本發(fā)明屬于核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于同時(shí)檢測(cè)6種豬病毒的系統(tǒng)及其專用lamp引物。

背景技術(shù)：

豬口蹄疫病毒(foot-and-mouthdiseasevirus,fmdv)、豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，prrsv)、豬圓環(huán)病毒ⅱ型(porcinecircovirusⅱ,pcv-2)、豬細(xì)小病毒(porcineparvovirus，ppv)、豬偽狂犬病病毒(porcinepseudorabiesvirus,prv)，這幾種病毒引起的疾病在臨床上常呈現(xiàn)出相似的呼吸和繁殖障礙癥狀，并且常常呈混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。然而，常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)及臨床病理變化很難作出準(zhǔn)確的判斷，尤其是多種病原混合感染時(shí)，難以進(jìn)行早期快速檢測(cè)，容易產(chǎn)生誤判錯(cuò)判。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)利用bstdna聚合酶，在等溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效快速的優(yōu)勢(shì)，可實(shí)現(xiàn)樣本的快速準(zhǔn)確檢測(cè)。lamp技術(shù)的核心之一在于引物的設(shè)計(jì)，針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，同時(shí)可設(shè)計(jì)2條環(huán)引物用于提高反應(yīng)效率。適合的lamp引物可保證擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度和特異性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何同時(shí)檢測(cè)6種常見豬病毒。

本發(fā)明提供了6種豬病毒檢測(cè)的檢測(cè)系統(tǒng)及其專用lamp引物。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)6種豬病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的成套引物，為下述六個(gè)引物組中的六組、任五組、任四組、任三組、任兩組或任一組：用于檢測(cè)豬口蹄疫病毒o/a/asiai型的引物組、用于檢測(cè)豬瘟病毒的引物組、用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型的引物組、用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒ⅱ型的引物組、用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒的引物組、用于檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的引物組。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述用于檢測(cè)豬口蹄疫病毒o/a/asiai型的引物組為豬口蹄疫病毒o/a/asiai型正義6引物組、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型反義6引物組、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型正義4引物組或豬口蹄疫病毒o/a/asiai型反義4引物組。所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型正義6引物組由豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-z、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-z、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-z、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-z、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lf-z和豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lb-z這6條引物組成。所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型反義6引物組由豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-f、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-f、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-f、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-f、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lf-f和豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lb-f這6條引物組成。所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型正義4引物組由所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-z、所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-z、所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-z和所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-z這4條引物組成。所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型反義4引物組由所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-f、所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-f、所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-f和所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-f這4條引物組成。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-f是所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-z的反義dna；所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-f是所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-z的反義dna；所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-f是所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-z的反義dna；所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-f是所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-z的反義dna；所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lf-f是所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lf-z的反義dna；所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lb-f是所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lb-z的反義dna。

所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物f3-z為如下a1)至a4)中的任意一種單鏈dna分子：

a1)序列表的序列1第1-18位核苷酸所示；

a2)序列表的序列7所示；

a3)與a1)或a2)具有85％以上的同一性；

a4)在嚴(yán)格條件下與a1)或a2)雜交；

所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物b3-z為如下a5)至a8)中的任意一種單鏈dna分子：

a5)與序列表的序列1第180-198位核苷酸反向互補(bǔ)；

a6)序列表的序列8所示；

a7)與a5)或a6)具有85％以上的同一性；

a8)在嚴(yán)格條件下與a5)或a6)雜交；

所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物fip-z為如下a9)至a12)中的任意一種單鏈dna分子：

a9)a1-l1-b1；a1與序列表的序列1第87-104位核苷酸反向互補(bǔ)，b1如序列表的序列1第28-46位核苷酸所示，l1為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

a10)序列表的序列9所示；

a11)與a9)或a10)具有85％以上的同一性；

a12)在嚴(yán)格條件下與a9)或a10)雜交；

所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物bip-z為如下a13)至a16)中的任意一種單鏈dna分子：

a13)a2-l2-b2；a2如序列表的序列1第107-125位核苷酸所示，b2與序列表的序列1第149-166位核苷酸反向互補(bǔ)，l2為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

a14)序列表的序列10所示；

a15)與a13)或a14)具有85％以上的同一性；

a16)在嚴(yán)格條件下與a13)或a14)雜交；

所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lf-z為如下a17)至a20)中的任意一種單鏈dna分子：

