質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs179785質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物kcnq1-f和kcnq1-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：kcnq1-f5'-acttcatgtacgtggacggg-3'下游引物：kcnq1-r5'-cccatccgctggttcatttg-3'實(shí)施例7myl2-cux2rs2188380標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs2188380的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成myl2-cux2rs2188380(n.338-9699t>c)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列250bp，序列如下：(1)野生型序列ccaaactggtttccaaagcgcttgtactatcttacattcccatcagcaatgtacaagagttccagttcctccacattcttccccagcatttggaatggtcaatatattagattccaagggttgctgtaattaattgccacaaactgggggtcttaaaacaagagaaacgtgttttctcacagctctggaggccagaagtttaaagtcaagagtcagcagggttgattccctctggaggctctcagggaga(2)純合突變型序列ccaaactggtttccaaagcgcttgtactatcttacattcccatcagcaatgtacaagagttccagttcctccacattcttccccagcatttggaatggtcaatacattagattccaagggttgctgtaattaattgccacaaactgggggtcttaaaacaagagaaacgtgttttctcacagctctggaggccagaagtttaaagtcaagagtcagcagggttgattccctctggaggctctcagggaga連接反應(yīng)，pmd18-t-rs2188380質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs2188380質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物myl2-cux2-f和myl2-cux2-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：myl2-cux2-f5'-ttccagttcctccacattctt-3'下游引物：myl2-cux2-r5'-ttacagcaacccttggaatct-3'實(shí)施例8rfx3rs12236871標(biāo)準(zhǔn)品的制備一、重組陰性和陽(yáng)性質(zhì)粒pmd18-t-rs12236871的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1.合成rfx3rs12236871(n.287-13406a>g)野生型和純合突變型dna序列，本申請(qǐng)合成的序列250bp，序列如下：(1)野生型序列ataggtgttttgggaagtatgcattgcagctcaaaggagctttgaatcatgtgaaaaatatttttgataaaaatatgagtaaacagtatgatgtggctaccaaataaactgagttttaatactacattagcaaaattatacagaaagaaggaactaattatctctttgcatttatactggagcccacacatggactaatgctaggttctgacactttaaaaggatgaataggcacatctgtatttccaga(2)純合突變型序列ataggtgttttgggaagtatgcattgcagctcaaaggagctttgaatcatgtgaaaaatatttttgataaaaatatgagtaaacagtatgatgtggctaccaaataagctgagttttaatactacattagcaaaattatacagaaagaaggaactaattatctctttgcatttatactggagcccacacatggactaatgctaggttctgacactttaaaaggatgaataggcacatctgtatttccaga連接反應(yīng)，pmd18-t-rs12236871質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件，重組陰性質(zhì)粒和重組陽(yáng)性質(zhì)粒提取及標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量同實(shí)施例1。pmd18-t-rs12236871質(zhì)粒的pcr鑒定，用引物rfx3-f和rfx3-r擴(kuò)增上述稀釋菌液。引物序列為hrm分析所用引物，序列如下：上游引物：rfx3-f5'-tgagtaaacagtatgatgtggct-3'下游引物：rfx3-r5'-catgtgtgggctccagtataa-3'實(shí)施例9hrm-pcr檢測(cè)rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871方法的建立一、待測(cè)樣本的制備提取30例樣本的外周血基因組dna，用作rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因pcr擴(kuò)增的模板(1)取1ml全血，加入3mlte，顛倒混勻后靜置10min，8000rpm離心5分鐘，棄上清液。(2)重復(fù)上述步驟2-3次至沉淀為白色(3)加入900ul10％sds和10ul10mg/ml蛋白酶k，55℃水浴1h。(4)將離心管冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心10min。(5)小心吸取上清后再加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心10min。(6)取上清，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清。(7)加500ul70％的乙醇洗滌沉淀，短暫離心后棄上清，開(kāi)蓋干燥至乙醇完全揮發(fā)。(8)加50ul雙蒸水或te溶解dna中，-20℃保存。二、特異性引物的設(shè)計(jì)與合成本發(fā)明通過(guò)對(duì)ensemble數(shù)據(jù)庫(kù)中rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因序列進(jìn)行檢索，選取適合設(shè)計(jì)引物的片段序列為靶目標(biāo)，應(yīng)用primerexpress3軟件、primerpremier5軟件以及oligo7軟件，設(shè)計(jì)了一組hrm-pcr引物。