本發(fā)明涉及生物醫(yī)學轉化領域，尤其涉及一種具有非天然氨基酸依賴的調控嵌合抗原受體表達的方法。

技術背景

癌癥作為公共健康問題，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升，癌癥已經(jīng)成為最主要的死亡原因之一。過繼性免疫療法是在傳統(tǒng)手術治療、放射療法和化學療法之外，以提高人體對腫瘤的免疫效應的重要治療方案。過繼性細胞免疫治療（adoptivecellularimmunotherapy，aci）是指將體外激活的自體或異體免疫細胞輸注給患者，以殺傷患者體內的腫瘤細胞，是目前治療惡性腫瘤的重要手段之一，已在多種實體瘤和血液腫瘤的臨床治療中取得較好療效。其中，嵌合抗原受體（chimericantigenreceptor，car）t細胞治療法是近年來發(fā)展非常迅速的一種新的細胞免疫治療技術，通過基因工程技術修飾效應t細胞，克服腫瘤局部免疫抑制微環(huán)境和宿主免疫耐受狀態(tài)，提高了抗腫瘤的靶向性、殺傷性和持久性。

car結構由胞外抗原結合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內信號轉導區(qū)組成。胞外抗原結合區(qū)主要是抗原特異性單克隆抗體單鏈的重鏈（vl）和輕鏈（vh）的可變區(qū)組成，二者以鉸鏈區(qū)連接形成單鏈抗體（singlechainfragmentvarible，scfv）。car通過識別腫瘤抗原的scfv和胞內信號域“免疫受體酪氨酸活化基序（immunoreceptortyrosine-basedactivationmotifs，itam）”在體外進行基因重組，通過基因轉染技術修飾患者的t淋巴細胞，使患者t淋巴細胞表達腫瘤抗原受體，經(jīng)過純化和大規(guī)模擴增修飾后的t淋巴細胞，稱為嵌合抗原受體修飾的t淋巴細胞（car-t）。

car技術臨床上在血液系統(tǒng)腫瘤甚至實體瘤的治療上取得了顯著成績，目前已經(jīng)發(fā)展到第三代。第一代car由單鏈抗體通過跨膜區(qū)域與胞內信號傳導區(qū)（itam）相連，itam通常為cd3ζ或fcεriγ；第二代car的胞內信號傳導區(qū)引入了共刺激分子（costimulatorymolecule，cm），主要為cd28分子；第三代car引入了雙共刺激分子（cm1和cm2），主要為cd28分子加上cd134或cd137等。第一代car-t淋巴細胞研究較多，但是大多數(shù)試驗在細胞擴增、體外存活時間、細胞因子分泌等方面還存在不足，沒有達到預期的臨床效果。研究表明，t淋巴細胞的完全活化有賴于雙信號和細胞因子的作用。其中第一信號為特異性信號，由tcr識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-mhc復合物所啟動；第二信號為協(xié)同刺激信號，通過cd28/b7等重要的共刺激分子，促進il-2合成，并使t淋巴細胞充分活化及免于凋亡。即使t淋巴細胞與抗原接觸，如果沒有協(xié)同刺激信號，細胞難以發(fā)揮正常功能。相應的，僅含有cd3ζ序列的嵌合抗原受體，如果沒有協(xié)同刺激信號，也難以高效激活car-t淋巴細胞。因此，依照t淋巴細胞活化的雙信號學說，第二代和第三代car在嵌合抗原受體上加上如cd28、cd137等共刺激分子，以提高t淋巴細胞的細胞毒性、增殖活性，維持t淋巴細胞應答，延長t淋巴細胞存活時間等。研究證實第二代的car-t淋巴細胞在殺傷腫瘤活性和體內存活時間均優(yōu)于第一代。目前，第三代car-t淋巴細胞臨床應用還比較少，故其安全性和有效性是否就一定優(yōu)于第二代car-t淋巴細胞，以及選擇怎樣的共刺激分子組合，還需要進一步觀察。