a17)與序列表的序列1第47-64位核苷酸反向互補(bǔ)；

a18)序列表的序列11所示；

a19)與a17)或a18)具有85％以上的同一性；

a20)在嚴(yán)格條件下與a17)或a18)雜交；

所述豬口蹄疫病毒o/a/asiai型引物lb-z為如下a21)至a24)中的任意一種單鏈dna分子：

a21)序列表的序列1第127-148位核苷酸所示；

a22)序列表的序列12所示；

a23)與a21)或a22)具有85％以上的同一性；

a24)在嚴(yán)格條件下與a21)或a22)雜交。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述用于檢測(cè)豬瘟病毒的引物組為豬瘟病毒正義6引物組、豬瘟病毒反義6引物組、豬瘟病毒正義4引物組或豬瘟病毒反義4引物組。所述豬瘟病毒正義6引物組由豬瘟病毒引物f3-z、豬瘟病毒引物b3-z、豬瘟病毒引物fip-z、豬瘟病毒引物bip-z、豬瘟病毒引物lf-z和豬瘟病毒引物lb-z這6條引物組成。所述豬瘟病毒反義6引物組由豬瘟病毒引物f3-f、豬瘟病毒引物b3-f、豬瘟病毒引物fip-f、豬瘟病毒引物bip-f、豬瘟病毒引物lf-f和豬瘟病毒引物lb-f這6條引物組成。所述豬瘟病毒正義4引物組由所述豬瘟病毒引物f3-z、所述豬瘟病毒引物b3-z、所述豬瘟病毒引物fip-z和所述豬瘟病毒引物bip-z這4條引物組成。所述豬瘟病毒反義4引物組由所述豬瘟病毒引物f3-f、所述豬瘟病毒引物b3-f、所述豬瘟病毒引物fip-f和所述豬瘟病毒引物bip-f這4條引物組成。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述豬瘟病毒引物f3-f是所述豬瘟病毒引物f3-z的反義dna；所述豬瘟病毒引物b3-f是所述豬瘟病毒引物b3-z的反義dna；所述豬瘟病毒引物fip-f是所述豬瘟病毒引物fip-z的反義dna；所述豬瘟病毒引物bip-f是所述豬瘟病毒引物bip-z的反義dna；所述豬瘟病毒引物lf-f是所述豬瘟病毒引物lf-z的反義dna；所述豬瘟病毒引物lb-f是所述豬瘟病毒引物lb-z的反義dna。

所述豬瘟病毒引物f3-z為如下b1)至b4)中的任意一種單鏈dna分子：

b1)序列表的序列2第2-19位核苷酸所示；

b2)序列表的序列13所示；

b3)與b1)或b2)具有85％以上的同一性；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)雜交；

所述豬瘟病毒引物b3-z為如下b5)至b8)中的任意一種單鏈dna分子：

b5)與序列表的序列2第232-249位核苷酸反向互補(bǔ)；

b6)序列表的序列14所示；

b7)與b5)或b6)具有85％以上的同一性；

b8)在嚴(yán)格條件下與b5)或b6)雜交；

所述豬瘟病毒引物fip-z為如下b9)至b12)中的任意一種單鏈dna分子：

b9)a3-l3-b3；a3與序列表的序列2第61-81位核苷酸反向互補(bǔ)，b3如序列表的序列2第21-38位核苷酸所示，l3為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

b10)序列表的序列15所示；

b11)與b9)或b10)具有85％以上的同一性；

b12)在嚴(yán)格條件下與b9)或b10)雜交；

所述豬瘟病毒引物bip-z為如下b13)至b16)中的任意一種單鏈dna分子：

b13)a4-l4-b4；a4如序列表的序列2第84-102位核苷酸所示，b4與序列表的序列2第148-166位核苷酸反向互補(bǔ)，l4為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

b14)序列表的序列16所示；

b15)與b13)或b14)具有85％以上的同一性；

b16)在嚴(yán)格條件下與b13)或b14)雜交；

所述豬瘟病毒引物lf-z為如下b17)至b20)中的任意一種單鏈dna分子：

b17)與序列表的序列2第39-60位核苷酸反向互補(bǔ)；

b18)序列表的序列17所示；

b19)與b17)或b18)具有85％以上的同一性；

b20)在嚴(yán)格條件下與b17)或b18)雜交；

所述豬瘟病毒引物lb-z為如下b21)至b24)中的任意一種單鏈dna分子：

b21)序列表的序列2第119-139位核苷酸所示；

b22)序列表的序列18所示；

b23)與b21)或b22)具有85％以上的同一性；

b24)在嚴(yán)格條件下與b21)或b22)雜交。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型的引物組為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型正義6引物組、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型反義6引物組、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型正義4引物組或豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型反義4引物組。所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型正義6引物組由豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物f3-z、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物b3-z、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物fip-z、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物bip-z、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lf-z和豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lb-z這6條引物組成。所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型反義6引物組由豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物f3-f、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物b3-f、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物fip-f、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物bip-f、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lf-f和豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lb-f這6條引物組成。所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型正義4引物組由所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物f3-z、所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物b3-z、所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物fip-z和所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物bip-z這4條引物組成。所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型反義4引物組由所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物f3-f、所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物b3-f、所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物fip-f和所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物bip-f這4條引物組成。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物f3-f是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物f3-z的反義dna；所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物b3-f是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物b3-z的反義dna；所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物fip-f是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物fip-z的反義dna；所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物bip-f是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物bip-z的反義dna；所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lf-f是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lf-z的反義dna；所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lb-f是所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型引物lb-z的反義dna。

