本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種遺傳性耳聾基因檢測產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
：耳聾聽覺功能障礙是人類最常見的感覺功能障礙之一，居各類殘疾人群之首，嚴(yán)重影響著患者的交流，對(duì)患者的日常生活產(chǎn)生重大影響。近年來，我國耳聾發(fā)病率明顯增加，全國每年新出生耳聾患兒3萬左右，新生兒耳聾的發(fā)生率為3‰。耳聾的病因復(fù)雜多樣，涉及遺傳、感染、外傷、藥物應(yīng)用不當(dāng)、免疫性疾病、生理機(jī)能退化、噪聲、化學(xué)物質(zhì)中毒及心理因素等諸多因素，其中60％的耳聾是由遺傳因素所導(dǎo)致的，分為綜合癥型耳聾和非綜合征型耳聾兩大類，后者占全部遺傳性耳聾的70％左右。非綜合征型耳聾共同有4種遺傳方式，常染色體顯性遺傳占15％，隱性遺傳占80％，x-連鎖遺傳占1％到3％，線粒體遺傳占1％以下。綜合征型耳聾占遺傳因素所致耳聾的30％，但目前發(fā)現(xiàn)400多種。近年來大量的研究證實(shí)，絕大多數(shù)遺傳性耳聾是由于單個(gè)基因的遺傳物質(zhì)異常導(dǎo)致的，而且單個(gè)基因的雙等位基因突變在其中占據(jù)主導(dǎo)地位。在我國大多數(shù)非綜合征型遺傳性耳聾患者僅由為數(shù)不多的幾個(gè)基因突變所導(dǎo)致，其中g(shù)jb2、gjb3、slc26a4、mtdna12srrna基因?yàn)樽畛Ｒ姷亩@致病基因，通過對(duì)以上幾個(gè)基因進(jìn)行檢測，對(duì)遺傳性耳聾進(jìn)行篩查，對(duì)于人類的文明與進(jìn)步具有重要的意義。近年來，國內(nèi)相繼報(bào)道了先天性耳聾基因或者易感性耳聾基因的基因診斷試劑盒及其檢測方法，目前監(jiān)測耳聾基因dna的方法主要基于芯片技術(shù)、測序技術(shù)和熒光檢測技術(shù)，存在操作復(fù)雜，耗時(shí)長、成本高、不能同時(shí)對(duì)不同基因的多個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測。鑒于遺傳性耳聾突變異質(zhì)性強(qiáng)、涉及的基因多，位點(diǎn)多，以及人群攜帶致病基因比例高等特點(diǎn)，因此有必要建立一種高通量、高效率、低成本的基因突變檢測方法和產(chǎn)品，以實(shí)現(xiàn)臨床快速檢測以及全國人群的普遍篩查。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種遺傳性耳聾基因檢測產(chǎn)品，該產(chǎn)品能夠高通量、高效率、低成本的實(shí)現(xiàn)耳聾基因突變位點(diǎn)的檢測。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種遺傳性耳聾基因檢測產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括檢測人耳聾基因20個(gè)snp位點(diǎn)的試劑，所述snp位點(diǎn)分別為：1226g>a、1174a>t、1229c>t、1975g>c、2027t>a、235delc、299_300delat、176_191del16、167delt、109g>a、35delg、1555a>g、538c>t、547g>a、2162c>t、2168a>g、919-2a>g、508_511insaacg、1707+5g>a、589g>a。進(jìn)一步，所述snp位點(diǎn)還包括281c>t、1494c>t。進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括芯片、核酸膜條、試劑盒；其中，所述芯片包括固相載體以及固定在固相載體上的針對(duì)上述snp的寡核苷酸探針；所述核酸膜條包括基底和固定于所述基底上的寡核苷酸探針；所述試劑盒包括針對(duì)上述snp的芯片或核酸膜條或pcr擴(kuò)增引物序列。所述固相載體包括無機(jī)載體和有機(jī)載體，所述無機(jī)載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機(jī)載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等；所述基底可以是任何適于固定寡核苷酸探針的基底，例如尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅膠晶片、微縮磁珠等。進(jìn)一步，所述產(chǎn)品為試劑盒。進(jìn)一步，所述試劑盒包括pcr擴(kuò)增引物，pcr擴(kuò)增引物為根據(jù)所選擇的待檢測的耳聾易感基因設(shè)計(jì)的特異性針對(duì)每種耳聾易感基因的擴(kuò)增引物，所述擴(kuò)增引物可擴(kuò)增包括突變位點(diǎn)在內(nèi)的一段dna序列，由5’端的tag序列和針對(duì)目標(biāo)區(qū)域的特異性引物序列組成，5’端tag序列優(yōu)選5-15個(gè)堿基。優(yōu)選的，tag序列選用序列acgttggatg。