本發(fā)明涉及一種β-甘露聚糖酶突變體的原位快速半定量篩選方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

β-甘露聚糖酶(β-mannanase,ec3.2.1.78)屬于半纖維素酶，可以在β-1,4-d-甘露聚糖分子的主鏈內(nèi)部隨機(jī)切割β-1,4-d-甘露糖苷鍵，從而產(chǎn)生不同長度的低聚甘露糖。低聚甘露糖作為添加劑在動物飼料行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，也是膳食纖維的重要成分，此外在造紙、紡織業(yè)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、食品及石油開采等領(lǐng)域也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

大腸桿菌表達(dá)β-甘露聚糖酶具表達(dá)量高、培養(yǎng)周期短、成本低等優(yōu)勢。但由于重組的β-甘露聚糖酶多為胞內(nèi)表達(dá)，而底物甘露聚糖屬于大分子化合物，無法自由進(jìn)出大腸桿菌細(xì)胞壁，酶活的檢測通常需要對細(xì)胞進(jìn)行繁瑣、耗時(shí)、耗能的破壁處理。特別的，當(dāng)對β-甘露聚糖酶引入隨機(jī)突變，而這種突變庫通常達(dá)到10³以上數(shù)量級，對每個突變體逐一進(jìn)行細(xì)胞破壁、重組酶純化、酶活檢測，檢測周期以及人力、物力需要都非常巨大，無法高效的實(shí)現(xiàn)突變體庫的大規(guī)模篩選。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于大腸桿菌重組表達(dá)β-甘露聚糖酶酶活的半定量篩選方法，該方法無需細(xì)胞破壁、蛋白純化，且可以批量處理，大大縮短了突變體的初篩時(shí)間，提高了效率，且操作簡便、快速，成本低廉，有利于β-甘露聚糖酶突變體庫的高效篩選獲得候選突變體。

為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的采用如下技術(shù)方案：

一種β-甘露聚糖酶工程菌的篩選方法，包括如下步驟：

(1)將β-甘露聚糖酶的表達(dá)菌在含有臺酚藍(lán)的kt平板上培養(yǎng)，直至平板上產(chǎn)生水解圈；

(2)測量水解圈直徑與微生物菌落直徑，以二者大小的比值作為β-甘露聚糖酶的酶活指數(shù)(ei)，該指數(shù)與酶活正相關(guān)。

步驟(1)所述的培養(yǎng)包括三個階段：第一階段為37±2℃保溫6-12h；第二階段為25±2℃保溫1-3h；第三階段為30-60℃保溫8-20h。

所述第一階段為37℃保溫10h。

所述第二階段為25℃保溫2h。

所述第三階段的溫度為37℃～50℃。

所述第三階段的保溫時(shí)間為12h。

所述kt平板的原料組分為：1-2％蛋白胨、0.5-1％酵母提取物、1％氯化鈉、1-3％瓊脂和0.3-1％魔芋膠溶液。

所述kt平板的配制：將上述原料混合后115℃條件下高壓滅菌20min，冷卻后加入預(yù)先配制好的1％臺酚藍(lán)溶液至終濃度為0.02-0.05％。

所述β-甘露聚糖酶表達(dá)菌，其宿主菌為e.colibl21(de3)或e.colibl21。

所述β-甘露聚糖酶表達(dá)菌，其表達(dá)載體為pet30(a)。

本發(fā)明的基本原理是臺酚藍(lán)可結(jié)合甘露聚糖將其染成藍(lán)色，而β-甘露聚糖酶具有降解甘露聚糖的能力，從而在kt平板上產(chǎn)生透明水解圈，且透明圈直徑/微生物菌落直徑的比值(ei值)與酶活力正相關(guān)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)無需對工程菌裂解，即可實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)β-甘露聚糖酶酶活的快速檢測。所需步驟簡單，耗時(shí)短，成本低廉，且利于高通量篩選。