所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒引物f3-z為如下c1)至c4)中的任意一種單鏈dna分子：

c1)序列表的序列3第1-20位核苷酸所示；

c2)序列表的序列19所示；

c3)與c1)或c2)具有85％以上的同一性；

c4)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)雜交；

所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒引物b3-z為如下c5)至c8)中的任意一種單鏈dna分子：

c5)與序列表的序列3第250-267位核苷酸反向互補(bǔ)；

c6)序列表的序列20所示；

c7)與c5)或c6)具有85％以上的同一性；

c8)在嚴(yán)格條件下與c5)或c6)雜交；

所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒引物fip-z為如下c9)至c12)中的任意一種單鏈dna分子：

c9)a5-l5-b5；a5與序列表的序列3第124-143位核苷酸反向互補(bǔ)，b5如序列表的序列3第78-95位核苷酸所示，l5為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

c10)序列表的序列21所示；

c11)與c9)或c10)具有85％以上的同一性；

c12)在嚴(yán)格條件下與c9)或c10)雜交；

所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒引物bip-z為如下c13)至c16)中的任意一種單鏈dna分子：

c13)a6-l6-b6；a6如序列表的序列3第180-201位核苷酸所示，b6與序列表的序列3第232-249位核苷酸反向互補(bǔ)，l6為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

c14)序列表的序列22所示；

c15)與c13)或c14)具有85％以上的同一性；

c16)在嚴(yán)格條件下與c13)或c14)雜交；

所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒引物lf-z為如下c17)至c20)中的任意一種單鏈dna分子：

c17)與序列表的序列3第99-117位核苷酸反向互補(bǔ)；

c18)序列表的序列23所示；

c19)與c17)或c18)具有85％以上的同一性；

c20)在嚴(yán)格條件下與c17)或c18)雜交；

所述豬繁殖與呼吸綜合征病毒引物lb-z為如下c21)至c24)中的任意一種單鏈dna分子：

c21)序列表的序列3第206-225位核苷酸所示；

c22)序列表的序列24所示；

c23)與c21)或c22)具有85％以上的同一性；

c24)在嚴(yán)格條件下與c21)或c22)雜交。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒ⅱ型的引物組為豬圓環(huán)病毒ⅱ型正義6引物組、豬圓環(huán)病毒ⅱ型反義6引物組、豬圓環(huán)病毒ⅱ型正義4引物組或豬圓環(huán)病毒ⅱ型反義4引物組。所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型正義6引物組由豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-z、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-z、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-z、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-z、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lf-z和豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lb-z這6條引物組成。所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型反義6引物組由豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-f、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-f、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-f、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-f、豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lf-f和豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lb-f這6條引物組成。所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型正義4引物組由所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-z、所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-z、所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-z和所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-z這4條引物組成。所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型反義4引物組由所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-f、所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-f、所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-f和所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-f這4條引物組成。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-f是所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-z的反義dna；所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-f是所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-z的反義dna；所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-f是所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-z的反義dna；所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-f是所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-z的反義dna；所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lf-f是所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lf-z的反義dna；所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lb-f是所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lb-z的反義dna。

所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物f3-z為如下d1)至d4)中的任意一種單鏈dna分子：

d1)序列表的序列4第2-21位核苷酸所示；

d2)序列表的序列25所示；

d3)與d1)或d2)具有85％以上的同一性；

d4)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)雜交；

所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物b3-z為如下d5)至d8)中的任意一種單鏈dna分子：

d5)與序列表的序列4第178-196位核苷酸反向互補(bǔ)；

d6)序列表的序列26所示；

d7)與d5)或d6)具有85％以上的同一性；

d8)在嚴(yán)格條件下與d5)或d6)雜交；

所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物fip-z為如下d9)至d12)中的任意一種單鏈dna分子：

d9)a7-l7-b7；a7與序列表的序列4第63-84位核苷酸反向互補(bǔ)，b7如序列表的序列4第23-42位核苷酸所示，l7為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

d10)序列表的序列27所示；

d11)與d9)或d10)具有85％以上的同一性；

d12)在嚴(yán)格條件下與d9)或d10)雜交；

所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物bip-z為如下d13)至d16)中的任意一種單鏈dna分子：

d13)a8-l8-b8；a8如序列表的序列4第101-122位核苷酸所示，b8與序列表的序列4第157-176位核苷酸反向互補(bǔ)，l8為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