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，pcr擴(kuò)增引物序列如seqidno.1～22所示，其中，針對(duì)1226g>a、1174a>t、1229c>t的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.1～2所示；針對(duì)1975g>c、2027t>a的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.3～4所示；針對(duì)235delc、299_300delat、176_191del16、167delt的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.5～6所示；針對(duì)109g>a、35delg的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.7～8所示；針對(duì)1555a>g的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.9～10所示；針對(duì)538c>t、547g>a的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.11～12所示；針對(duì)2162c>t、2168a>g的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.13～14所示；針對(duì)919-2a>g的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.15～16所示；針對(duì)508_511insaacg的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.17～18所示；針對(duì)1707+5g>a的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.19～20所示；針對(duì)589g>a的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.21～22所示。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括擴(kuò)增281c>t、1494c>t的擴(kuò)增引物，引物序列如seqidno.23～26所示，其中，針對(duì)281c>t的擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.23～24所示；針對(duì)1494c>t擴(kuò)增引物序列對(duì)如seqidno.25～26所示。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括單堿基延伸引物，引物序列如seqidno.27～46所示，其中，針對(duì)1226g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.27所示；針對(duì)1174a>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.28所示；針對(duì)1229c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.29所示；針對(duì)1975g>c的單堿基延伸引物序列如seqidno.30所示；針對(duì)2027t>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.31所示；針對(duì)235delc的單堿基延伸引物序列如seqidno.32所示；針對(duì)299_300delat的單堿基延伸引物序列如seqidno.33所示；針對(duì)176_191del16的單堿基延伸引物序列如seqidno.34所示；針對(duì)167delt的單堿基延伸引物序列如seqidno.35所示；針對(duì)109g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.36所示；針對(duì)35delg的單堿基延伸引物序列如seqidno.37所示；針對(duì)1555a>g的單堿基延伸引物序列如seqidno.38所示；針對(duì)538c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.39所示；針對(duì)547g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.40所示；針對(duì)2162c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.41所示；針對(duì)2168a>g的單堿基延伸引物序列如seqidno.42所示；針對(duì)919-2a>g的單堿基延伸引物序列如seqidno.43所示；針對(duì)508_511insaacg的單堿基延伸引物序列如seqidno.44所示；針對(duì)1707+5g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.45所示；針對(duì)589g>a的單堿基延伸引物序列如seqidno.46所示。