雖然car-t靶向治療腫瘤細胞是目前最有前景的癌癥治療方案之一，但是，當太多的信號轉導達到閾值后，強烈引發(fā)的體內免疫應答可能會產(chǎn)生“細胞因子風暴”等重癥，甚至引發(fā)患者死亡。因此，增加car-t細胞的活性“開關”控制是解決car-t毒性問題的重要內容，為car-t在臨床的推廣應用具有重要意義。

技術實現(xiàn)要素：

非天然氨基酸是區(qū)別于20種常見的天然氨基酸的人工合成氨基酸，現(xiàn)已有多種在蛋白合成過程中編碼非天然氨基酸的方法，最常見的是利用無義密碼子uag對其進行編碼。通常情況下蛋白轉錄遇到無義密碼子uag終止信號即終止，但在特定情況下，即含有將非天然氨基酸編碼到對應的uag密碼子的正交性氨酰trna合成酶和trna組合以及非天然氨基酸的情況下，翻譯在uag密碼子處不終止，繼續(xù)通讀直到蛋白翻譯結束。因此，可通過非天然氨基酸的添加與否調控開放閱讀框中間含有uag密碼子的蛋白的完整表達。

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術不足，提供了一種嵌合抗原受體活性調控的解決方案，通過非天然氨基酸的添加與否來調控嵌合抗原受體的表達。

本發(fā)明具體技術方案如下：

一種調控嵌合抗原受體表達的方法，表達體系共表達嵌合抗原受體、將非天然氨基酸編碼到對應的uag密碼子的正交性非天然氨基酸氨酰trna合成酶和trna對，在編碼嵌合抗原受體氨基酸序列中引入無義密碼子uag，用于編碼非天然氨基酸，表達體系缺少該非天然氨基酸時，嵌合抗原受體無法完整合成表達，從而無法激活t細胞免疫反應；當向表達體系加入非天然氨基酸，且表達體系存在正交性非天然氨基酸氨酰trna合成酶正交性trna時，嵌合抗原受體能夠正常合成，t細胞免疫應答通路完整。

本發(fā)明所述的嵌合抗原受體，所以依賴的非天然氨基酸選自人工合成的α-氨基酸，優(yōu)選選自n^ε-boc-l-賴氨酸、n^ε-乙酰-l-賴氨酸、n^ε-烯丙氧羰基-l-賴氨酸、n^ε-煙?；?l-賴氨酸、n^ε-（n-甲基氨茴酰）-l-賴氨酸、n^ε-芐氧羰基-l-賴氨酸中的一種或幾種。

吡咯賴氨酸發(fā)現(xiàn)于產(chǎn)甲烷八疊球菌的甲烷甲基轉移酶，區(qū)別于常見的20種的標準氨基酸，由終止密碼子uag有義編碼寫入蛋白。從吡咯賴氨酸的編碼機制入手，科學家已經(jīng)成功在細菌、哺乳動物細胞、真菌、昆蟲、線蟲等中編碼超過70種人工合成的非天然氨基酸。例如n^ε-boc-l-賴氨酸、（n^ε-芐氧羰基）-l-賴氨酸、n^ε-乙酰-l-賴氨酸（n^ε-acetyl-l-lysine，aclys）、n^ε-烯丙氧羰基-l-賴氨酸（n^ε-allyloxycarbonyl-l-lysine，aloclys）、n^ε-煙?；?l-賴氨酸（n^ε-nicotinoyl-l-lysine，niclys）、n^ε-（n-甲基氨茴酰）-l-賴氨酸（n^ε-(n-me-anthraniloyl)-l-lysine，nmalys）、n^ε-芐氧羰基-l-賴氨酸（n^ε-benzyloxycarbonyl-l-lysine，zlys）等，本發(fā)明優(yōu)選使用吡咯賴氨酸類似物—n^ε-boc-l-賴氨酸。