d14)序列表的序列28所示；

d15)與d13)或d14)具有85％以上的同一性；

d16)在嚴(yán)格條件下與d13)或d14)雜交；

所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lf-z為如下d17)至d20)中的任意一種單鏈dna分子：

d17)與序列表的序列4第43-62位核苷酸反向互補(bǔ)；

d18)序列表的序列29所示；

d19)與d17)或d18)具有85％以上的同一性；

d20)在嚴(yán)格條件下與d17)或d18)雜交；

所述豬圓環(huán)病毒ⅱ型引物lb-z為如下d21)至d24)中的任意一種單鏈dna分子：

d21)序列表的序列4第123-144位核苷酸所示；

d22)序列表的序列30所示；

d23)與d21)或d22)具有85％以上的同一性；

d24)在嚴(yán)格條件下與d21)或d22)雜交。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒的引物組為豬細(xì)小病毒正義6引物組、豬細(xì)小病毒反義6引物組、豬細(xì)小病毒正義4引物組或豬細(xì)小病毒反義4引物組。所述豬細(xì)小病毒正義6引物組由豬細(xì)小病毒引物f3-z、豬細(xì)小病毒引物b3-z、豬細(xì)小病毒引物fip-z、豬細(xì)小病毒引物bip-z、豬細(xì)小病毒引物lf-z和豬細(xì)小病毒引物lb-z這6條引物組成。所述豬細(xì)小病毒反義6引物組由豬細(xì)小病毒引物f3-f、豬細(xì)小病毒引物b3-f、豬細(xì)小病毒引物fip-f、豬細(xì)小病毒引物bip-f、豬細(xì)小病毒引物lf-f和豬細(xì)小病毒引物lb-f這6條引物組成。所述豬細(xì)小病毒正義4引物組由所述豬細(xì)小病毒引物f3-z、所述豬細(xì)小病毒引物b3-z、所述豬細(xì)小病毒引物fip-z和所述豬細(xì)小病毒引物bip-z這4條引物組成。所述豬細(xì)小病毒反義4引物組由所述豬細(xì)小病毒引物f3-f、所述豬細(xì)小病毒引物b3-f、所述豬細(xì)小病毒引物fip-f和所述豬細(xì)小病毒引物bip-f這4條引物組成。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述豬細(xì)小病毒引物f3-f是所述豬細(xì)小病毒引物f3-z的反義dna；所述豬細(xì)小病毒引物b3-f是所述豬細(xì)小病毒引物b3-z的反義dna；所述豬細(xì)小病毒引物fip-f是所述豬細(xì)小病毒引物fip-z的反義dna；所述豬細(xì)小病毒引物bip-f是所述豬細(xì)小病毒引物bip-z的反義dna；所述豬細(xì)小病毒引物lf-f是所述豬細(xì)小病毒引物lf-z的反義dna；所述豬細(xì)小病毒引物lb-f是所述豬細(xì)小病毒引物lb-z的反義dna。

所述豬細(xì)小病毒引物f3-z為如下e1)至e4)中的任意一種單鏈dna分子：

e1)序列表的序列5第1-21位核苷酸所示；

e2)序列表的序列31所示；

e3)與e1)或e2)具有85％以上的同一性；

e4)在嚴(yán)格條件下與e1)或e2)雜交；

所述豬細(xì)小病毒引物b3-z為如下e5)至e8)中的任意一種單鏈dna分子：

e5)與序列表的序列5第187-206位核苷酸反向互補(bǔ)；

e6)序列表的序列32所示；

e7)與e5)或e6)具有85％以上的同一性；

e8)在嚴(yán)格條件下與e5)或e6)雜交；

所述豬細(xì)小病毒引物fip-z為如下e9)至e12)中的任意一種單鏈dna分子：

e9)a9-l9-b9；a9與序列表的序列5第68-87位核苷酸反向互補(bǔ)，b9如序列表的序列5第22-41位核苷酸所示，l9為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

e10)序列表的序列33所示；

e11)與e9)或e10)具有85％以上的同一性；

e12)在嚴(yán)格條件下與e9)或e10)雜交；

所述豬細(xì)小病毒引物bip-z為如下e13)至e16)中的任意一種單鏈dna分子：

e13)a10-l10-b10；a10如序列表的序列5第123-143位核苷酸所示，b10與序列表的序列5第168-189位核苷酸反向互補(bǔ)，l10為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