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括針對(duì)281c>t、1494c>t的單堿基延伸引物，引物序列如seqidno.47～48所示，其中，針對(duì)281c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.47所示；針對(duì)1494c>t的單堿基延伸引物序列如seqidno.48所示。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括pcr緩沖液、25mmdntps、25mmmgcl2、5u/μlpcr酶。進(jìn)一步，所述試劑盒還包括試劑盒還包括iplex緩沖液、iplex終止混合物、iplex酶。進(jìn)一步，所述試劑盒還可包括：陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，純化樹脂，質(zhì)譜檢測芯片，人基因組dna提取試劑等試劑以及使用說明書或標(biāo)簽。本發(fā)明提供了一種遺傳性耳聾基因的檢測方法，檢測權(quán)利上面所述的snp位點(diǎn)，該方法包括以下步驟：(1)提取樣本中的基因組dna；(2)多重pcr：設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增引物，以步驟(1)中所得基因組dna為模板，通過一個(gè)多重?cái)U(kuò)增體系對(duì)所有的位點(diǎn)同時(shí)擴(kuò)增，得到包含snp位點(diǎn)的pcr產(chǎn)物；(3)pcr產(chǎn)物處理：使用堿性磷酸酶對(duì)步驟(2)的pcr產(chǎn)物處理；(4)單堿基延伸：設(shè)計(jì)延伸引物，在一個(gè)反應(yīng)體系中對(duì)步驟(3)得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸；(5)延伸產(chǎn)物純化：將步驟(4)得到的延伸產(chǎn)物進(jìn)行樹脂脫鹽處理；(6)質(zhì)譜儀檢測：將步驟(5)得到的純化后的延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到含有基質(zhì)的檢測芯片上，放入質(zhì)譜儀檢測，檢測數(shù)據(jù)并分析各突變位點(diǎn)的基因型。進(jìn)一步，所述檢測方法步驟(2)中pcr擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃5min，45個(gè)循環(huán)；4℃保存。進(jìn)一步，所述檢測方法步驟(4)中單堿基延伸的反應(yīng)條件為：94℃30s；[94℃5s，(52℃5s，80℃5s)×5]×40個(gè)循環(huán)，72℃3min；4℃保存。本方法中的多重pcr即是在同一pcr反應(yīng)體系中加入2對(duì)或2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的pcr反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般pcr相同。自1988年將多重pcr技術(shù)首先用以診斷杜氏肌營養(yǎng)不良征(dmd)以來，在許多相關(guān)領(lǐng)域尤其是核酸診斷方面，得到了廣泛深入的研究及應(yīng)用。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了諸如巢式多重pcr、熒光定量多重pcr、差異顯示多重pcr等系列相關(guān)技術(shù)。由于多重pcr實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較單一pcr要復(fù)雜得多，技術(shù)難度大，因而在建立多重pcr反應(yīng)體系時(shí)，必須對(duì)其中的主要成分和反應(yīng)條件進(jìn)行繁瑣的優(yōu)化。影響多重pcr擴(kuò)增效果的因素主要可分反應(yīng)體系和反應(yīng)條件二大類，其中反應(yīng)體系包括引物、緩沖液、模板和taqdna聚合酶、dntp和mg2+等，反應(yīng)條件包括退火溫度、循環(huán)數(shù)、輔助劑等。多重pcr反應(yīng)的優(yōu)化要比常規(guī)pcr復(fù)雜，通常情況是先進(jìn)行單一的pcr反應(yīng)，分別設(shè)定各引物對(duì)的最佳反應(yīng)條件，然后選擇公共的反應(yīng)條件進(jìn)行2重、3重……設(shè)定，在此過程中不斷調(diào)整反應(yīng)條件，直至所有的引物都能同時(shí)在這一條件下正確擴(kuò)增。本方法根據(jù)延伸產(chǎn)物在真空小管中飛行時(shí)間的長短來分析染色體特異性的snp位點(diǎn)的基因型。本方法選用的snp位點(diǎn)是存在于人體細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)snp位點(diǎn)進(jìn)行檢測，檢測延伸產(chǎn)物在真空小管中的飛行時(shí)間，為特異性snp位點(diǎn)基因型的分析提供依據(jù)。本發(fā)明中所選擇的20個(gè)或22個(gè)snp位點(diǎn)突變，是選用大量文獻(xiàn)的研究以及實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模的研究發(fā)現(xiàn)的在中國患者體細(xì)胞中常出現(xiàn)的耳聾基因，并且相比文獻(xiàn)報(bào)道的其他snp位點(diǎn)的組合具有較高的檢出率。