編碼uag密碼子的非天然氨基酸氨酰trna合成酶能夠將非天然氨基酸及其類似物氨?；阶R別uag密碼子的trna上。與非天然氨基酸氨酰trna合成酶正交配對的trna能夠識別uag密碼子且能夠在配對氨酰trna合成酶的作用下將非天然氨基酸氨活化，形成trna^pyl(pyl-trna^pyl)。本發(fā)明所述非天然氨基酸氨酰trna合成酶源于天然可以編輯吡咯賴氨酸及其類似物的古生菌，包括但不限于metbanosarcinabarkeri，metbanosarcinamazei。優(yōu)選來源于metbanosarcinabarkeri的參與吡咯賴氨酸編碼的氨酰trna合成酶和trna及其突變體。本發(fā)明所述的trna主要指與氨酰trna合成酶同種屬來源的、攜帶吡咯賴氨酸及其類似物參與蛋白編碼合成的trna，包括各種突變體，如u25c突變體增強了反密碼子臂的穩(wěn)定性和吡咯賴氨酸的編碼能力。

本發(fā)明所述方法可以在表達體系共表達嵌合抗原受體、非天然氨基酸氨酰trna合成酶和與該合成酶正交配對的trna。

本發(fā)明所述的方法，所述嵌合抗原受體包含但不限于經(jīng)典的car結構，通常包括抗原結合區(qū)、跨膜結構區(qū)、共刺激信號傳導區(qū)和t細胞信號傳導區(qū)功能結構域。也適用于各種升級型car結構，如icasp9自殺型car、靶向雙陽性細胞的雙car、分別靶向腫瘤細胞和正常細胞的雙car系統(tǒng)：car+icar、應用小分子將cart激活元件與cid融合表達實現(xiàn)精準調控的cart系統(tǒng)。所述各功能結構域可以直接相連，即通過克隆基因時加入酶切位點或者融合pcr技術將這些元件相連接后進行表達，也可以通過連接肽連接各功能結構域。優(yōu)選連接肽是指1~50個富含gly和/或ala和/或ser氨基酸殘基的柔性肽。

本發(fā)明所述的重組嵌合抗原受體，所述抗原結合區(qū)功能結構域選自人抗體、人源化抗體、抗原結合片段或其組合，可以是完整的抗體，fab、fab'、(fab')2、fv片段或者單鏈可變區(qū)片段scfv。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述抗原結合區(qū)功能結構域結合腫瘤抗原。所述腫瘤為前列腺癌、腎細胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病（慢性淋巴細胞性白血病、急性淋巴細胞細胞性白血病、小淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、腺癌、大腸癌、乳腺癌、實體瘤、頭頸部癌、膠質母細胞瘤、神經(jīng)母細胞瘤、肉瘤、轉移性癌、多形性膠質母細胞瘤等。

優(yōu)選的，所述腫瘤抗原選自cd19，cd20，cd22，cd33，cd138，ror1，her2/neu，間皮素，cd33/il3ra，c-met，psma，caix，cea、psca，gd2，糖脂f77，egfrviii，gd-2，fap，fbp，ny-eso-1tcr，magea3tcr或其任意組合。

優(yōu)選的，所述細胞外鉸鏈區(qū)是免疫球蛋白igg鉸鏈區(qū)或cd8蛋白分子的鉸鏈區(qū)或其組合。

所述跨膜區(qū)選自cd3、cd4、cd8或cd28蛋白分子的跨膜區(qū)或其任意組合；

所述共刺激信號傳導區(qū)選自cd27，cd28，cd137(4-1bb)，cd134(ox40)，cd30，cd40，pd-1，lfa-1，cd2，cd7，light，nkg2c，b7-h3蛋白分子的共刺激信號傳導區(qū)、與cd3ζ特異性結合的配體或其任意組合；

所述t細胞信號傳導區(qū)功能結構域選自cd28、cd137、fcεriγ、zap70或cd3ζ蛋白分子的t細胞信號傳導區(qū)中的一種或幾種。t細胞信號傳導區(qū)包含有免疫受體酪氨酸活化基序。

