本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)gshb基因提高龍葵毛狀根鎘富集的方法。

背景技術(shù)：

龍葵是茄屬茄科一年生草本植物，幾乎全中國都有分布，廣泛分布于亞、歐、美洲的溫帶至熱帶地區(qū)。目前，世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的重金屬超富集植物有400多種，在已發(fā)現(xiàn)的超富集植物中，cd超富集植物總體上很少，目前僅報道遏藍菜(thlaspiarvensel)、寶山堇菜(violabaoshanensis)、油菜(brassicacampestrisl.)、東南景天(sedumalfredii)、龍葵(solanumnigruml.)、商陸(phytolaccaacinosaroxb)、紅菾菜(betavulgarisvar.cicla)等cd超富集植物。在這些植物中，遏藍菜是研究最多的，但遏藍菜對cd的富集不具備特異性。龍葵因其分布廣泛、生命力強、對cd的富集更專一等優(yōu)勢得到越來越多的關(guān)注。

隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展和城市人口的劇增，環(huán)境污染問題與日劇增，環(huán)境問題越來越受到人們的重視，污染環(huán)境的修復(fù)方法也成為全球關(guān)注的熱點。在各種各樣的環(huán)境污染治理技術(shù)中，生物修復(fù)以其處理費用低、操作簡單、處理效果好、不易造成二次污染等特點而受到越來越多的關(guān)注。生物修復(fù)至今僅有30多年的研究歷史，但是20世紀80年代以后，一些生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)開始在污染環(huán)境治理中推廣應(yīng)用并取得了良好的效果。轉(zhuǎn)基因植物由于具有更好的耐受力和積累量，可以得到更好的土壤修復(fù)效果。近年來，利用轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)污染土壤的生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)成為研究的熱點(張玉秀,柴團耀,g.rardburkard.植物耐重金屬機理研究進展[j].植物學(xué)報,1999,41(5):453-457.)。

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得cd超富集植物龍葵毛狀根株系，不僅在研究龍葵富集重金屬cd代謝途徑和分子調(diào)控機制方面具有重要的理論意義，并且在將來大規(guī)模種植龍葵富集土壤中重金屬cd方面具有重要的應(yīng)用前景和價值。盡管目前已有利用毛狀根為材料開展對重金屬富集的相關(guān)研究，但并無將gshb基因轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)出能超富集cd的轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的研究。

因此，需要提供一種通過轉(zhuǎn)gshb基因提高龍葵毛狀根的cd富集能力的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過轉(zhuǎn)gshb基因?qū)崿F(xiàn)植物龍葵的毛狀根cd超富集的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明一種轉(zhuǎn)gshb基因提高龍葵毛狀根cd富集的方法，包括以下步驟：

(1)制備龍葵外植體；

(2)制備轉(zhuǎn)gshb基因侵染菌液：將gshb基因與真核表達載體pbi121-gfp連接，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌a4感受態(tài)細胞；涂平板，挑取陽性克隆，用yma液體培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)gshb基因侵染菌液；

(3)共培養(yǎng)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根：將轉(zhuǎn)gshb基因侵染菌液與龍葵無菌葉片進行共培養(yǎng)；

(4)除菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)后的龍葵葉片轉(zhuǎn)移到已濕潤的濾紙上于28℃弱散射光培養(yǎng)2d，隨后轉(zhuǎn)入含有500mg/l的頭孢噻肟鈉的ms培養(yǎng)基上進行除菌培養(yǎng)，一周后轉(zhuǎn)到不含頭孢噻肟鈉的ms固體培養(yǎng)基上，一個月后龍葵葉片愈傷處會長出的細長毛狀根；

(5)毛狀根液體培養(yǎng)基的擴大培養(yǎng)：將固體培養(yǎng)基中的毛狀根轉(zhuǎn)入ms液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)；

(6)轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的檢測：所述檢測包括分子鑒定和熒光檢測；其中，所述分子鑒定是通過提取毛狀根的dna，pcr法檢測農(nóng)桿菌ri質(zhì)粒中的rolb基因和pbi121-gshb-gfp融合基因，判斷是否成功獲得轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根；所述熒光檢測是通過綠色熒光蛋白檢測，驗證是否成功獲得轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根。

進一步，步驟(1)所述龍葵外植體是取龍葵種子滅菌后接種于ms固體培養(yǎng)基，28℃光照培養(yǎng)，當(dāng)龍葵無菌苗長出3到4對真葉后，剪取無菌葉片作為誘導(dǎo)毛狀根的龍葵外植體；