在本發(fā)明中，遺傳性耳聾基因檢測產(chǎn)品的樣本包括(但不限于)胎兒羊水、人外周血樣本、臍血、口腔拭子等。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明提供了一種檢測遺傳性耳聾基因的試劑盒，包括高效特異性的擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物，這些擴(kuò)增引物和延伸引物經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，檢測準(zhǔn)確性和靈敏度高；在位置比較接近的snp位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，提高了擴(kuò)增效率，降低了成本；在高gc含量的區(qū)域通過改變gc堿基從而降低gc含量，避免引物的非特異性結(jié)合。本發(fā)明的試劑盒可以一次性檢測遺傳性耳聾基因上的多個(gè)snp位點(diǎn)，多個(gè)snp位點(diǎn)的檢測在同一管中完成，檢測時(shí)間短，操作簡單，成本低，便于耳聾基因篩查的推廣。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1檢測方法的驗(yàn)證1、多態(tài)位點(diǎn)的確定本發(fā)明選擇的多態(tài)性位點(diǎn)均具有很高的多態(tài)性信息含量，包含中國人群中耳聾基因熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，整體上使單倍型多樣性大大提升。通過大規(guī)模的測序篩查，以及現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的耳聾致病基因在中國人群中的多態(tài)性調(diào)查和文獻(xiàn)研究，入選本發(fā)明的20個(gè)位點(diǎn)見表1，22個(gè)位點(diǎn)如表2。表1本發(fā)明涉及的所有20個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)序號(hào)位點(diǎn)信息1slc26a4c.1226g>a2slc26a4c.1174a>t3slc26a4c.1229c>t4slc26a4c.1975g>c5slc26a4c.2027t>a6gjb2c.235delc7gjb2c.299_300delat8gjb2c.176_191del169gjb2c.167delt10gjb2c.109g>a11gjb2c.35delg12mtdnam.1555a>g13gjb3c.538c>t14gjb3c.547g>a15slc26a4c.2162c>t16slc26a4c.2168a>g17slc26a4c.919-2a>g18gjb2c.508_511insaacg19slc26a4c.1707+5g>a20slc26a4c.589g>a表2本發(fā)明涉及的所有22個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)2、樣本的采集在被檢測者知情同意的情況下，使用血斑采集卡收集樣本3例，晾干備用。3、樣本的檢測(1)針對(duì)選定的耳聾基因的snp位點(diǎn)，通過引物的設(shè)計(jì)原則與實(shí)際情況結(jié)合，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)區(qū)域特異性的擴(kuò)增引物和位點(diǎn)特異性的單堿基延伸引物，并在擴(kuò)增引物5’端增加通用tag序列。本發(fā)明設(shè)計(jì)了大量檢測遺傳性耳聾基因突變的相關(guān)位點(diǎn)的引物，然后通過大量的實(shí)驗(yàn)篩選出特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物，最終篩選出相關(guān)dna突變效果最佳的引物，如表3和表4所示；相關(guān)引物在上海生工進(jìn)行合成。表3pcr擴(kuò)增引物表4延伸引物表序號(hào)位點(diǎn)信息延伸引物seqidno.27slc26a4c.1226g>acaccactgctctttcccseqidno.28slc26a4c.1174a>tttgcctttgggatcagcseqidno.29slc26a4c.1229c>tctcctggacggccseqidno.30slc26a4c.1975g>cgtgccaatccatagccttseqidno.31slc26a4c.2027t>aagaaccttaccacccgcseqidno.32gjb2c.235delccgaagatcagctgcaggseqidno.33gjb2c.299_300delattgatgaacttcctcttcttctcseqidno.34gjb2c.176_191del16gggaagtagtgatcgtagcseqidno.35gjb2c.167deltcgactttgtctgcaacacccseqidno.36gjb2c.109g>aacaactcctttgcagccacaaseqidno.37gjb2c.35