本發(fā)明所述方法選擇在編碼嵌和抗原受體氨基酸序列中引入uag密碼子用于編碼非天然氨基酸，可以選擇功能結構域內的氨基酸密碼子進行突變，優(yōu)選編碼信號肽的氨基酸密碼子，也可以選擇連接肽中的氨基酸密碼子進行突變。

一個優(yōu)選的方案，所述嵌合抗原受體的n端具有信號肽，嵌合抗原受體由信號肽介導表達在質膜上。信號肽的氨基酸密碼子被替換為非天然氨基酸密碼子。所述信號肽分子優(yōu)選cd8α，優(yōu)選在其第一位氨基酸處將原有的甲硫氨酸替換編碼為非天然氨基酸，優(yōu)選的非天然氨基酸為h-lys(boc)-oh（圖2），即aug突變?yōu)殓昝艽a子uag。

本發(fā)明所述方法將目的基因構建在恰當質粒上。通過轉基因修飾的方法修飾t細胞。轉基因修飾方法包括病毒介導的轉化、顯微注射、離子轟擊、基因槍轉化、電穿孔以及其他新興轉化載體，如微環(huán)質粒、睡美人轉座子。本發(fā)明優(yōu)選病毒介導的轉化方法。病毒介導的轉化包括逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒或者慢病毒為載體的表達體系可使用質粒或者病毒作為表達載體，優(yōu)選微環(huán)質粒、逆轉錄病毒或者慢病毒作為表達載體。本發(fā)明更優(yōu)選慢病毒表達載體pultra-hubc-mcs-pgk-puro。

本發(fā)明一個優(yōu)選方案，選擇3代慢病毒表達載體，慢病毒載體3’ltr區(qū)的△u3位置具有克隆位點，本發(fā)明優(yōu)選在該克隆位點插入trna表達盒（expressioncassette），更優(yōu)選插入兩組拷貝。

本發(fā)明所述載體包含嵌合抗原受體開放閱讀框、正交非天然氨基酸氨酰trna合成酶開放閱讀框和正交trna表達盒（expressioncassette）的同時表達，其中嵌合抗原受體和正交非天然氨基酸氨酰trna合成酶為翻譯表達，正交trna為轉錄表達。正交trna表達基因拷貝數(shù)多于2。此三個表達元件以各種方式在慢病毒表達載體整合區(qū)域相互組合進行高效表達。本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，所述的重組嵌合抗原受體的蛋白開放閱讀框和氨酰trna合成酶開放閱讀框同處慢病毒表達載體啟動子后方，優(yōu)選使用“自剪切”的2a蛋白酶將重組嵌合抗原受體開放閱讀框連接在氨酰trna合成酶開放閱讀框后邊，使用2a蛋白酶連接兩蛋白編碼區(qū)，所述的2a連接肽可以是p2a，t2a，e2a，f2a，bmifv2a和bmcpv2a等“自剪切”連接肽，優(yōu)選f2a。

本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，嵌合抗原受體的信號肽分子起始aug密碼子突變?yōu)閡ag密碼子，該重組嵌合抗原受體基因通過f2a“自剪切”基因連接在氨酰trna合成酶基因后面，構成同一啟動子啟動的兩個蛋白基因，兩組攜帶吡咯賴氨酸的trna的轉錄基因分別位于慢病毒載體的常規(guī)克隆位置和3’ltr區(qū)。具體的，載體包括基因表達盒1：啟動子1—正交非天然氨基酸氨酰trna合成酶編碼區(qū)—f2a連接肽編碼區(qū)—嵌合抗原受體編碼區(qū)和基因表達盒2：啟動子2—trna編碼區(qū)。所述啟動子1選自ubc、ef1α、cag、cmv、pgk、mscv、wj6、sv40和galvltr、mscvltr中的一種或幾種，啟動子2選自類別3rna聚合酶iii（type3poliii），包括但不限于hu6、mu6、h1、snr52、7sk、mrp/7-2等，優(yōu)選使用u6啟動子和h1啟動子。