e14)序列表的序列34所示；

e15)與e13)或e14)具有85％以上的同一性；

e16)在嚴(yán)格條件下與e13)或e14)雜交；

所述豬細(xì)小病毒引物lf-z為如下e17)至e20)中的任意一種單鏈dna分子：

e17)與序列表的序列5第42-65位核苷酸反向互補(bǔ)；

e18)序列表的序列35所示；

e19)與e17)或e18)具有85％以上的同一性；

e20)在嚴(yán)格條件下與e17)或e18)雜交；

所述豬細(xì)小病毒引物lb-z為如下e21)至e24)中的任意一種單鏈dna分子：

e21)序列表的序列5第147-162位核苷酸所示；

e22)序列表的序列36所示；

e23)與e21)或e22)具有85％以上的同一性；

e24)在嚴(yán)格條件下與e21)或e22)雜交。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述用于檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的引物組為豬偽狂犬病病毒正義6引物組、豬偽狂犬病病毒反義6引物組、豬偽狂犬病病毒正義4引物組或豬偽狂犬病病毒反義4引物組。所述豬偽狂犬病病毒正義6引物組由豬偽狂犬病病毒引物f3-z、豬偽狂犬病病毒引物b3-z、豬偽狂犬病病毒引物fip-z、豬偽狂犬病病毒引物bip-z、豬偽狂犬病病毒引物lf-z和豬偽狂犬病病毒引物lb-z這6條引物組成。所述豬偽狂犬病病毒反義6引物組由豬偽狂犬病病毒引物f3-f、豬偽狂犬病病毒引物b3-f、豬偽狂犬病病毒引物fip-f、豬偽狂犬病病毒引物bip-f、豬偽狂犬病病毒引物lf-f和豬偽狂犬病病毒引物lb-f這6條引物組成。所述豬偽狂犬病病毒正義4引物組由所述豬偽狂犬病病毒引物f3-z、所述豬偽狂犬病病毒引物b3-z、所述豬偽狂犬病病毒引物fip-z和所述豬偽狂犬病病毒引物bip-z這4條引物組成。所述豬偽狂犬病病毒反義4引物組由所述豬偽狂犬病病毒引物f3-f、所述豬偽狂犬病病毒引物b3-f、所述豬偽狂犬病病毒引物fip-f和所述豬偽狂犬病病毒引物bip-f這4條引物組成。

本發(fā)明提供的成套引物中，所述豬偽狂犬病病毒引物f3-f是所述豬偽狂犬病病毒引物f3-z的反義dna；所述豬偽狂犬病病毒引物b3-f是所述豬偽狂犬病病毒引物b3-z的反義dna；所述豬偽狂犬病病毒引物fip-f是所述豬偽狂犬病病毒引物fip-z的反義dna；所述豬偽狂犬病病毒引物bip-f是所述豬偽狂犬病病毒引物bip-z的反義dna；所述豬偽狂犬病病毒引物lf-f是所述豬偽狂犬病病毒引物lf-z的反義dna；所述豬偽狂犬病病毒引物lb-f是所述豬偽狂犬病病毒引物lb-z的反義dna。

所述豬偽狂犬病病毒引物f3-z為如下f1)至f4)中的任意一種單鏈dna分子：

f1)序列表的序列6第1-16位核苷酸所示；

f2)序列表的序列37所示；

f3)與f1)或f2)具有85％以上的同一性；

f4)在嚴(yán)格條件下與f1)或f2)雜交；

所述豬偽狂犬病病毒引物b3-z為如下f5)至f8)中的任意一種單鏈dna分子：

f5)與序列表的序列6第159-177位核苷酸反向互補(bǔ)；

f6)序列表的序列38所示；

f7)與f5)或f6)具有85％以上的同一性；

f8)在嚴(yán)格條件下與f5)或f6)雜交；

所述豬偽狂犬病病毒引物fip-z為如下f9)至f12)中的任意一種單鏈dna分子：

f9)a11-l11-b11；a11與序列表的序列6第57-75位核苷酸反向互補(bǔ)，b11如序列表的序列6第17-33位核苷酸所示，l11為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

f10)序列表的序列39所示；

f11)與f9)或f10)具有85％以上的同一性；

f12)在嚴(yán)格條件下與f9)或f10)雜交；

所述豬偽狂犬病病毒引物bip-z為如下f13)至f16)中的任意一種單鏈dna分子：

f13)a12-l12-b12；a12如序列表的序列6第96-114位核苷酸所示，b12與序列表的序列6第141-156位核苷酸反向互補(bǔ)，l12為由0-10個(gè)核苷酸組成的間隔區(qū)段；