delgtgcagacgatcctgagggseqidno.38mtdnam.1555a>gaacccctacgcatttatatagaggagseqidno.39gjb3c.538c>tcgtggactgctacattgccseqidno.40gjb3c.547g>aggtaggtgaagattttcttctseqidno.41slc26a4c.2162c>taaggacacattctttttgaseqidno.42slc26a4c.2168a>gctgtagatagagtatagcatcaseqidno.43slc26a4c.919-2a>gggcagtagcaattatcgtcseqidno.44gjb2.508_511insaacgagtgttgggacaaggccaggcgttseqidno.45slc26a4c.1707+5g>aaatgtatcaagtccacagtaaseqidno.46slc26a4c.589g>agtaagttcattacctgtataattcseqidno.47slc26a4c.281c>tgaagtcatttcgggagttagtaseqidno.48mtdnam.1494c>tctactttgaagtatacttgaggag(2)實(shí)驗(yàn)步驟a.樣品dna的提取1)向樣品中分別加入200μl緩沖液ga和20μl蛋白酶k，渦旋震蕩10s混勻后，放入預(yù)熱至56℃的恒溫震蕩器中，900rpm恒溫震蕩1h。2)短暫離心后，加入200μl緩沖液gb，震蕩10s充分混勻。將離心管放入預(yù)熱至70℃的恒溫震蕩器中，900rpm恒溫震蕩10min。3)短暫離心后，加入100μl無水乙醇，充分顛倒混勻。4)將盡可能多的裂解液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)放置的離心柱中(已標(biāo)記樣本編號(hào))。轉(zhuǎn)移后的原離心管蓋好蓋子暫放回原位，不可立即丟棄。全部樣本轉(zhuǎn)移完畢，核對(duì)對(duì)應(yīng)位置的離心柱和原離心管編號(hào)是否一致，確保分柱準(zhǔn)確無誤。5)短暫離心后，將離心管中的所得溶液和絮狀沉淀全部加入吸附柱中，12,000rpm離心30s。棄廢液，將吸附柱放回收集管中。6)向吸附柱中加入500μl緩沖液gd，12,000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。7)加入700μl漂洗液pw，12,000rpm離心30s，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。8)加入500μl漂洗液pw，12,000rpm離心30s，棄廢液，最后12,000rpm離心2min。9)將吸附柱置于新的1.5ml離心管(標(biāo)記樣品編號(hào))中，室溫放置5min，向膜中央加入50μltb緩沖液。室溫放置5min，之后12,000rpm離心2min，收集dna溶液，-20℃保存dna備用。b.多重pcr反應(yīng)1)pcr反應(yīng)體系配制pcr反應(yīng)體系按照表5進(jìn)行配制，然后每孔加入3μl，將pcr反應(yīng)mix分加到384孔板的樣本孔中。表5多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系2)將配制好的pcr反應(yīng)體系上pcr儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件如表6所示。表6多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件c.pcr產(chǎn)物處理通過sap酶處理pcr產(chǎn)物，sap酶處理體系按照表7進(jìn)行配制，然后按照每孔2μl，將反應(yīng)體系加到pcr產(chǎn)物中(注意：pcr產(chǎn)物使用前請輕微震蕩離心)，然后瞬時(shí)離心并按照表7中的反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。表7sap反應(yīng)體系及反應(yīng)條件d.延伸反應(yīng)延伸反應(yīng)體系按照表8進(jìn)行配制，然后按照每孔2μl，將延伸反應(yīng)體系加到經(jīng)sap處理的產(chǎn)物中(注意：處理產(chǎn)物使用前請輕微震蕩離心)，然后瞬時(shí)離心并按照表9中的反應(yīng)程序進(jìn)行反應(yīng)。表8延伸反應(yīng)體系表9延伸反應(yīng)條件e.延伸產(chǎn)物純化1)每反應(yīng)孔添加潔凈樹脂(resin)6mg和16μlddh2o。2)用膜把板封好，放在旋轉(zhuǎn)器上顛倒搖勻15min，以3200g(標(biāo)準(zhǔn)板離心機(jī)的2000rpm)將板離心5min。f.上機(jī)檢測1)使用基納公司massarraytmrs1000點(diǎn)樣儀轉(zhuǎn)移至檢測芯片。2)使用基納公司massarraytm分析儀進(jìn)行檢測。4、結(jié)果根據(jù)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行分析，各樣本的檢測結(jié)果如表10所示。表10三個(gè)樣本的檢測結(jié)果5.