本發(fā)明一個具體的方案，所述啟動子1核苷酸序列如seqid.no：10所示，正交非天然氨基酸氨酰trna合成酶編碼區(qū)核苷酸序列如seqid.no：3所示，氨基酸序列如seqidno：4所示，f2a連接肽編碼區(qū)核苷酸序列如seqid.no：5所示，氨基酸序列如seqidno：6所示，嵌合抗原受體編碼區(qū)核苷酸序列如seqid.no：1所示，氨基酸序列如seqidno：2所示，啟動子2與trna編碼區(qū)形成的trna表達盒（expressioncassette）核苷酸序列如seqid.no：8和seqid.no：9所示。其中，seqid.no：8所示的是u6啟動的trna，seqid.no：9所示的是h1啟動的trna。

本發(fā)明的一個具體方案，表達載體為pultra，重組載體命名為lenti-rs/trna/car，具體為將吡咯賴氨酰trna合成酶與重組嵌合抗原受體基因插入hubc啟動子之后，兩個蛋白用“自剪切”2a連接肽分離連接；將一組由u6啟動子和h1啟動子分別起始的trna插入常規(guī)克隆位點的蛋白基因表達盒（expressioncassette）之后；將另一組u6啟動子和h1啟動子分別起始的trna插入慢病毒載體的3’ltr區(qū)的核苷酸序列如seqid.no：7所示，其中有snabi酶切位點。

本發(fā)明所述方法，具體可包括以下步驟：

1）共表達載體的構建

運用分子克隆方法將正交性非天然氨基酸氨酰trna合成酶和trna編碼基因及起始位置具有uag終止的重組嵌合抗原受體基因克隆入質粒pultra的多克隆位點和長末端重復區(qū)中，構建具有非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體的共表達載體；

2）慢病毒載體的包裝

利用293t細胞包裝獲得帶有非天然氨基酸依賴的car分子的慢病毒載體。所述慢病毒載體為將上述共表達載體與慢病毒包裝必須的結構蛋白表達質粒共轉高效組裝慢病毒的細胞中所得的具有表達重組基因的慢病毒。本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，將上述共表達載體與慢病毒結構蛋白表達載體pmdlg/prre、prsv-rev和pmd2.g共同轉染hek293t細胞培養(yǎng)得到慢病毒載體；

3）慢病毒介導具有非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體轉染細胞

本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：構建目的基因慢病毒包裝載體，包裝慢病毒，慢病毒介導的t細胞轉基因，重組car-t細胞對靶細胞的特異性殺傷活性具有非天然氨基酸依賴性，即僅在環(huán)境具有非天然氨基酸的條件下被激活并釋放細胞因子il-2。

本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明方法相關的非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體的載體、基因表達盒（expressioncassette）、慢病毒載體或細胞，以及含有上述重組嵌合抗原受體基因。所述細胞優(yōu)選選自自體的或轉基因的t細胞、nk細胞、細胞毒性t淋巴細胞或調節(jié)t細胞，記憶性t細胞、雙特異性t細胞、cik細胞。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種非天然氨基酸在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述非天然氨基酸優(yōu)選為n^ε-boc-l-賴氨酸、n^ε-乙酰-l-賴氨酸、n^ε-烯丙氧羰基-l-賴氨酸、n^ε-煙?；?l-賴氨酸、n^ε-（n-甲基氨茴酰）-l-賴氨酸、n^ε-芐氧羰基-l-賴氨酸中的一種或幾種，在car-t治療方案中，非天然氨基酸，特別是n^ε-boc-l-賴氨酸、n^ε-乙酰-l-賴氨酸、n^ε-烯丙氧羰基-l-賴氨酸、n^ε-煙?；?l-賴氨酸、n^ε-（n-甲基氨茴酰）-l-賴氨酸、n^ε-芐氧羰基-l-賴氨酸中的一種或幾種作為藥物調控嵌合抗原受體的表達。