進一步，步驟(2)中所述擴增培養(yǎng)是在28℃，150-200rpm搖床中擴增至od600＝0.6。

進一步，步驟(5)中所述擴大培養(yǎng)為28℃，100-110rpm搖床進行培養(yǎng)。

進一步，步驟(6)中所述熒光檢測的熒光顯微鏡的參數(shù)是波長487nm、曝光時間583ms。

谷胱甘肽在緩解植物的重金屬損傷中起著重要的作用，谷胱甘肽不僅是谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的底物，而且是脫氫抗壞血酸的還原物質(zhì)，能夠中和環(huán)境中的有毒物質(zhì)。除此之外，谷胱甘肽是植物絡(luò)合素的前體，植物絡(luò)合素能夠與重金屬離子形成復(fù)合物并貯藏至液泡中，起到對重金屬離子進行隔離的作用從而降低重金屬對植物的損傷。谷胱甘肽的合成由半胱氨酸和谷氨酸經(jīng)過兩步酶催化反應(yīng)所得，第一步是在γ-谷胱酰胺半胱氨酸合成酶(γ-ecs)的催化下生成γ-谷胱酰胺半胱氨酸。第二步是γ-谷胱酰胺半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶的催化下與甘氨酸反應(yīng)生成谷胱甘肽。在沒有重金屬離子的脅迫下谷胱甘肽合成的限速步驟是谷氨酸和半胱氨酸在γ-谷胱酰胺半胱氨酸合成酶的催化下合成γ-谷胱酰胺半胱氨酸，然而在重金屬離子脅迫的情況下谷胱甘肽合成的限速步驟是γ-谷胱酰胺半胱氨酸和甘氨酸在谷胱甘肽合成酶的催化下生成谷胱甘肽。本發(fā)明轉(zhuǎn)入的gshb基因有助于提高谷胱甘肽的含量，因此能夠提高龍葵對重金屬的耐受和富集能力，對由上述方法得到的毛狀根毛狀根富集cd能力進行測定，表明其所能富集的cd的含量最高可達野生龍葵植株的2倍。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明首次將谷胱甘肽合成酶gshb基因轉(zhuǎn)入載體pbi121-gfp，將該載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌后再轉(zhuǎn)入龍葵無菌苗，誘導(dǎo)出超富集cd的轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根系，該根系易于繁殖、生長速度快，所能富集的cd的含量最高可達野生龍葵毛狀根的2倍。

(2)本發(fā)明不僅可以解決龍葵植株栽培周期長、受氣候及地理條件制約等問題，并且可高效大量地富集重金屬cd。超富集cd的轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根將為利用龍葵毛狀根富集重金屬cd提供材料支撐，具有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1示出野生型a4侵染龍葵葉片21d生根結(jié)果。

圖2示出轉(zhuǎn)gshb基因a4侵染龍葵葉片21d生根結(jié)果。

圖3示出野生型龍葵毛狀根接種21d后的狀態(tài)。

圖4示出轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根接種21d后的狀態(tài)。

圖5示出轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根與野生型毛狀根中rolb基因的pcr電泳圖；m：dl2000；1：a4的ri質(zhì)粒；2：對照；3：野生型龍葵毛狀根；4：轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根。

圖6示出轉(zhuǎn)gshb基因和野生型龍葵毛狀根gshb基因的pcr擴增：：dl2000；1：pbi121-gshb-gfp質(zhì)粒；2：轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根；3：野生型龍葵毛狀根。

圖7示出野生型龍葵毛狀根的熒光檢測。

圖8示出轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的熒光檢測。

圖9示出野生型龍葵毛狀根在含cd(100μm)的ms液體培養(yǎng)基中20d后的狀態(tài)。

圖10示出轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根在含cd(100μm)的ms液體培養(yǎng)基中20d后的狀態(tài)。

圖11示出轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根cd富集能力的比較；標(biāo)注的小寫字母不同代表統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異，小寫字母相同代表無顯著差異(p<0.05)。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護范圍。

培養(yǎng)基的配置

ms培養(yǎng)基配制：

1、100×鐵鹽母液：稱取feso4·7h2o1.39g和na2edta1.865g溶入500ml的蒸餾水。

2、有機物質(zhì)母液配制：

1000×甘氨酸母液：稱取甘氨酸0.2g溶入100ml的蒸餾水。

1000×煙酸母液：稱取煙酸0.05g溶入100ml蒸餾水。

1000×鹽酸硫胺素(維生素b1)母液：稱取鹽酸硫胺素0.05g溶入100ml蒸餾水中。

1000×鹽酸吡哆醇(維生素b6)母液：稱取鹽酸吡哆醇0.01g溶入100ml蒸餾水中。

100×肌醇母液：稱取肌醇10.0g溶于1000ml蒸餾水中。

3、1000×微量元素母液配制：稱取h3bo30.62g、mnso4·1h2o1.69g、znso4·7h2o0.86g、ki0.083g、na2moo4·2h2o0.25g、cocl2·6h2o0.025g、cuso4·5h2o0.025g溶于1000ml蒸餾水中。

