本發(fā)明涉及一種殼聚糖或其衍生物多重交聯(lián)凝膠和制備方法。采用該方法，形成交聯(lián)殼聚糖凝膠的速度較快，保證殼聚糖在交聯(lián)反應中的降解較慢，同時提高了交聯(lián)劑的利用率，在交聯(lián)度相同的情況下，多次交聯(lián)可以增加凝膠的粘彈性模量，可以減少對人體有刺激性或毒性的交聯(lián)劑的使用。采用本方法制備的殼聚糖凝膠，具有與人體軟組織相似的機械性能與流變學性能，且具有生物相容性好，生物安全性高，體內可降解等優(yōu)點。本發(fā)明可應用于組織工程中的軟組織領域，包括組織填充與修復，關節(jié)粘彈性補充劑，生物支架，抗瘢痕防粘連以及生物膠等。

背景技術：

殼聚糖（又稱葡糖胺聚糖，英文名及簡稱：chitosan，cs）是甲殼素經過脫乙酰處理后得到的產物，所以又被稱為：“脫乙酰甲殼素”。殼聚糖是由n-乙酰-d-氨基葡萄糖單體通過β-l,4-糖苷鍵連接起來的直鏈狀高分子化合物，難溶于水，卻易溶于酸。殼聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，無毒，物理和化學性質相對穩(wěn)定，粘合性好，成纖維及成膜性能優(yōu)良，是一種可被生物體降解吸收的天然高分子材料。殼聚糖具有非常高的醫(yī)用價值：殼聚糖可降低體內的膽固醇；還具有良好的抑菌效果，能夠不利于細菌生長的環(huán)境；殼聚糖可以吸附和排泄體內重金屬；還有能預防高血壓，提高人體免疫力等功效。研究表明溶菌酶（一種人體體液中含量較高的抗菌物質，淚液中的含量最多，大約占人體淚液蛋白含量的40%），可以催化水解殼聚糖的β-1,4-氨基葡萄糖苷鍵成為氨基葡萄糖，因此殼聚糖在體內可被降解吸收。此外，體內的多種活性物質，如活性氧簇自由基以及甲殼素酶、葡萄糖酶、蛋白酶、脂酶、纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶等30多種酶制劑也促進殼聚糖的降解代謝。酶對多糖的水解具有高度的選擇性，而無其它副反應。因此，殼聚糖作為一種非常安全的天然高分子多糖，已經廣泛的應用在生物醫(yī)藥，組織工程等領域。

此外，殼聚糖還有多種衍生產物。由于殼聚糖結構中的2位nh2基團與6位oh基團可作為殼聚糖中的兩個反應位點，可以通過此兩個反應位點對殼聚糖進行改性修。例如，2位nh2與6位oh被羧甲基化后得到的羧甲基殼聚糖，為水溶性可殼聚糖衍生物，也是最為廣泛應用的殼聚糖衍生物，已經應用于防粘連，止血以及關節(jié)腔粘彈性補充劑等方面；此兩個位點被環(huán)氧丁烷羥丁基化后得到的羥丁基殼聚糖，羥丁基殼聚糖溶液具有溫敏特性，在低溫下溶液狀態(tài)，升高溫度后可形成凝膠態(tài)，據(jù)文獻報道（魏長征等，中國脊柱脊髓雜志，2009，10，769-773）已經應用于防粘連領域；此外，還有針對2位nh2進行季銨化改性的季銨化殼聚糖，據(jù)文獻報道（王鳳菊等，化工新型材料，2011，11，13-15）已經應用于抑菌材料領域。