f14)序列表的序列40所示；

f15)與f13)或f14)具有85％以上的同一性；

f16)在嚴(yán)格條件下與f13)或f14)雜交；

所述豬偽狂犬病病毒引物lf-z為如下f17)至f20)中的任意一種單鏈dna分子：

f17)與序列表的序列6第37-52位核苷酸反向互補(bǔ)；

f18)序列表的序列41所示；

f19)與f17)或f18)具有85％以上的同一性；

f20)在嚴(yán)格條件下與f17)或f18)雜交；

所述豬偽狂犬病病毒引物lb-z為如下f21)至f24)中的任意一種單鏈dna分子：

f21)序列表的序列6第118-135位核苷酸所示；

f22)序列表的序列42所示；

f23)與f21)或f22)具有85％以上的同一性；

f24)在嚴(yán)格條件下與f21)或f22)雜交。

上文中，名稱中帶“z”的引物均作為正義dna，名稱中帶“f”的引物均作為反義dna；反義dna與對(duì)應(yīng)的正義dna反向互補(bǔ)。

本發(fā)明中的退火溫度可為引物和模板結(jié)合時(shí)的溫度。

上文中，所述六種引物組中的各個(gè)引物組均可獨(dú)立包裝，每個(gè)引物組中各引物也可獨(dú)立包裝。

所述成套引物中，各正義6引物組中各條引物的摩爾比如下：0.2～0.3μmol名稱中帶“f3-z”的引物：0.2～0.3μmol名稱中帶“b3-z”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“fip-z”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“bip-z”的引物：0.4～1.0μmol名稱中帶“l(fā)f-z”的引物：0.4～1.0μmol名稱中帶“l(fā)b-z”的引物；

所述成套引物中，各正義4引物組中各條引物的摩爾比如下：0.2～0.3μmol名稱中帶“f3-z”的引物：0.2～0.3μmol名稱中帶“b3-z”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“fip-z”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“bip-z”的引物；

所述成套引物中，各反義6引物組中各條引物的摩爾比如下：0.2～0.3μmol名稱中帶“f3-f”的引物：0.2～0.3μmol名稱中帶“b3-f”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“fip-f”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“bip-f”的引物：0.4～1.0μmol名稱中帶“l(fā)f-f”的引物：0.4～1.0μmol名稱中帶“l(fā)b-f”的引物；

所述成套引物中，各反義4引物組中各條引物的摩爾比如下：0.2～0.3μmol名稱中帶“f3-f”的引物：0.2～0.3μmol名稱中帶“b3-f”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“fip-f”的引物：0.8～2.4μmol名稱中帶“bip-f”的引物。

本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物的制備方法。

本發(fā)明所提供的檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括將檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物中各個(gè)引物組分別單獨(dú)包裝的步驟。

本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種檢測(cè)6種豬病毒的芯片，所述芯片固定有所述“檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物”中的六個(gè)引物組中的六組、任五組、任四組、任三組、任兩組或任一組。所述芯片可為恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片。

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)6種豬病毒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括所述“檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物”，所述系統(tǒng)還可包括所述芯片。

所述系統(tǒng)還可包括進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需的試劑和/或儀器和/或擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)據(jù)處理器，所述擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)據(jù)處理器可用于區(qū)分所述檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增得到的產(chǎn)物中是否含有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述試劑可包括2×反應(yīng)液(rm)、酶混合物(em)。進(jìn)一步，所述2×反應(yīng)液(rm)、酶混合物(em)可為loopmaprna擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒組成成分。所述試劑還可包括熒光顯色劑。進(jìn)一步，所述熒光顯色劑可為鈣黃綠素和氯化錳。所述儀器可為恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀，所述擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)據(jù)處理器內(nèi)設(shè)所述恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀配套軟件。

制備下述1)-3)中任一產(chǎn)品的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述方法包括制備所述“檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物”中的各條引物的步驟：

1)所述“檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物”中的六個(gè)引物組；

2)所述芯片；

3)所述系統(tǒng)。

所述“檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物”的下述任一種應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

1)在制備所述芯片中的應(yīng)用；

2)在制備所述系統(tǒng)中的應(yīng)用；

3)在制備檢測(cè)6種豬病毒的試劑或試劑盒的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護(hù)一種檢測(cè)待測(cè)樣本是否含有豬口蹄疫病毒o/a/asiai型和/或豬瘟病毒和/或豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型和/或豬圓環(huán)病毒ⅱ型和/或豬細(xì)小病毒和/或豬偽狂犬病病毒的方法，包括如下步驟：提取待測(cè)樣本的核酸，用所述“檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物”進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定待測(cè)樣本是否含有所述成套引物中相應(yīng)引物組對(duì)應(yīng)的豬病毒。

本發(fā)明中所述待測(cè)樣本具體可來自于豬血清和豬鼻咽拭子。

本發(fā)明對(duì)于豬病毒檢測(cè)以及豬病防控具有重大價(jià)值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例3中待測(cè)病毒為豬口蹄疫病毒o/a/asiai型時(shí)的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

圖2為實(shí)施例3中待測(cè)病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型時(shí)的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

圖3為實(shí)施例3中待測(cè)病毒為豬瘟病毒時(shí)的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