使用基因檢測金標(biāo)準(zhǔn)一代測序法對(duì)樣本1進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和使用上述方法檢測的結(jié)果一致。實(shí)施例2對(duì)選定的snp位點(diǎn)進(jìn)行大樣本驗(yàn)證1、樣本的采集按照實(shí)施例1中的方式采集遺傳性耳聾患者的樣本50例，樣本的采集及應(yīng)用均獲得患者的知情同意。2、樣本的檢測采用實(shí)施例1中的步驟3采用的方法，對(duì)表1中所列的20個(gè)位點(diǎn)以及文獻(xiàn)中報(bào)道的20個(gè)snp位點(diǎn)235delc、176_191del、299_300delat、35delg、167delt、547g>a、538c>t、1229c>t、1174a>t、1226g>a、ivs15+5g>a、2027t>a、1975g>c、589g>a、2162c>t、281c>t、ivs7-2a>g、2168a>g、1555a>g和1494c>t進(jìn)行位點(diǎn)檢測。3、結(jié)果對(duì)20個(gè)不同snp位點(diǎn)的檢測結(jié)果顯示，檢測出表1中所列的snp位點(diǎn)的的耳聾患者為39人，綜合檢出率為78％；檢出對(duì)比文獻(xiàn)中報(bào)道的20個(gè)snp位點(diǎn)的耳聾患者為35人，檢出率為70％。實(shí)施例3一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒根據(jù)snp位點(diǎn)與遺傳性耳聾的相關(guān)性，本發(fā)明提供了一種基于檢測snp位點(diǎn)的基因型來診斷耳聾的試劑盒，試劑盒組分包括多重pcr反應(yīng)體系、sap酶處理體系、單堿基延伸反應(yīng)體系、dna提取試劑、陰性質(zhì)控品，陽性質(zhì)控品，純化樹脂，質(zhì)譜檢測芯片、使用說明書或標(biāo)簽。多重pcr體系包括pcr擴(kuò)增引物、pcr緩沖液、25mmdntps、25mmmgcl2、5u/μlpcr酶，pcr擴(kuò)增引物序列如seqidno.1～22所示；sap酶處理體系包括sap緩沖液、sap酶；單堿基延伸反應(yīng)體系包括單堿基延伸引物、iplex緩沖液、iplex終止混合物、iplex酶，單堿基延伸引物序列如seqidno.27～46所示；dna提取試劑包括提取緩沖液、蛋白酶、漂洗液。實(shí)施例4一種遺傳性耳聾基因檢測試劑盒根據(jù)snp位點(diǎn)與遺傳性耳聾的相關(guān)性，本發(fā)明提供了一種基于檢測snp位點(diǎn)的基因型來診斷耳聾的試劑盒，試劑盒組分包括多重pcr反應(yīng)體系、sap酶處理體系、單堿基延伸反應(yīng)體系。多重pcr體系包括pcr擴(kuò)增引物、pcr緩沖液、25mmdntps、25mmmgcl2、5u/μlpcr酶，pcr擴(kuò)增引物序列如seqidno.1～26所示；sap酶處理體系包括sap緩沖液、sap酶；單堿基延伸反應(yīng)體系包括單堿基延伸引物、iplex緩沖液、iplex終止混合物、iplex酶，單堿基延伸引物序列如seqidno.27～48所示。上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司<120>一種遺傳性耳聾基因檢測產(chǎn)品<160>48<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列<400>1acgttggatgctgttgttcctacctgtgtc30<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<400>2acgttggatggtaggatcgttgtcatccag30<210>3<211>30<212>dna<213>人工序列<400>3acgttggatgcagaaaaccagaaccttacc30<210>4<211>30<212>dna<213>人工序列<400>4acgttggatgacgttcccaaagtgccaatc30<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<400>5acgttggatgtgatctcctcgatgtcctta30<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列<400>6acgttggatgaggccgactttgtctgcaac30<210>7<211>30<212>dna<213>人工序列<400>7acgttggatgtcttttccagagcaaaccgc30<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<400>8acgttggatgacaaagtcggcctgctcatc30<210>9<211>30<212>dna<213>人工序列<400>9acgttggatgcactttccagtacacttacc30<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<400>10acgttggatgaccctcctcaagtatacttc30<210>11<211>30<212>dna<213>人工序列<400>11acgttggatgatggtgagtacgatgcagac30<210>12