本發(fā)明屬于固體廢棄物資源化利用領域，具體涉及一株芽孢桿菌(bacillusaxarquiensis)cts-bq1及其促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的預處理作用，可應用于鳳眼蓮高值化利用的前處理。

背景技術：

鳳眼蓮作為一種侵害性水生植物，一方面其生長快速、且適應性強，腐敗變質(zhì)后易污染水體；另一方面其生長在水中，產(chǎn)量大，不占用土地面積，其纖維素、半纖維素含量高，是較有潛力的生物能源物質(zhì)的生產(chǎn)原料。但因其含水率高，木質(zhì)素包裹纖維素使其較難釋放，不易被利用，其預處理成本高，產(chǎn)糖產(chǎn)乙醇效率低。生物預處理法具有作用條件溫和、能耗低、環(huán)境污染小，處理成本低等優(yōu)點，是極具潛力的預處理方法。但目前的生物預處理研究中仍然存在木質(zhì)素降解微生物種類少，降解條件苛刻，木質(zhì)素分解酶類的酶活力低，作用周期長，在處理過程中部分纖維素和半纖維素會被細菌消耗掉等問題；生物酶經(jīng)濟成本高，酶預處理大大提高了生產(chǎn)成本，使得生物預處理難以實現(xiàn)工業(yè)化應用。如何克服上述問題，找到適合的預處理發(fā)酵菌株成為生物預處理研究的熱點。

脫膠菌多用于對苧麻的研究，通過去除麻類物質(zhì)中的膠質(zhì)成分同時保留其纖維成分，增強麻類纖維性能，這種脫膠方法針對其他類型植物鮮有涉及。借鑒前人對苧麻脫膠菌的篩選方法，從鳳眼蓮不同生長環(huán)境中篩選降解鳳眼蓮非纖維素的優(yōu)良菌株，并對其產(chǎn)酶特性進行了探究。目前報道的脫膠菌株有放線菌屬、纖維單胞菌、志賀菌屬和枯草芽孢桿菌等，這些都是對麻類的脫膠菌株，而對bacillusaxarquiensis報道較少。

技術實現(xiàn)要素：

為改進現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種芽孢桿菌及其應用，該芽孢桿菌預處理鳳眼蓮酶解產(chǎn)糖具有顯著促進作用。

本發(fā)明第一方面提供了一種芽孢桿菌(bacillusaxarquiensis)cts-bq1，已于2017年5月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno：m2017273,地址：中國，武漢，武漢大學。

本發(fā)明第二方面提供了上述芽孢桿菌cts-bq1在促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖中的應用。

本發(fā)明第三方面提供了一種促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的方法，步驟包括：采芽孢桿菌cts-bq1，擴增培養(yǎng)后得到菌母液，然后將菌母液接種至盛有鳳眼蓮鮮樣的發(fā)酵瓶中。

本發(fā)明第四方面提供了一種促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的微生物菌劑，所述微生物菌劑的活性成分包括上述芽孢桿菌cts-bq1。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所提供的菌株豐富了野生脫膠菌遺傳資源，擴大了脫膠菌全基因組育種的后備庫。該菌比報道效果較好的白腐菌更能提高鳳眼蓮酶解產(chǎn)糖量，效率高，比商業(yè)果膠酶經(jīng)濟且效果顯著，具有廣闊的應用前景。采用檢測基質(zhì)酶解產(chǎn)糖效率的方式檢測芽孢桿菌cts-bq1預處理鳳眼蓮后基質(zhì)酶解產(chǎn)糖效果的試驗中，酶解液中最大糖產(chǎn)量為142mg/g原料干基，產(chǎn)糖效果提高顯著。

附圖說明

圖1：分離菌株預處理鳳眼蓮后72h酶解產(chǎn)糖量比較。

圖2：分離菌株的預處理液糖含量圖。

圖3：分離菌株的產(chǎn)耗糖比例圖。

圖4：不同預處理條件對菌株cts-bq1預處理鳳眼蓮鮮樣基質(zhì)的酶解糖產(chǎn)量的影響。

圖5：不同生物預處鳳眼蓮基質(zhì)的酶解產(chǎn)糖量比較。

具體實施方式

本發(fā)明第一方面提供了一種芽孢桿菌(bacillusaxarquiensis)cts-bq1，已于2017年5月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno：m2017273,地址：中國，武漢，武漢大學。