1、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增序列rs2231142如下：5’-aatgctatttgccttaaggatgatgttgtgatgggcactctgacggtgagagaaaacttacagttctcagcagctcttcggcttgcaacaactatgacgaatcatgaaaaaaacg-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：rs2231142-f5'-gatgggcactctgacggt-3'下游引物：rs2231142-r5'-gttgttgcaagccgaagagc-3'擴(kuò)增片段大小為：63bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-gatgggcactctgacggtgagagaaaacttacagttctcagcagctcttcggcttgcaacaac-3’/2、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs72552713序列如下：5’-tctggagatgttctgataaatggagcaccgcgacctgccaatttcaaatgtaattcaggttacgtggtacaagtaagtattagtgggtttgcattttctgtttcctctgtttctatatgggtaagtgctttggctgatagttcaatgtgcttccagttgattatgtga-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：abcg2-f5'-cgcgacctgccaatttcaa-3'下游引物：abcg2-r5'-tcagccaaagcacttaccca-3'擴(kuò)增片段大小為：109bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-cgcgacctgccaatttcaaatgtaattcaggttacgtggtacaagtaagtattagtgggtttgcattttctgtttcctctgtttctatatgggtaagtgctttggctga-3’3、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs11653176序列如下：5’-ccactggacccatccccggcagcctccctcttccgaggcctggaggagctcccgggtggctcttctctcccaccgccttctcaggagccccttggagcatctcactgtcatccggcaagaggatttgaaggtgcattgag-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：bcas3-f5'-gggtggctcttctctccca-3'下游引物：bcas3-r5'-tcttgccggatgacagtgag-3'擴(kuò)增片段大小為：87bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-gggtggctcttctctcccaccgccttctcaggagccccttggagcatctcactgtcatccggcaaga-3’4、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs4073582序列如下：5’-gatggggaacaggggcaggatgggggtgggagtcctgatggcagacactcaggcccctgtctgccccaggtacttccaccgtcctgcagatggctctgaggtcatgtatgatgcg-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：cnih2-f5'-ggagtcctgatggcagacac-3'下游引物：cnih2-r5'-ctgcaggacggtggaagtac-3'擴(kuò)增片段大小為：61bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-ggagtcctgatggcagacactcaggcccctgtctgccccaggtacttccaccgtcctgcag-3’5、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs1260326序列如下：5’-gcagactatagtggagcaggtgaaagagaagaccaaccacatccaggccctggcacacagcaccgtgggtcagaccttgctggtgagagtccagccgtgacaaagggacccaggtggcagttgcagccaggcctt-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：gckr-f5'-agagaagaccaaccacatccag-3'下游引物：gckr-r5'-acctgggtccctttgtcac-3'擴(kuò)增片段大小為：91bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-agagaagaccaaccacatccaggccctggcacacagcaccgtgggtcagaccttgctggtgagagtccagccgtgacaaagggacccaggt-3’6、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs179785序列如下：5’-gcctgggctgtgtgcccagcggcacttcatgtacgtggacggggcaggcgggcaggcgggcgtggaggagctaatgggtaagttaggcagcacattaacaaatgaaccagcggatgggggtggggagctcatctcattca-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：kcnq1-f5'-acttcatgtacgtggacggg-3'下游引物：kcnq1-r5'-cccatccgctggttcatttg-3'擴(kuò)增片段大小為：95bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-acttcatgtacgtggacggggcaggcgggcaggcgggcgtggaggagctaatgggtaagttaggcagcacattaacaaatgaaccagcggatggg-3’7、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs2188380序列如下：5’-atcttacattcccatcagcaatgtacaagagttccagttcctccacattcttccccagcatttggaatggtcaatatattagattccaagggttgctgtaattaattgccacaaactgggggtcttaaaacaagagaaa-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：myl2-cux2-f5'-ttccagttcctccacattctt-3'下游引物：myl2-cux2-r5'-ttacagcaacccttggaatct-3'擴(kuò)增片段大小為：70bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-ttccagttcctccacattcttccccagcatttggaatggtcaatatattagattccaagggttgctgtaa-3’8、本申請(qǐng)選取的擴(kuò)增rs12236871序列如下：5’-ctcaaaggagctttgaatcatgtgaaaaatatttttgataaaaatatgagtaaacagtatgatgtggctaccaaataaactgagttttaatactacattagcaaaattatacagaaagaaggaactaattatctctttgcatttatactggagcccacacatggactaatgctaggttctgacactttaaaaggatgaata-3’其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。