<211>30<212>dna<213>人工序列<400>12acgttggatgctggtgcagtgtgccaacgt30<210>13<211>30<212>dna<213>人工序列<400>13acgttggatgccctcttgagatttcacttg30<210>14<211>30<212>dna<213>人工序列<400>14acgttggatgaatgcgggttctttgacgac30<210>15<211>29<212>dna<213>人工序列<400>15acgttggatgatttggttgacaaacaagg29<210>16<211>30<212>dna<213>人工序列<400>16acgttggatgggctccatatgaaatggcag30<210>17<211>30<212>dna<213>人工序列<400>17acgttggatgatgtcatgtacgacggcttc30<210>18<211>30<212>dna<213>人工序列<400>18acgttggatgaagcagtccacagtgttggg30<210>19<211>30<212>dna<213>人工序列<400>19acgttggatggaagtctcaaaagaggttag30<210>20<211>30<212>dna<213>人工序列<400>20acgttggatgttctatggcaatgtcgatgg30<210>21<211>30<212>dna<213>人工序列<400>21acgttggatgacagctagagtcctgattgc30<210>22<211>29<212>dna<213>人工序列<400>22acgttggatgcttgtaagttcattacctg29<210>23<211>30<212>dna<213>人工序列<400>23acgttggatgcaacatcttaccttgcagcg30<210>24<211>30<212>dna<213>人工序列<400>24acgttggatgataccgagtcaaggaatggc30<210>25<211>30<212>dna<213>人工序列<400>25acgttggatgagttgaacagggccctgaag30<210>26<211>31<212>dna<213>人工序列<400>26acgttggatgcctctatataaatgcgtaggg31<210>27<211>17<212>dna<213>人工序列<400>27caccactgctctttccc17<210>28<211>17<212>dna<213>人工序列<400>28ttgcctttgggatcagc17<210>29<211>13<212>dna<213>人工序列<400>29ctcctggacggcc13<210>30<211>18<212>dna<213>人工序列<400>30gtgccaatccatagcctt18<210>31<211>17<212>dna<213>人工序列<400>31agaaccttaccacccgc17<210>32<211>17<212>dna<213>人工序列<400>32cgaagatcagctgcagg17<210>33<211>22<212>dna<213>人工序列<400>33tgatgaacttcctcttcttctc22<210>34<211>19<212>dna<213>人工序列<400>34gggaagtagtgatcgtagc19<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列<400>35cgactttgtctgcaacaccc20<210>36<211>21<212>dna<213>人工序列<400>36acaactcctttgcagccacaa21<210>37<211>18<212>dna<213>人工序列<400>37tgcagacgatcctgaggg18<210>38<211>26<212>dna<213>人工序列<400>38aacccctacgcatttatatagaggag26<210>39<211>19<212>dna<213>人工序列<400>39cgtggactgctacattgcc19<210>40<211>21<212>dna<213>人工序列<400>40ggtaggtgaagattttcttct21<210>41<211>19<212>dna<213>人工序列<400>41aaggacacattctttttga19<210>42<211>22<212>dna<213>人工序列<400>42ctgtagatagagtatagcatca22<210>43<211>19<212>dna<213>人工序列<400>43ggcagtagcaattatcgtc19<210>44<211>24<212>dna<213>人工序列<400>44agtgttgggacaaggccaggcgtt24<210>45<211>21<212>dna<213>人工序列<400>45aatgtatcaagtccacagtaa21<210>46<211>24<212>dna<213>人工序列<400>46gtaagttcattacctgtataattc24<210>47<211>22<212>dna<213>人工序列<400>47gaagtcatttcgggagttagta22<210>48<211>24<212>dna<213>人工序列<400>48ctactttgaagtatacttgaggag24當(dāng)前第1頁12