在殼聚糖的交聯(lián)領域，更多的都是采用醛基化合物或其衍生物（如甲醛、戊二醛、京尼平等）、鹵代烴（如環(huán)氧氯丙烷等）交聯(lián)劑對殼聚糖進行交聯(lián)。中國專利cn201410141716.3中公開了殼聚糖雙網絡快速響應可注射水凝膠的制備方法，該專利采用β-甘油磷酸鈉與戊二醛共用，通過β-甘油磷酸鈉的物理交聯(lián)與戊二醛的化學交聯(lián)雙重網絡制備了快速響應水凝膠，該凝膠同時具備物理與化學雙重交聯(lián)網絡，其中戊二醛與殼聚糖是通過形成席夫堿而完成交聯(lián)。cn201610613687.5公開了一種采用環(huán)氧氯丙烷作為主要交聯(lián)劑的殼聚糖微球的制備方法，作為吸附材料使用。cn201610495286.4公開了一種采用環(huán)氧氯丙烷作為交聯(lián)劑制備殼聚糖微球的制備方法，也同樣作為吸附材料使用。

傳統(tǒng)的殼聚糖交聯(lián)劑主要用于制作交聯(lián)殼聚糖微球，包括戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球（李湛勇等，離子交換與吸附，1999,15(5),425）與環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)的殼聚糖微球（上文提到的發(fā)明專利）。由此可見，傳統(tǒng)交聯(lián)劑交聯(lián)得到的交聯(lián)殼聚糖具有較高的機械強度，可以填充在離子交換柱中，作為吸附材料使用，并不太適合于組織工程中的軟組織領域。而cn201410141716.3雖然公開了可注射水凝膠的制備方法，但該凝膠依舊采用了傳統(tǒng)的戊二醛交聯(lián)劑。對于有一定生物毒性的戊二醛，若作為交聯(lián)劑進入體內，其對生物體造成的不良反應就必須考慮在內。這是由于醛基與氨基形成的席夫堿是動態(tài)可逆的，殼聚糖主體在體內降解之后，會有一定量的戊二醛以原型狀態(tài)進入到體內，造成一定的不良反應。因此，采用新型交聯(lián)劑對殼聚糖進行交聯(lián)是非常必要的。

當前在多糖交聯(lián)領域廣泛應用的交聯(lián)劑為多元環(huán)氧類交聯(lián)劑，此類交聯(lián)劑已經廣泛地應用于透明質酸的交聯(lián)之中，包括1,4-丁二醇二縮水甘油醚（bdde）對透明質酸進行交聯(lián)（周奎等，安徽化工，2014，06，44-45），以及1,2,7,8-二環(huán)氧丁烷（deo）對透明質酸進行交聯(lián)（cn201110289906.6）。環(huán)氧化合物對透明質酸的交聯(lián)機理包括在強堿性環(huán)境下，透明質酸的羥基對環(huán)氧基團進行開環(huán)反應，或者在強酸性環(huán)境下由透明質酸的羧基對環(huán)氧基團進行開環(huán)反應而達到交聯(lián)的目的。

然而，將多元環(huán)氧類交聯(lián)劑應用于殼聚糖的交聯(lián)卻鮮有報道，因為上述透明質酸的交聯(lián)條件難以應用于環(huán)氧基團對殼聚糖的交聯(lián)反應中，理由如下：首先，殼聚糖在強堿性環(huán)境下會非?？焖俚谋凰?，在交聯(lián)反應完成之前，殼聚糖就被水解成小分子，難以形成較量凝膠；其次，殼聚糖雖然在酸性環(huán)境下較為穩(wěn)定，但殼聚糖中卻沒有可以與環(huán)氧基團反應的官能團（羥基與氨基均無法在酸性環(huán)境下對環(huán)氧基團進行開環(huán)）；再次，中性環(huán)境下，由于殼聚糖中部分氨基會被質子化，導致反應速率較慢，時間較長，會造成環(huán)氧基團的水解而導致交聯(lián)效率不高。因此，環(huán)氧基團對殼聚糖的交聯(lián)需要在特定的條件下進行。此外，cn201410141716.3雖然提出了可以采用水溶性環(huán)氧化合物如1,4-丁二醇二縮水甘油醚或1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷作為化學交聯(lián)劑，但該專利更側重于物理與化學雙重交聯(lián)網絡，化學交聯(lián)僅為單次交聯(lián)并不存在多重交聯(lián)的情況，其生物相容性和軟組織的匹配性并不會強于多重交聯(lián)的殼聚糖凝膠。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖或其衍生物多重交聯(lián)凝膠和制備方法。采用多元環(huán)氧化合物對殼聚糖進行多重交聯(lián)，形成凝膠的速度較快，保證殼聚糖在交聯(lián)反應中的降解較慢，同時提高了交聯(lián)劑的利用率，在交聯(lián)度相同的情況下，多次交聯(lián)可以增加凝膠的粘彈性模量。因為殼聚糖不溶于水，所以殼聚糖的交聯(lián)方法與水溶性殼聚糖衍生物的交聯(lián)方法稍有差別。本發(fā)明制備的殼聚糖凝膠，具有與人體軟組織相似的機械性能與流變學性能，且生物相容性好，安全性高，體內可降解等優(yōu)點。本發(fā)明具有反應條件簡單，響應時間短，所形成的凝膠熱穩(wěn)定性較好且機械強度較高，生物相容性好等優(yōu)點。本發(fā)明可應用于組織工程中的軟組織領域，包括組織填充與修復，生物支架，抗瘢痕防粘連以及生物膠等。