該引物序列如下：上游引物：rfx3-f5'-tgagtaaacagtatgatgtggct-3'下游引物：rfx3-r5'-catgtgtgggctccagtataa-3'擴(kuò)增片段大小為：117bp。擴(kuò)增的核苷酸序列為：5’-tgagtaaacagtatgatgtggctaccaaataaactgagttttaatactacattagcaaaattatacagaaagaaggaactaattatctctttgcatttatactggagcccacacatg-3’三、hrm-pcr反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以dna為模板，以上述引物為擴(kuò)增引物，采用下述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr體系：其中引物采用rs2231142-f和rs2231142-r；rs72552713-f和rs72552713-r、rs11653176-f和rs11653176-r；rs4073582-f和rs4073582-r；rs1260326-f和rs1260326-r；rs179785-f和rs179785-r；rs2188380-f和rs2188380-r、rs12236871-f和rs12236871-r，hrm-pcr采用生工生物(上海)，green-2-goqpcrmastermix試劑盒。hrm分析儀為百源基因asa-9600實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀。pcr擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20shrm分析：94℃90s60℃30sec83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。四、靈敏度實(shí)驗(yàn)將重組陽(yáng)性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒均稀釋至50ng/μl，然后二者混合進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)亟M陽(yáng)性質(zhì)粒占比依次為50％、25％、12.5％、5％、2％和1％，按照上述hrm-pcr反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，分析突變檢出范圍，即靈敏度。反應(yīng)體系如下：pcr擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20shrm分析：94℃90s60℃30sec83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。結(jié)果參照?qǐng)D1，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)rs2231142陽(yáng)性質(zhì)粒與陰性質(zhì)粒體積比分別為1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99時(shí)，能檢測(cè)出陽(yáng)性質(zhì)粒，所以本申請(qǐng)所用hrm檢測(cè)方法的靈敏度為1％。實(shí)施例3應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)樣本基因突變已實(shí)施例9步驟中的檢測(cè)條件，對(duì)35例樣本進(jìn)行hrm分析，與rs2231142陽(yáng)性質(zhì)粒和陰性質(zhì)粒熔解曲線對(duì)照比較，依此確定樣本中的突變類(lèi)型。根據(jù)hrm分析結(jié)果針對(duì)每種基因型隨機(jī)挑選1個(gè)樣本在生工生物(上海)進(jìn)行sanger測(cè)序驗(yàn)證。hrm分析結(jié)果參見(jiàn)表1和圖2，數(shù)據(jù)顯示20例樣本中痛風(fēng)易感基因snp位點(diǎn)rs2231142野生型有21例，c>a雜合突變型有9例，c>a純合突變型5例。sanger測(cè)序結(jié)果參見(jiàn)圖3：其中a為樣本編號(hào)6的測(cè)序結(jié)果，b為樣本編號(hào)21的測(cè)序結(jié)果，c為樣本編號(hào)33的測(cè)序結(jié)果；與本發(fā)明方法檢測(cè)的結(jié)果完全一致。表1應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)樣本的分析結(jié)果樣本編號(hào)基因型樣本編號(hào)基因型1純合突變型19雜合突變型2野生型20野生型3野生型21雜合突變型4雜合突變型22野生型5雜合突變型23野生型6野生型24雜合突變型7野生型25純合突變型8野生型26野生型9野生型27雜合突變型10雜合突變型28野生型11野生型29雜合突變型12野生型30野生型13野生型31野生型14純合突變型32野生型15野生型33純合突變型16雜合突變型34野生型17野生型35野生型18純合突變型實(shí)施例4用于檢測(cè)痛風(fēng)易感基因8個(gè)snp位點(diǎn)基因型的試劑盒本發(fā)明的用于檢測(cè)rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的試劑盒包括以下組分：(1)rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871標(biāo)準(zhǔn)品；(2)引物：8個(gè)snp位點(diǎn)引物序列為：(3)含飽和熒光染料evagreen的pcr擴(kuò)增試劑應(yīng)用該試劑盒檢測(cè)痛風(fēng)易感基因snp位點(diǎn)rs2231142、rs72552713、rs11653176、rs4073582、rs1260326、rs179785、rs2188380、rs12236871基因型的方法與實(shí)施例9相同。