圖4為實(shí)施例3中待測(cè)病毒為豬圓環(huán)病毒ⅱ型時(shí)的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

圖5為實(shí)施例3中待測(cè)病毒為豬細(xì)小病毒時(shí)的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

圖6為實(shí)施例3中待測(cè)病毒為豬偽狂犬病病毒時(shí)的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

圖7為實(shí)施例4的結(jié)果(熒光歸一化曲線)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。2×反應(yīng)液(rm)及酶混合物(em)均為北京藍(lán)譜生物科技有限公司產(chǎn)品，鈣黃綠素和氯化錳為sigma公司產(chǎn)品。豬圓環(huán)病毒ⅱ型又稱豬圓環(huán)病毒2型。核酸為dna或rna，對(duì)于dna病毒來說核酸即為dna，對(duì)于rna病毒來說核酸即為rna。

實(shí)施例中所用毒株如表1所示。

表1

實(shí)施例1、成套引物

檢測(cè)6種豬病毒的lamp成套引物，由獨(dú)立包裝的6個(gè)引物組組成。6個(gè)引物組中的各條引物的序列見表2。

表2

y代表t或c。

實(shí)施例2、制備檢測(cè)裝置

取24反應(yīng)池的微流控芯片，采用瓊脂糖水溶液作為包埋劑，將引物包埋并干燥。

微流控芯片的24個(gè)反應(yīng)池包埋的引物如下：

(1)空白；

(2)陰性對(duì)照；

(3)陰性對(duì)照；

(4)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒ⅱ型的引物組；

(5)用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒ⅱ型的引物組；

(6)陰性對(duì)照；

(7)用于檢測(cè)豬口蹄疫病毒o/a/asiai型的引物組；

(8)用于檢測(cè)豬口蹄疫病毒o/a/asiai型的引物組；

(9)陰性對(duì)照；

(10)用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒的引物組；

(11)用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒的引物組；

(12)陰性對(duì)照；

(13)用于檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的引物組；

(14)用于檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的引物組；

(15)陰性對(duì)照；

(16)用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型的引物組；

(17)用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型的引物組；

(18)陰性對(duì)照；

(19)用于檢測(cè)豬瘟病毒的引物組；

(20)用于檢測(cè)豬瘟病毒的引物組；

(21)陰性對(duì)照；

(22)陰性對(duì)照；

(23)陽(yáng)性對(duì)照；

(24)空白。

各引物組的各條引物在反應(yīng)池中的包埋量如下：0.25μmolf3-z：0.25μmolb3-z：2.0μmolfip-z：2.0μmolbip-z：1.0μmollf-z：1.0μmollb-z。

實(shí)施例3、利用恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片檢測(cè)核酸樣品

待測(cè)病毒分別為：豬口蹄疫病毒o/a/asiai型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型、豬圓環(huán)病毒ⅱ型、豬細(xì)小病毒或豬偽狂犬病病毒，具體信息見表1。

1、提取待測(cè)病毒的核酸，得到核酸濃度為5×10³拷貝/μl的模板溶液。

2、將9微升模板溶液與16微升預(yù)擴(kuò)增體系混合，得到進(jìn)樣液。

預(yù)擴(kuò)增體系(16μl)：含有12.5μl的2×反應(yīng)液(rm)、1.5μl的酶混合物(em)、19μm鈣黃綠素和0.8μm氯化錳。

上述預(yù)擴(kuò)增體系為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的預(yù)擴(kuò)增體系。

3、將步驟2得到的進(jìn)樣液加入實(shí)施例2制備的檢測(cè)裝置的進(jìn)樣孔，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增(63℃、60分鐘)。

待測(cè)病毒為豬口蹄疫病毒o/a/asiai型時(shí)的結(jié)果見圖1。固定有用于檢測(cè)豬口蹄疫病毒o/a/asiai型的引物組的反應(yīng)池7和8所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

待測(cè)病毒為豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型時(shí)的結(jié)果見圖2。固定有用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型的引物組的反應(yīng)池16和17所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

待測(cè)病毒為豬瘟病毒時(shí)的結(jié)果見圖3。固定有用于檢測(cè)豬瘟病毒的引物組的反應(yīng)池19和20所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

待測(cè)病毒為豬圓環(huán)病毒ⅱ型時(shí)的結(jié)果見圖4。固定有用于檢測(cè)豬圓環(huán)病毒ⅱ型的引物組的反應(yīng)池4和5所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

待測(cè)病毒為豬細(xì)小病毒時(shí)的結(jié)果見圖5。固定有用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒的引物組的反應(yīng)池10和11所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

待測(cè)病毒為豬偽狂犬病病毒時(shí)的結(jié)果見圖6。固定有用于檢測(cè)豬偽狂犬病病毒的引物組的反應(yīng)池13和14所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