本發(fā)明提供的一種殼聚糖或其衍生物多重交聯(lián)凝膠,其制備方法是:將殼聚糖溶解于鹽酸溶液中，加入β-甘油磷酸鈉并調節(jié)至微堿性，加入交聯(lián)劑多元環(huán)氧化合物，攪拌均勻后完成交聯(lián)；取出交聯(lián)凝膠塊并粉碎成凝膠顆粒，再次將凝膠顆粒投入到殼聚糖與β-甘油磷酸鈉的水溶液中，加入多元環(huán)氧化合物進行二次交聯(lián)，取出交聯(lián)凝膠塊并進行粉碎，多次重復上述操作，可得到三次交聯(lián)或更多次交聯(lián)的多重交聯(lián)殼聚糖凝膠?；?/p>

將水溶性殼聚糖衍生物的水溶液調節(jié)至微堿性，加入多元環(huán)氧化合物，攪拌均勻后完成交聯(lián)；取出交聯(lián)凝膠塊并粉碎成凝膠顆粒，再次將凝膠顆粒投入到殼聚糖衍生物的水溶液中，加入多元環(huán)氧化合物進行二次交聯(lián)，取出交聯(lián)凝膠塊并進行粉碎，多次重復上述操作，可得到三次交聯(lián)或更多次交聯(lián)的多重交聯(lián)殼聚糖凝膠。

本發(fā)明中所選用的殼聚糖分子量范圍為20kda至2000kda，優(yōu)選分子量范圍為100kda至800kda；脫乙酰度范圍為60%至99%，優(yōu)選80%至95%；

本發(fā)明中所選用的水溶性殼聚糖衍生物主要為對殼聚糖進行側基改性的衍生物，對殼聚糖主鏈六元糖環(huán)進行破壞改性的衍生物則不適用于本專利。殼聚糖的水溶性側基改性包括：側基羧基化改性，例如羧甲基殼聚糖等；側基脂肪鏈改性，如羥丁基殼聚糖；側基磺酸化改性，如磺酸化殼聚糖；以及保留伯氨基團或仲氨基團側基季銨化改性。上述各種側基改性殼聚糖的側基取代度范圍為0.5至2.0。

本發(fā)明中選用的多元環(huán)氧化合物交聯(lián)劑包括二元、三元以及四元環(huán)氧化合物，其中，二元環(huán)氧化合物包括但不限于1,4-丁二醇二縮水甘油醚（bdde），1,2,3,4-二環(huán)氧丁烷以及1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷（deo）等化合物；三元環(huán)氧化合物包括但不限于三甲基丙烷三縮水甘油醚等化合物；四元環(huán)氧類化合物包括但不限于季戊四醇四縮水甘油醚等化合物。

本發(fā)明提供的一種殼聚糖多重交聯(lián)凝膠的制備方法包括以下步驟：

1）將殼聚糖溶解于0.01~1mol/l的鹽酸溶液中，優(yōu)選0.1mol/l，配置成5~300mg/ml的殼聚糖鹽酸水溶液，在-1~5℃的環(huán)境下滴加100~600mg/ml（優(yōu)選500mg/ml）的β-甘油磷酸鈉溶液至ph至達到7.2~7.6。