上述芽孢桿菌cts-bq1是利用以果膠為唯一碳源的分離培養(yǎng)基從養(yǎng)豬場附近的生長鳳眼蓮的池塘水中篩選得到的一株細菌。所述芽孢桿菌cts-bq1的菌落形態(tài)特征：菌落為污白色、表面光滑濕潤，邊緣不整齊，革蘭氏陽性菌。

芽孢桿菌cts-bq1的16srdna序列如序列表seqidno.1所示，與genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，最終確定菌株cts-bq1為芽孢桿菌。

本發(fā)明第二方面提供了上述芽孢桿菌cts-bq1在促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖中的應用。

在本發(fā)明的一個實施例中，通過檢測基質(zhì)酶解產(chǎn)糖效率的方式檢測芽孢桿菌cts-bq1預處理鳳眼蓮后基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的效果，具體方法是：采用上述芽孢桿菌cts-bq1，擴增培養(yǎng)后得到菌母液，將菌母液按2％的接種量接種到含脫膠培養(yǎng)基中，于35℃、145rpm振蕩培養(yǎng)3天，固液分離，將固體于65℃下烘干，以30fpu/g底物的纖維素酶負荷酶解烘干固體72h，dns法檢測酶解液中還原糖產(chǎn)量。酶解液中最大糖產(chǎn)量為142mg/g原料干基，產(chǎn)糖效果提高顯著。可見芽孢桿菌cts-bq1在促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖具有良好的應用前景。

本發(fā)明第三方面提供了一種促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的方法，步驟包括：采芽孢桿菌cts-bq1，擴增培養(yǎng)后得到菌母液，然后將菌母液接種至盛有鳳眼蓮鮮樣的發(fā)酵瓶中。

優(yōu)選的，所述菌母液按2％的接種量接種至盛有鳳眼蓮鮮樣的發(fā)酵瓶中，在35℃、初始ph＝9的條件下培養(yǎng)3天。

本發(fā)明第四方面提供了一種促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的微生物菌劑，所述微生物菌劑的活性成分包括上述芽孢桿菌cts-bq1。

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的一株促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的芽孢桿菌及其應用予以進一步說明。下面描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料如無特殊說明，均為市場購買得到。

實施例中所涉及的培養(yǎng)基配方如下：

分離培養(yǎng)基：(ⅰ)k2so40.01％0.1g，cacl20.2g，nacl0.2g，mgso4·7h2o0.3g，kno30.5g，(nh4)2so40.5g，k2hpo41g，瓊脂20g，蒸餾水1l；(ⅱ)果膠1g，瓊脂5g，ph7.0，蒸餾水1l。在培養(yǎng)皿中倒雙層平板，表層為5ml培養(yǎng)基ⅱ，基層為10ml培養(yǎng)基ⅰ。

水解圈測定培養(yǎng)基：(ⅰ)feso40.01g，cacl20.2g，mgso4·7h2o0.5g，nacl0.5g，kh2po41g，nh4no33g，果膠5g，瓊脂20g，ph7.0，蒸餾水1l；(ⅱ)20g瓊脂，蒸餾水1l。在培養(yǎng)皿中倒雙層平板，表層為10ml培養(yǎng)基ⅰ，基層為10ml培養(yǎng)基ⅱ。

脫膠培養(yǎng)基：鳳眼蓮鮮樣5g，鹽溶液150ml，ph約為7.0；鹽溶液：mgso4·7h2o0.5g，k2hpo40.5g，(nh4)2so45g，無菌水1l。

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基。

白腐菌預處理基礎培養(yǎng)液：mgso4.7h2o0.05g/l，kh2po40.2g/l，cacl20.01g/l，維生素b1100mg/l，吐溫-800.05％，1ml無機鹽溶液。無機鹽溶液：0.5g/lmnso4·h2o，0.1g/lfeso4·7h2o，0.1g/lcocl2·6h2o，0.1g/lznso4·7h2o，0.01g/lcuso4·5h2o，0.01g/lalk(so4)2·12h2o，0.01g/lh3bo3，0.01g/lna2moo4·2h2o，3.0g/lmgso4·7h2o。