結(jié)果表明，本發(fā)明提供的6種豬病毒的lamp成套引物以及相應(yīng)檢測(cè)裝置可以實(shí)現(xiàn)對(duì)6種病毒中每種病毒的特異性檢測(cè)，相互之間均不存在交叉反應(yīng)，無假陽(yáng)性。

實(shí)施例4、利用恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片檢測(cè)豬的血清樣本

1、取病豬的鼻咽拭子，采用cwbio組織/細(xì)胞dna/rna共提取試劑盒80204(康為世紀(jì)公司產(chǎn)品)提取，得到核酸樣本。

2、將9微升核酸樣本與16微升預(yù)擴(kuò)增體系混合，得到進(jìn)樣液。

預(yù)擴(kuò)增體系(16μl)：含有12.5μl的2×反應(yīng)液(rm)、1.5μl的酶混合物(em)、19μm鈣黃綠素和0.8μm氯化錳。

3、將步驟2得到的進(jìn)樣液加入實(shí)施例2制備的檢測(cè)裝置的進(jìn)樣孔，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增(63℃、60分鐘)。

結(jié)果見圖7。固定有用于檢測(cè)豬細(xì)小病毒的引物組的反應(yīng)池10和11所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果；固定有用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型的引物組的反應(yīng)池16和17所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。結(jié)果表明，該病豬感染了豬細(xì)小病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型，沒有感染豬圓環(huán)病毒ⅱ型、豬口蹄疫病毒o/a/asiai型、豬偽狂犬病病毒和豬瘟病毒。

取病豬的鼻咽拭子，進(jìn)行經(jīng)典的病毒分離培養(yǎng)鑒定，與上述結(jié)果一致。

實(shí)施例5、檢測(cè)恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片的特異性

待測(cè)病毒分別為：小反芻獸疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型、豬流感病毒。

1、取待測(cè)病毒，用cwbio組織/細(xì)胞dna/rna共提取試劑盒80204(康為世紀(jì)公司產(chǎn)品)提取，得到核酸樣本。

2、將9微升核酸樣本與16微升預(yù)擴(kuò)增體系混合，得到進(jìn)樣液。

預(yù)擴(kuò)增體系(16μl)：含有12.5μl的2×反應(yīng)液(rm)、1.5μl的酶混合物(em)、19μm鈣黃綠素和0.8μm氯化錳。

3、將步驟2得到的進(jìn)樣液加入實(shí)施例2制備的檢測(cè)裝置的進(jìn)樣孔，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增(63℃、60分鐘)。

陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)池所對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線為典型的“s型”擴(kuò)增曲線。其他各個(gè)反應(yīng)池對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線均為水平的直線，為陰性結(jié)果。

本發(fā)明提供的6種豬病毒的lamp成套引物以及相應(yīng)檢測(cè)裝置與小反芻獸疫病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒歐洲型、豬流感病毒均不存在交叉反應(yīng)，無假陽(yáng)性。

實(shí)施例6、檢測(cè)恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片的重復(fù)性

1、分別提取豬口蹄疫病毒o/a/asiai型、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲型、豬圓環(huán)病毒ⅱ型、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病病毒(具體信息見表1)的核酸，然后將六種核酸混合，得到混合樣本，混合樣本中各種病毒的核酸濃度均為5×10³拷貝/μl。進(jìn)行三次制備，得到混合樣本1、混合樣本2和混合樣本3。

2、將9微升混合樣本(混合樣本1、混合樣本2或混合樣本3)與16微升預(yù)擴(kuò)增體系混合，得到進(jìn)樣液。

預(yù)擴(kuò)增體系(16μl)：含有12.5μl的2×反應(yīng)液(rm)、1.5μl的酶混合物(em)、19μm鈣黃綠素和0.8μm氯化錳。

3、將步驟2得到的進(jìn)樣液加入實(shí)施例2制備的檢測(cè)裝置的進(jìn)樣孔，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增(63℃、60分鐘)。

混合樣本1、混合樣本2和混合樣本3的結(jié)果一致，均可以在固定引物組相應(yīng)的反應(yīng)池檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果，說明應(yīng)用本發(fā)明提供的6種豬病毒的lamp成套引物以及相應(yīng)檢測(cè)裝置進(jìn)行六種病毒的檢測(cè)，重復(fù)性良好。

sequencelisting

<110>北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司

中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院

<120>同時(shí)檢測(cè)6種豬病毒的系統(tǒng)及其專用lamp引物

<130>gncyx171236

<160>42

<170>patentinversion3.5

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<213>豬口蹄疫病毒o/a/asiai型

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<213>豬瘟病毒

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<213>豬繁殖與呼吸綜合征病毒

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<213>豬細(xì)小病毒

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<213>豬偽狂犬病病毒

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