2）向殼聚糖水溶液中加入環(huán)氧交聯(lián)劑，其中，環(huán)氧交聯(lián)劑與溶液中殼聚糖固含量的質量比范圍為0.01~0.5:1；同時將溫度升至10~15℃，反應時間為18~24小時。

3）取出殼聚糖凝膠，采用分散機對殼聚糖凝膠進行粉碎分散機型號包括但不限于ika公司t系列分散機，如t65basicultra-turrax?，t65digitalultra-turrax?package或t50digitalultra-turrax?等型號的分散機，粉碎后，殼聚糖凝膠顆粒的粒徑范圍為100~2000μm；

4）按照步驟1）中操作，制備同濃度的殼聚糖-β-甘油磷酸鈉混合溶液，加入步驟3）中粉碎的殼聚糖凝膠顆粒，攪拌均勻后得到凝膠混合溶液，其中，凝膠顆粒與混合溶液的質量比范圍為：0.5~2:1。

5）加入環(huán)氧交聯(lián)劑并攪拌均勻，其中，環(huán)氧交聯(lián)劑的加入量與混合溶液中殼聚糖固含量的比例范圍為：0.01~0.5:1，保持10~15℃的條件下，反應18~24小時；反應完畢后，得到二重交聯(lián)的殼聚糖凝膠。

6）重復步驟3至步驟5的操作，重復至第二次，則可得到三重交聯(lián)的殼聚糖凝膠，其中所涉及的比例范圍均與步驟3）至步驟5）中所涉及的范圍一致。重復至第三次步驟3）至步驟5）的操作，可得到四重交聯(lián)的殼聚糖凝膠。本發(fā)明中，步驟3）至步驟5）的重復次數(shù)最多為四次，可得到五重交聯(lián)的殼聚糖凝膠。

本發(fā)明提供的一種殼聚糖水溶性衍生物多重交聯(lián)凝膠的制備方法包括以下步驟：

1）將殼聚糖水溶性衍生物溶解于0.001~0.1mol/l的氫氧化鈉溶液中，優(yōu)選0.01~0.1mol/l，配置成5~300mg/ml的殼聚糖水溶性衍生物堿性水溶液，以對殼聚糖衍生物中的氨基進行脫質子化，在20~30℃的環(huán)境下滴加1.0~6.0mol/l（優(yōu)選2.0mol/l）的鹽酸溶液將ph值調節(jié)至7.2~8.6。

2）向殼聚糖衍生物水溶液中加入環(huán)氧交聯(lián)劑，其中，環(huán)氧交聯(lián)劑與溶液中殼聚糖衍生物固含量的質量比范圍為0.01~0.5:1；同時溫度保持在20~30℃，反應時間為18~24小時。

3）取出殼聚糖衍生物凝膠，采用分散機對凝膠進行粉碎分散機型號包括但不限于ika公司t系列分散機，如t65basicultra-turrax?，t65digitalultra-turrax?package或t50digitalultra-turrax?等型號的分散機，粉碎后，殼聚糖衍生物凝膠顆粒的粒徑范圍為100~2000μm；

4）按照步驟1）中操作，制備同濃度的殼聚糖衍生物水溶液，加入步驟3）中粉碎的殼聚糖凝膠顆粒，攪拌均勻后得到凝膠混合溶液，其中，凝膠顆粒與混合溶液的質量比范圍為：0.5~2:1。

5）加入環(huán)氧交聯(lián)劑并攪拌均勻，其中，環(huán)氧交聯(lián)劑的加入量與混合溶液中殼聚糖衍生物固含量的比例范圍為：0.01~0.5:1，保持20~30℃的條件下，反應18~24小時；反應完畢后，得到二重交聯(lián)的殼聚糖衍生物凝膠。

6）重復步驟3）至步驟5）的操作，重復至第二次，則可得到三重交聯(lián)的殼聚糖凝膠，其中所涉及的比例范圍均與步驟3至步驟5中所涉及的范圍一致。重復至第三次步驟3）至步驟5）的操作，可得到四重交聯(lián)的殼聚糖凝膠。本發(fā)明中，步驟3）至步驟5）的重復次數(shù)最多為四次，可得到五重交聯(lián)的殼聚糖凝膠。