實施例1

本實施例進行了脫膠微生物的初步篩選，具體篩選過程如下:

采集華中農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)豬場附近生長鳳眼蓮的池塘中的池塘水、池塘底泥、南湖水、南湖底泥、野芷湖水、野芷湖底泥、鮮豬糞及生長旺盛鳳眼蓮菌株。將鳳眼蓮菌株洗凈，剪切成1～2cm的小段，風干表面水分。稱取10g底泥(含水)于裝有90ml滅菌水的無菌三角瓶中，于常溫下125r/min的振蕩速度振蕩1h后用兩層紗布過濾，得到底泥懸浮液；

稱取風干后的鳳眼蓮鮮樣5g于無菌三角瓶中，分別加入30ml水樣、底泥懸浮液，再加入270ml無菌水，于恒溫培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)至鳳眼蓮纖維分散，約5d，得到一次增殖培養(yǎng)液。另稱取5g鳳眼蓮鮮樣于無菌三角瓶中，分別加入30ml池塘水的一次增殖培養(yǎng)液、池塘底泥的一次增殖培養(yǎng)液，再加入270ml無菌水，于恒溫培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)至鳳眼蓮纖維分散，約4d，得到二次增殖培養(yǎng)液。吸取1ml二次增殖培養(yǎng)液于含有9ml無菌水的滅菌離心管中，槍頭反復潤洗3次，搖勻，即得10^-1濃度的稀釋液。吸取1ml10-1濃度的稀釋液于含有9ml無菌水的滅菌離心管中，槍頭反復潤洗3次，搖勻，即得10^-2濃度的稀釋液。以此重復制備出10^-1～10^-7濃度的稀釋菌懸液。每個樣品分別吸取0.1ml10^-5、10^-6、10^-7濃度的稀釋菌液，于以果膠為唯一碳源的分離培養(yǎng)基中涂布，待表面水分吸干后置于恒溫培養(yǎng)箱中35℃倒置培養(yǎng)3d。3d后取培養(yǎng)基中長勢較好的4株菌株，將獲得的4株菌株于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上劃線、純化4～10次。菌落初篩將上述分離得到的菌株點接于水解圈測定培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)2d。將富集培養(yǎng)分離得到的菌株點接到水解圈測定培養(yǎng)基上，35℃下培養(yǎng)3d，在長出菌落的培養(yǎng)基上，覆蓋質(zhì)量濃度為1mg/ml的剛果紅溶液，10～15min后，倒去剛果紅溶液，加入物質(zhì)的量濃度為lmol/l的nacl溶液，15min后倒掉nacl溶液，此時，產(chǎn)生果膠酶的菌落周圍將會出現(xiàn)透明圈。測量篩選菌株的菌落直徑及水解圈直徑，產(chǎn)生明顯水解圈的菌株依次命名為xzf-hq、ctdn-rqb、cts-bq1、nhs-s1、cts-s1、ctdn-hq、yzhs-bq1、yzhs-bq2。

實施例2

本實施例對實施例1得到的脫膠微生物進行了復篩，具體過程如下：

將初篩得到的菌株分別接種到脫膠培養(yǎng)基中，35℃，145rpm，培養(yǎng)3天，同時以不加任何菌的液體解磷培養(yǎng)基作為對照組。培養(yǎng)完成后固液分離，液體用dns法測總還原糖量，固體于65℃下烘干，以30fpu/g底物的纖維素酶負荷酶解72h，dns法檢測酶解液中還原糖產(chǎn)量。結(jié)果如圖1所示，本發(fā)明篩選到的上述8株菌預處理鳳眼蓮后對基質(zhì)的酶解產(chǎn)糖均有促進效果，同時對預處理液中還原糖均有一定程度的消耗，結(jié)果如圖2所示；以預處理中還原糖的消耗為菌株處理中的耗糖量，以酶解液中的糖增量為預處理后的產(chǎn)糖量，作得產(chǎn)糖與耗糖的比值見圖3，其中以cts-bq1比值最大，消耗最少的糖有最大的產(chǎn)出。

實施例3

本實施例對菌株cts-bq1做出鑒定

(1)菌株cts-bq1的菌落形態(tài)及性質(zhì)