(2)通過透明圈直徑/微生物菌落直徑的比值(ei值)的檢測，可以半定量檢測工程菌內(nèi)β-甘露聚糖酶酶活，有利于該酶突變體的高通量篩選的展開。

附圖說明

圖1為β-甘露聚糖酶胞內(nèi)產(chǎn)生菌的篩選平板的應(yīng)用圖。a-c：平板在37℃培養(yǎng)10h，后繼續(xù)在25℃培養(yǎng)2h拍照；d-f：將a-c分別對應(yīng)轉(zhuǎn)移至50、37和25℃培養(yǎng)12h。其中“0”表示的是e.colibl21(de3)，1、2、3、4、5標(biāo)號表示e.colibl21(de3)/pet30-man25。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。

實(shí)施例1

一、重組β-甘露聚糖酶活性初步原位驗(yàn)證

首先配制篩選用kt平板。配制1％臺酚藍(lán)溶液，過濾除菌以備用。配制含1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化鈉、1.5％瓊脂和0.5％魔芋膠溶液，于115℃滅菌20分鐘后加入一定量的1％臺酚藍(lán)溶液至終濃度為0.03％。每20ml培養(yǎng)基鋪制一塊90mm平板。臺酚藍(lán)與魔芋膠可以緊密結(jié)合，配制好的平板呈均勻藍(lán)色。

用無菌牙簽挑取本實(shí)驗(yàn)室保存的β-甘露聚糖酶表達(dá)菌株e.colibl21(de3)/pet30-man25與e.colibl21(de3)到新制備的kt平板上。其中，e.colibl21(de3)作為對照組，β-甘露聚糖酶表達(dá)菌株e.colibl21(de3)/pet30-man25是將β-甘露聚糖酶編碼基因插入到pet30a表達(dá)載體ndei和xhoi酶切位點(diǎn)中構(gòu)建獲得。

按照以下方案進(jìn)行β-甘露聚糖酶的表達(dá)和活性半定量篩選：

1.菌體培養(yǎng)。37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)10h。

2.β-甘露聚糖酶表達(dá)。25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2h。

3.β-甘露聚糖酶催化反應(yīng)。將kt平板分別轉(zhuǎn)移到25、37或50℃培養(yǎng)箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)12h。

此時(shí)平板上呈現(xiàn)出不同大小、亮度的水解圈(圖1)。結(jié)果表明，在50℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，水解圈直徑最大、最明顯。后續(xù)酶活半定量檢測將采用此條件進(jìn)行。

二、重組β-甘露聚糖酶紫外誘變

取對數(shù)生長中期的5mle.colibl21(de3)/pet30-man25菌液，添加至無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，調(diào)整距離為30cm，紫外燈照射劑量為60s。照射的同時(shí)進(jìn)行磁力攪拌。隨后將菌液繼續(xù)在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)6-8h后，涂布在lb/kan平板上，于37℃培養(yǎng)過夜，作為原始突變庫。最終共分離獲得167個單菌落。

三、重組β-甘露聚糖酶突變體的透明圈法在突變株篩選中的應(yīng)用

分別挑取步驟二所得的單克隆菌落至kt平板上，其中約9株透明圈較大。分別用游標(biāo)卡尺測定菌落直徑和透明圈直徑，并計(jì)算ei值。

測定結(jié)果如表1所示。其中uv15，uv22和uv101的ei值較大，選擇這3個菌株為優(yōu)良突變株進(jìn)行β-甘露聚糖酶酶活的驗(yàn)證測定。

表1e.colibl21(de3)/pet30-man25突變株臺酚藍(lán)法透明水解圈測定

將原始菌株和uv15，uv22和uv101四個菌株，按照常規(guī)大腸桿菌重組表達(dá)外源酶方法進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，對其進(jìn)行β-甘露聚糖酶酶活力測定結(jié)果見表2。透明圈大的突變株，其在液體培養(yǎng)基中β-甘露聚糖酶酶活也高，其中uv101的β-甘露聚糖酶酶活較原始菌株提高了1.9倍。

表2突變菌株β-甘露聚糖酶酶活測定

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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<110>華南理工大學(xué)

<120>一種β-甘露聚糖酶工程菌的篩選方法

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