本發(fā)明提供了一種殼聚糖或其衍生物多重交聯(lián)凝膠和制備方法。通過對殼聚糖或其衍生物進行多重交聯(lián)，可在不提高凝膠交聯(lián)度的情況下，進一步提高凝膠的彈性模量、粘性模量并進一步減少凝膠的溶漲度。多重交聯(lián)的過程中，每增加一重交聯(lián)，都可以進一步提高殼聚糖凝膠的彈性模量與粘性模量?？赏ㄟ^不同組織部位的粘彈性模量的特點，選擇殼聚糖凝膠的交聯(lián)次數(shù)，使得殼聚糖凝膠的粘彈性模量與相關組織相匹配，以提高凝膠在該組織內的組織相容性。本發(fā)明可應用于組織工程中的軟組織領域，包括組織填充與修復，關節(jié)粘彈性補充劑，生物支架，抗瘢痕防粘連以及生物膠等。

具體實施方式

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，這并不限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件以及手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件；所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可由商業(yè)途徑獲得。

實施例1：二重交聯(lián)殼聚糖凝膠的制備

稱取殼聚糖粉末（脫乙酰度85%，分子量20kda）30.0g，溶解于100ml0.1mol/l的鹽酸溶液中，升溫至30℃，攪拌1h，得到質量濃度為300mg/ml的殼聚糖鹽酸溶液。將殼聚糖鹽酸溶液冷卻至0℃，滴加15ml質量濃度為500mg/ml的β-甘油磷酸鈉溶液，持續(xù)攪拌2h，攪拌完成后溶液的ph值為7.3左右。向溶液中加入bdde(1,4-丁二醇縮水甘油醚)3.0g（bdde與殼聚糖的質量比為0.1:1），攪拌30分鐘。攪拌完成后，將溫度升高至15℃，持續(xù)24小時得到交聯(lián)殼聚糖凝膠。取出交聯(lián)殼聚糖凝膠，采用ika公司t65basicultra-turrax?型分散機在500轉/分鐘的轉數(shù)下對殼聚糖凝膠進行粉碎，粉碎時間20分鐘，得到顆粒度為500μm左右的凝膠顆粒，約140g凝膠顆粒備用，產率98%。按照上述操作，重新配置100ml殼聚糖濃度為300mg/ml的殼聚糖-β-甘油磷酸鈉混合溶液，并將140g殼聚糖凝膠顆粒與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加bdde3.0g，15℃下反應24小時。反應結束后得到二重交聯(lián)的殼聚糖凝膠，產量約270g，產率95%左右。

實施例2：三重交聯(lián)羧甲基殼聚糖凝膠的制備

稱取羧甲基殼聚糖粉末（脫乙酰度85%，羧甲基取代度1.1，分子量80kda）25.0g，溶解于100ml0.1mol/l的氫氧化鈉溶液中，攪拌1h，得到質量濃度為250mg/ml的羧甲基殼聚糖堿性溶液。25℃條件下，用濃度為2.0mol/l的鹽酸溶液，調節(jié)羧甲基殼聚糖溶液的ph值至8.0左右。向溶液中加入bdde5.0g（bdde與殼聚糖的質量比為0.2:1），攪拌30分鐘。攪拌完成后，保持溫度25℃，持續(xù)18小時得到交聯(lián)羧甲基殼聚糖凝膠。取出交聯(lián)羧甲基殼聚糖凝膠，采用ika公司t65digitalultra-turrax?package型分散機在400轉/分鐘的轉數(shù)下對凝膠進行粉碎，粉碎時間20分鐘，得到顆粒度為700μm左右的凝膠顆粒，約130g凝膠顆粒備用，產率98%。按照之前的操作，重新配置100ml羧甲基殼聚糖濃度為250mg/ml的羧甲基殼聚糖溶液，并將130g羧甲基殼聚糖凝膠顆粒與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加bdde4.0g，25℃下反應18小時。反應結束后得到二重交聯(lián)的羧甲基殼聚糖凝膠，產量約250g，產率95%左右。再次按照之前的操作，重新配置100ml羧甲基殼聚糖濃度為250mg/ml的羧甲基殼聚糖溶液，并將250g羧甲基殼聚糖凝膠粉碎成顆粒后與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加bdde3.0g，25℃下反應18小時。反應結束后得到三重交聯(lián)的羧甲基殼聚糖凝膠，產量約360g，產率92%左右。