最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>潔若,古<120>一種檢測(cè)痛風(fēng)易感基因snp基因型的方法、試劑盒及引物<130>pj171<160>32<170>patentinversion3.3<210>1<211>228<212>dna<213>人工序列<400>1taaacagtcatggtcttagaaaagactcattatcattatgtctcattaaaatgctatttg60ccttaaggatgatgttgtgatgggcactctgacggtgagagaaaacttacagttctcagc120agctcttcggcttgcaacaactatgacgaatcatgaaaaaaacgaacggattaacagggt180cattcaagagttaggtctggataaagtggcagactccaaggtaatgtg228<210>2<211>300<212>dna<213>人工序列<400>2tcttataggttattagatgtcttagctgcaaggaaagatccaagtggattatctggagat60gttctgataaatggagcaccgcgacctgccaatttcaaatgtaattcaggttacgtggta120caagtaagtattagtgggtttgcattttctgtttcctctgtttctatatgggtaagtgct180ttggctgatagttcaatgtgcttccagttgattatgtgacatggtcctagaactgacgtt240ctttacagcagcttttcttaatttctcatagacacttatgtgaaaaggcagggagaatct300<210>3<211>270<212>dna<213>人工序列<400>3ggaagggggcctaagtgaggaatgtggcttacggcacaggcttttgcctgcatctctggg60gtccctagccagcctcggctcacataaaccggagcccggtgccactggacccatccccgg120cagcctccctcttccgaggcctggaggagctcccgggtggctcttctctcccaccgcctt180ctcaggagccccttggagcatctcactgtcatccggcaagaggatttgaaggtgcattga240gtcacagctgtggaacttcagcctggcata270<210>4<211>350<212>dna<213>人工序列<400>4gcctcttctgtctgatgtttctgtgtgcagcagagtgggtgaccctgggcctcaacatcc60ccctcctcttctaccacctctggaggtgagggtagcagctgccttggggaggctgagatg120gggaacaggggcaggatgggggtgggagtcctgatggcagacactcaggcccctgtctgc180cccaggtacttccaccgtcctgcagatggctctgaggtcatgtatgatgcggtctccatc240atgaatgctgacattctcaactactgccagaaggagtcctggtgcaaacttgccttctac300ctgctctccttcttctattacctgtacaggtgaggccttgcccacagcag350<210>5<211>300<212>dna<213>人工序列<400>5caggggagcaggaggaacagctgcacagccagcctttcgactctgatgccctccccttct60cctagacaacctcacggaggtgcagactatagtggagcaggtgaaagagaagaccaacca120catccaggccctggcacacagcaccgtgggtcagaccttgctggtgagagtccagccgtg180acaaagggacccaggtggcagttgcagccaggccttcctggagatgcctctcctgctcct240ctttctctctctccagatccctctgaagaagctctttccctccatcatcagcatcacatg300<210>6<211>228<212>dna<213>人工序列<400>6aatttgacctatccagaaacaacggctccttcagtgggctcagcccctgagaccactcag60cctgggctgtgtgcccagcggcacttcatgtacgtggacggggcaggcgggcaggcgggc120gtggaggagctaatgggtaagttaggcagcacattaacaaatgaaccagcggatgggggt180ggggagctcatctcattcatctacaaattattaacaataacttgttca228<210>7<211>250<212>dna<213>人工序列<400>7ccaaactggtttccaaagcgcttgtactatcttacattcccatcagcaatgtacaagagt60tccagttcctccacattcttccccagcatttggaatggtcaatatattagattccaaggg120ttgctgtaattaattgccacaaactgggggtcttaaaacaagagaaacgtgttttctcac180agctctggaggccagaagtttaaagtcaagagtcagcagggttgattccctctggaggct240ctcagggaga250<210>8<211>250<212>dna<213>人工序列<400>8ataggtgttttgggaagtatgcattgcagctcaaaggagctttgaatcatgtgaaaaata60tttttgataaaaatatgagtaaacagtatgatgtggctaccaaataaactgagttttaat120actacattagcaaaattatacagaaagaaggaactaattatctctttgcatttatactgg180agcccacacatggactaatgctaggttctgacactttaaaaggatgaataggcacatctg240tatttccaga250<210>9<211>228<212>dna<213>人工序列<400>9taaacagtcatggtcttagaaaagactcattatcattatgtctcattaaaatgctatttg60ccttaaggatgatgttgtgatgggcactctgacggtgagagaaaacttaaagttctcagc120agctcttcggcttgcaacaactatgacgaatcatgaaaaaaacgaacggattaacagggt180cattcaagagttaggtctggataaagtggcagactccaaggtaatgtg228<210>10<211>300<212>dna<213>人工序列<400>10tcttataggttattagatgtcttagctgcaaggaaagatccaagtggattatctggagat60gttctgataaatggagcaccgcgacctgccaatttcaaatgtaattcaggttacgtggta120taagtaagtattagtgggtttgcattttctgtttcctctgtttctatatgggtaagtgct180ttggctgatagttcaatgtgcttccagttgattatgtgacatggtcctagaactgacgtt240ctttacagcagcttttcttaatttctcatagacacttatgtgaaaaggcagggagaatct300<210>11<211>270<212>dna<213>人工序列<400>11ggaagggggcctaagtgaggaatgtggcttacggcacaggcttttgcctgcatctctggg60gtccctagccagcctcggctcacataaaccggagcccggtgccactggacccatccccgg120cagcctccctcttccgaggcctggaggagctcccgggtggctcttctctcccaccgcctc180ctcaggagccccttggagcatctcactgtcatccggcaagaggatttgaaggtgcattga240gtcacagctgtggaacttcagcctggcata270<210>12<211>350<212>dna<213>人工序列<400>12gcctcttctgtctgatgtttctgtgtgcagcagagtgggtgaccctgggcctcaacatcc60ccctcctcttctaccacctctggaggtgagggtagcagctgccttggggaggctgagatg120gggaacaggggcaggatgggggtgggagtcctgatggcagacactcaggcccctgtctac180cccaggtacttccaccgtcctgcagatggctctgaggtcatgtatgatgcggtctccatc240atgaatgctgacattctcaactactgccagaaggagtcctggtgcaaacttgccttctac300ctgctctccttcttctattacctgtacaggtgaggccttgcccacagcag350<210>13<211>300<212>dna<213>人工序列<400>13caggggagcaggaggaacagctgcacagccagcctttcgactctgatgccctccccttct60cctagacaacctcacggaggtgcagactatagtggagcaggtgaaagagaagaccaacca120catccaggccctggcacacagcaccgtgggtcagaccttgccggtgagagtccagccgtg180acaaagggacccaggtggcagttgcagccaggccttcctggagatgcctctcctgctcct240ctttctctctctccagatccctctgaagaagctctttccctccatcatcagcatcacatg300<210>14<211>228<212>dna<213>人工序列<400>14aatttgacctatccagaaacaacggctccttcagtgggctcagcccctgagaccactcag60cctgggctgtgtgcccagcggcacttcatgtacgtggacggggcaggcgggcaggcaggc120gtggaggagctaatgggtaagttaggcagcacattaacaaatgaaccagcggatgggggt180ggggagctcatctcattcatctacaaattattaacaataacttgttca228<210>15<211>250<212>dna<213>人工序列<400>15ccaaactggtttccaaagcgcttgtactatcttacattcccatcagcaatgtacaagagt60tccagttcctccacattcttccccagcatttggaatggtcaatacattagattccaaggg120ttgctgtaattaattgccacaaactgggggtcttaaaacaagagaaacgtgttttctcac180agctctggaggccagaagtttaaagtcaagagtcagcagggttgattccctctggaggct240ctcagggaga250<210>16<211>250<212>dna<213>人工序列<400>16ataggtgttttgggaagtatgcattgcagctcaaaggagctttgaatcatgtgaaaaata60tttttgataaaaatatgagtaaacagtatgatgtggctaccaaataagctgagttttaat120actacattagcaaaattatacagaaagaaggaactaattatctctttgcatttatactgg180agcccacacatggactaatgctaggttctgacactttaaaaggatgaataggcacatctg240tatttccaga250<210>17<211>18<212>dna<213>人工序列<400>17gatgggcactctgacggt18<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18gttgttgcaagccgaagagc20<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<400>19cgcgacctgccaatttcaa19<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20tcagccaaagcacttaccca20<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<400>21gggtggctcttctctccca19<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<400>22tcttgccggatgacagtgag20<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<400>23ggagtcctgatggcagacac20<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<400>24ctgcaggacggtggaagtac20<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<400>25agagaagaccaaccacatccag22<210>26<211>19<212>dna<213>人工序列<400>26acctgggtccctttgtcac19<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27acttcatgtacgtggacggg20<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列<400>28cccatccgctggttcatttg20<210>29<211>21<212>dna<213>人工序列<400>29ttccagttcctccacattctt21<210>30<211>21<212>dna<213>人工序列<400>30ttacagcaacccttggaatct21<210>31<211>23<212>dna<213>人工序列<400>31tgagtaaacagtatgatgtggct23<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列<400>32catgtgtgggctccagtataa21當(dāng)前第1頁(yè)12