菌落為污白色、表面光滑濕潤，邊緣不整齊，革蘭氏陽性菌。

(2)菌株cts-bq1的分子生物學鑒定

采用分子生物學方法對上述篩選得到的cts-bq1菌株進行鑒定，將該菌株的dna使用通用引物27f，1492r通過pcr擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)測序公司進行序列測定，將所測序列與genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行blast比對，結(jié)果表明，該菌株與芽孢桿菌(bacillusaxarquiensis)的相似度為99％以上。結(jié)合形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及16srrna序列分析，該菌株確定為芽孢桿菌(bacillusaxarquiensis)。

實施例4

本實施例提供了不同培養(yǎng)條件對菌株cts-bq1促進鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的影響，具體過程如下：

設計4因素4水平正交試驗探究溫度(25℃、30℃、35℃、40℃)、初始ph值(3、5、7、9)、接種量(2％、4％、6％、8％)及處理時間(1d、3d、5d、7d)對芽孢桿菌cts-bq1預處理鳳眼蓮對基質(zhì)酶解產(chǎn)糖的影響進行實驗。對預處理單因素的不同水平間鳳眼蓮基質(zhì)還原糖產(chǎn)量的差異分析結(jié)果如圖4所示，酶解還原糖產(chǎn)量隨溫度升高有增加的趨勢，不同溫度水平之間無顯著性差異。初始ph為3、5、7時對酶解產(chǎn)糖無顯著影響，而當ph為9時，酶解產(chǎn)糖量較其它水平顯著增加。分析后獲得芽孢桿菌cts-bq1預處理的最佳條件為溫度35、初始ph9、接種量2％、處理時間3d，在該處理條件下酶解產(chǎn)糖量達到142mg/g。

實施例5

本實施例提供了不同生物預處理方法對鳳眼蓮酶解產(chǎn)糖的影響，具體過程如下：

稱取磨碎后的鳳眼蓮鮮樣15g(含水率為92.6％)于250ml錐形瓶中，按固液比1:2.5加入基礎培養(yǎng)液，自然ph，封口后于121℃下滅菌。冷卻至室溫后接種直徑為1cm的黃孢原毛平革菌菌種塊5片，于28℃下培養(yǎng)10天。培養(yǎng)完成后取出接種塊，將樣品洗凈、65℃烘干稱重，測定72h酶解還原糖產(chǎn)量。以不接種黃孢原毛平革菌樣品為對照，每個處理設3個重復。

稱取磨碎后的鳳眼蓮鮮樣15g(含水率為92.6％)于250ml三角瓶中，按固液比1:30加入ph3.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液30ml，封口后于121℃下滅菌。冷卻至室溫后于50℃水浴鍋中預熱，按照20u/g底物的酶負荷加入果膠酶酶液，于125r/min振蕩速度下反應，預處理72h。處理完成后，固液分離，固體物質(zhì)用超純水洗滌至中性，65℃下烘干稱重。以不加酶液為對照處理，每個處理設置3個重復。

稱取磨碎后的鳳眼蓮鮮樣15g(含水率為92.6％)于250ml錐形瓶中，加入鹽溶液150ml，在121℃下滅菌30min，冷卻至室溫。調(diào)整ph為9，按2％的接種量接入cts-bq1菌母液(對照加入2％lb培養(yǎng)液)，在水浴搖床上35℃，145r/min振蕩速度下處理3d。處理完成后，用0.45μm的濾膜進行固液分離，固體洗滌至中性，于65℃下烘干稱重，每個處理3個重復。

三種生物預處理后的鳳眼蓮基質(zhì)酶解產(chǎn)糖效果如圖5所示。3種生物預處理中，果膠酶預處理產(chǎn)糖量最高，cts-bq1次之，黃孢原毛平革菌最低。不同處理及其對照比原料產(chǎn)糖量顯著提高，黃孢原毛平革菌與其對照之間沒有顯著差異，cts-bq1與其對照產(chǎn)糖差異顯著，果膠酶與其對照產(chǎn)糖差異不顯著。cts-bq1預處理后提高效果最為顯著。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

<110>華中農(nóng)業(yè)大學

<120>一株促進鳳眼蓮酶解產(chǎn)糖的芽孢桿菌及其應用

<160>1

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<213>芽孢桿菌（bacillusaxarquiensis）cts-bq1

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