實施例3：五重交聯(lián)羥丁基殼聚糖凝膠的制備

稱取羥丁基殼聚糖粉末（脫乙酰度90%，羧甲基取代度1.5，分子量100kda）20.0g，溶解于100ml0.1mol/l的氫氧化鈉溶液中，攪拌1h，得到質量濃度為200mg/ml的羥丁基殼聚糖堿性溶液。25℃條件下，用濃度為1.0mol/l的鹽酸溶液，調節(jié)羥丁基殼聚糖溶液的ph值至7.8左右。向溶液中加入deo(1,2,7,8-二環(huán)氧辛烷)5.0g（deo與殼聚糖的質量比為0.4:1），攪拌30分鐘。攪拌完成后，保持溫度25℃，持續(xù)18小時得到交聯(lián)羥丁基殼聚糖凝膠。取出交聯(lián)羥丁基殼聚糖凝膠，采用ika公司t65digitalultra-turrax?package型分散機在300轉/分鐘的轉數(shù)下對凝膠進行粉碎，粉碎時間20分鐘，得到顆粒度為900μm左右的凝膠顆粒，約125g凝膠顆粒備用，產率98%。按照之前的操作，重新配置100ml羥丁基殼聚糖濃度為250mg/ml的羥丁基殼聚糖溶液，并將125g羥丁基殼聚糖凝膠顆粒與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加deo4.0g，25℃下反應18小時。反應結束后得到二重交聯(lián)的羥丁基殼聚糖凝膠，產量約240g，產率95%左右。再次按照之前的操作，重新配置100ml羥丁基殼聚糖濃度為200mg/ml的羥丁基殼聚糖溶液，并將240g羥丁基殼聚糖凝膠粉碎成顆粒后與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加deo3.0g，25℃下反應18小時。反應結束后得到三重交聯(lián)的羥丁基殼聚糖凝膠，產量約350g，產率92%左右。第三次按照之前的操作，重新配置100ml羥丁基殼聚糖濃度為200mg/ml的羥丁基殼聚糖溶液，并將350g羥丁基殼聚糖凝膠粉碎成顆粒后與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加deo2.0g，25℃下反應18小時。反應結束后得到四重交聯(lián)的羥丁基殼聚糖凝膠，產量約460g，產率90%左右。第四次按照之前的操作，重新配置100ml羥丁基殼聚糖濃度為200mg/ml的羥丁基殼聚糖溶液，并將460g羥丁基殼聚糖凝膠粉碎成顆粒后與溶液混合，攪拌30分鐘，同時補加deo2.0g，25℃下反應18小時。反應結束后得到五重交聯(lián)的羥丁基殼聚糖凝膠，產量約570g，產率87%左右。

實施例4：多重交聯(lián)羧甲基殼聚糖凝膠的流變學性能檢測

分別將交聯(lián)度為2%、5%、8%、10%、15%、20%采用單次、二重、三重、四重、五重交聯(lián)的羧甲基殼聚糖凝膠稀釋至羧甲基殼聚糖濃度為20mg/ml的水凝膠，上述四種凝膠各取1ml，采用錐板式旋轉流變儀（沃特斯中國有限公司dhr-1）進行流變學性能檢測，以確定各四種凝膠的流變學數(shù)據(jù)，檢測時，固定應力應變值為10%，頻率值固定為2.5hz，檢測結果如表1。從表中可以看出，在相同的交聯(lián)度下，隨著交聯(lián)次數(shù)的增多，凝膠的彈性模量與粘性模量均呈上升趨勢。

表1、不同交聯(lián)度的多重交聯(lián)羧甲基殼聚糖粘彈性模量