本發(fā)明優(yōu)點：

本發(fā)明提供了一種非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體合成的方法，用以調控t細胞激活通路。該嵌合抗原受體在無非天然氨基酸存在的情況下，在添加非天然氨基酸時，重組嵌合抗原受體同時，非天然氨基酸的插入為進一步修飾t細胞，提供了化學修飾位點。實驗證明，該本發(fā)明所述嵌合抗原受體通過慢病毒載體在t細胞中表達后，t細胞的殺傷毒性受到非天然氨基酸添加與否的控制。本發(fā)明所述的具有非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體保持了car-t的靶向性和殺傷性的同時對此兩種特性增加了控制性，將控制性開關選擇為小分子化合物，為car-t提高臨床治療癌癥的安全性提供了重要途徑。

附圖說明

圖1非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體的慢病毒基因結構示意圖。

圖2非天然氨基酸boclys的化學結構式。

圖3為非天然氨基酸依賴的cd19-carjurkat細胞表達mmbocrs氨酰trna合成酶的westernblot鑒定結果。

圖4為非天然氨基酸依賴的cd19-carjurkat與靶細胞共培養(yǎng)后釋放il-2含量的測定結果。

具體實施方式

以下通過實施例說明本發(fā)明的具體步驟，但不受實施例限制。

在本發(fā)明中所使用的術語，除非另有說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。

下面結合具體實施例并參照數(shù)據(jù)進一步詳細描述本發(fā)明。應理解，該實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規(guī)方法。

下面結合具體實施例對本發(fā)明進一步說明。

下述實例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1、非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體的表達載體設計

本發(fā)明選用目前研究、應用最為廣泛的cd19-car分子作為示例，用質粒pultra為骨架，構建非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體的慢病毒轉染質粒如下（圖1）：

lentiviraltransferplasmids:lenti-rs/trna/car

5’ltr(truncated)-ψ-rre-ubcpromoter-pylrs-2a-cd19car-(u6-trna-h1-trna)*2-3’ltr[△u3(u6-trna-h1-trna)-r-u5]

其中，car分子uag—signalpeptide-scfv-hinge-transmembranedomain-4-1bb-cd3zeta。

質粒構建交由北京奧科生物技術有限責任公司合成并測序確認序列正確。

實施例2、慢病毒載體的包裝

在明膠預包被的15-cm培養(yǎng)皿中接種5×10⁶293t細胞，在37℃，co2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。當匯合度達到70%時，準備質粒轉染。在轉染前2小時，更換新鮮無血清培養(yǎng)基，進行轉染。

從冰箱中取出轉染試劑100μmpei（polyethylenimine），在60℃水浴鍋加熱15min至完全溶解。從冰箱中取出質粒lenti-rs/trna/car、pmdlg/prre、prsv-rev、pmd2.g，室溫溶解。

制備pei/dna復合物：取2mlpbs，加入10μglenti-rs/trna/car、5μgpmdlg/prre、2.5μgprsv-rev、2.5μgpmd2.g，充分吹打混勻后，加入18μl100μmpei，立即吹吸混勻，室溫靜置10min。將靜置后獲得的pei/dna復合物逐滴加入已更換培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，充分混勻。在37℃，co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h后，將含有轉染試劑的培養(yǎng)基換成新鮮的完全培養(yǎng)基。

在轉染后48h收集含有病毒顆粒的細胞培養(yǎng)上清，并添加新的完全培養(yǎng)基。72h再次收集細胞培養(yǎng)上清，兩次收集物通過0.45μm過濾膜過濾。采用amiconultracentrifugalfilters100kda濃縮病毒顆粒，然后分裝保存在-80℃超低溫冰箱。

實施例3、慢病毒介導的細胞轉染

在適量體積的無血清的rpmi1640中加入polybrene至終濃度為8μg/ml，用該培養(yǎng)基重懸離心收集的jurkat細胞，并以5×10⁵/孔的密度接種在6孔板中。根據(jù)病毒滴度與細胞數(shù)目，加入moi=10的慢病毒濃縮液，輕輕搖動培養(yǎng)板以混勻。放置在37℃，5%co2孵育箱培養(yǎng)，16-24h后換成含有10%fbs的rpmi1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

實施例4、氨酰trna合成酶表達鑒定

westernblotanti-flag

通過westernblot鑒定mmbocrs氨酰trna合成酶的表達，由于在氨酰trna合成酶n端偶聯(lián)表達了flag標簽，所以通過anti-flag免疫反應鑒定mmbocrs氨酰trna合成酶的表達。收集2×10⁷細胞后使用1mlripa裂解液（pbs，1%tritonx100，0.5%疊氮化鈉，0.1%十二烷基磺酸鈉）冰上裂解30min。離心取上清加入sds-page上樣緩沖液，煮沸即可上樣。配置濃度為12%的分離膠與常規(guī)濃縮膠制版，凝固后于sds-page電泳緩沖液中電泳。90v恒壓將樣品壓縮到分離膠與濃縮膠的臨界面后更換為恒壓120進行電泳。電泳結束后采用半干轉法進行轉膜，恒壓12v轉膜30min。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時后，用0.1%一抗（antiflag-tagmousemonoclonalantibody、anti-β-actinmousemonoclonalantibody）進行4℃過夜孵育。使用tbst洗膜三次，然后用0.1%二抗（goatanti-mouseigg(h+l)hrpconjugate）室溫孵育1h。再次使用tbst洗膜三次，在膜上滴加辣根過氧化物酶底物，然后曝光。結果如圖3所示，圖中上半部分為anti-flag指示吡咯賴氨酰trna合成酶的條帶，與理論值50.9kda相符。圖中下半部分為anti-β-actin的內參條帶，顯示在~50kda處出現(xiàn)特異性條帶，與mmbocrs氨酰trna合成酶預計大小52kda相符。

實施例5、非天然氨基酸依賴的cd19-carjurkat的細胞殺傷活性分析

本實施例分別展示了非天然氨基酸依賴的嵌合抗原受體在非天然氨基酸添加或不添加情況下與常規(guī)嵌合抗原受體t細胞在與靶細胞共培養(yǎng)的條件下t細胞激活、il-2的分泌水平。

①il-2分泌量檢測

將k562細胞與k562-cd19細胞按照1×10⁵/孔的濃度鋪板于96孔板中，每孔100ul靶細胞。k562-cd19細胞是穩(wěn)定過表達cd19分子的k562細胞株。將非天然氨基酸依賴的cd19-carjurkatt細胞按照靶細胞：效應細胞=1:2的比例，與靶細胞共培養(yǎng)。同時設置非天然氨基酸添加組和非天然氨基酸無添加組。非天然氨基酸添加組加入濃度為1mmol/l的n^ε-boc-l-賴氨酸（h-lys(boc)-oh），h-lys(boc)-oh購自瑞士bachem公司。在37℃，5%co2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)18-20h后，分別收集細胞培養(yǎng)懸液經(jīng)過離心收取上清，使用人il-2elisakit檢測il-2含量，具體步驟參見人il-2elisakit使用說明書。

具體結果如圖4所示，結果表明，在非天然氨基酸缺失的情況下，本發(fā)明所述的抗cd19的重組嵌合抗原受體修飾的t細胞白介素分泌量明顯低于常規(guī)重組嵌合抗原受體修飾的t細胞。而在添加非天然氨基酸的情況下，非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體修飾的t細胞表現(xiàn)出il-2分泌量的顯著性升高。此結果表明，在非天然氨基酸依賴的重組嵌合抗原受體修飾的t細胞中，t細胞的激活依賴于非天然氨基酸的添加。

sequencelisting

<110>勝武（北京）生物科技有限公司

<120>一種光誘導二聚體型嵌合抗原受體

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