4、10×大量元素母液配制：稱取nh4no316.5g、kno319.0g、mgso4·7h2o3.7g、kh2po41.7g溶于1000ml蒸餾水中。

5、100×cacl2母液配制：稱取cacl2·2h2o44.0g溶于1000ml的蒸餾水中。

每升ms液體培養(yǎng)基加入30.0g蔗糖和所需的母液，調(diào)ph至5.8后高壓滅菌，ms固體培養(yǎng)基，則需再加入10.0g瓊脂粉。

發(fā)根農(nóng)桿菌a4的yma培養(yǎng)基：

配制1lyma培養(yǎng)基所需物品：k2hpo40.25g、kh2po40.25g、nacl0.1gmgso4·7h2o0.2g、甘露醇10.0g、酵母提取物0.8g(若配固體培養(yǎng)基需再加入瓊脂粉10.0g，ph7.2)。

實施例1轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的誘導(dǎo)

1、龍葵無菌苗培養(yǎng)：選取飽滿的龍葵種子，在超凈工作臺內(nèi)，將種子放入紗布中用皮筋包扎好，放入無菌燒杯中用無菌水沖洗3～5遍；75％乙醇浸泡5min，無菌水沖洗3遍；最后浸泡在含有2％有效成分的次氯酸鈉溶液5min，無菌水沖洗3遍。接種于ms固體培養(yǎng)基上，每皿約30粒種子，28℃光照培養(yǎng)3周后，當(dāng)龍葵無菌苗長出3到4對真葉后，剪取無菌葉片作為誘導(dǎo)毛狀根的外植體。

2、過表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)gshb基因侵染菌液的制備：通過ncbi查詢gshb基因的cds編碼序列(sequenceid:gb|cp010445.1|)，將查詢獲得的序列于上海生工公司優(yōu)化后并合成。根據(jù)此序列設(shè)計gshb-f：5＇-gctctagaatgatcaagctcggcatc-3＇(如序列表sedidno.1所示)；gshb-r：5＇-cccccgggttctgctgctgtaaacgtgc-3＇(如序列表sedidno.2所示)，高保真酶擴增目的片段；將獲得的目的片段切膠并回收，并與pbi121-gfp真核表達載體(pbi121中插入增強型綠色熒光蛋白基因gfp序列，代替pbi121中的標(biāo)記基因gus，以方便后續(xù)轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根的檢測驗證載體連接)構(gòu)建pbi121-gshb-gfp質(zhì)粒；將pbi121-gshb-gfp質(zhì)粒用熱激法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌a4感受態(tài)細胞；挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)入含有卡那抗性的yma液體培養(yǎng)基中，28℃、150rpm的搖床中擴增至od600＝0.6時，可作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。

3、共培養(yǎng)法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根：將菌液和龍葵葉片(0.5cm×0.5cm)放置于100ml錐形瓶中共培養(yǎng)20min，同時以野生a4農(nóng)桿菌感染的外植體作為對照。

實施例2轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的培養(yǎng)

(1)毛狀根的除菌培養(yǎng)：將共培養(yǎng)的龍葵葉片轉(zhuǎn)移到濕潤的濾紙上于28℃弱散射光培養(yǎng)兩天后，轉(zhuǎn)入含有500mg/l的頭孢噻肟鈉的ms培養(yǎng)基中進行除菌培養(yǎng)，一周后轉(zhuǎn)接到不含頭孢噻肟鈉的ms固體培養(yǎng)基中，一個月后龍葵葉片愈傷處會長出多條橘黃色的細長毛狀根，圖1所示是野生型a4農(nóng)桿菌侵染龍葵葉片誘導(dǎo)生成的野生型龍葵毛狀根，圖2所示的是轉(zhuǎn)gshb基因a4農(nóng)桿菌侵染龍葵葉片誘導(dǎo)生成的轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根。

(2)毛狀根液體培養(yǎng)基的擴大培養(yǎng)：將固體培養(yǎng)基中的毛狀根轉(zhuǎn)入ms液體培養(yǎng)基中，28℃、100rpm、搖床中擴大培養(yǎng)，圖3所示是野生型龍葵毛狀根接種到液體ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)21d后的狀態(tài)，圖4所示是轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根接種到液體ms培養(yǎng)基中培養(yǎng)21d后的狀態(tài)。

實施例3轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的分子鑒定

(1)取一定數(shù)量的毛狀根提取其dna，設(shè)計檢測rolb(423bp)與pbi121-gshb-gfp(963bp)融合基因的引物分別為：

rolb-f：5'-tactgcagcaggcttcatgac-3'(如序列表sedidno.3所示)，

rolb-r：5'-gctttcccgaccagagactg-3'(如序列表sedidno.4所示)；

gshb-f：5'-gctctagaatgatcaagctcggcatc-3'(如序列表sedidno.1所示)，

gshb-r：5'-cccccgggttctgctgctgtaaacgtgc-3'(如序列表sedidno.2所示)；

用pcr方法擴增，擴增產(chǎn)物測序比對，檢測毛狀根中是否存在農(nóng)桿菌ri質(zhì)粒中的rolb基因。圖5電泳圖結(jié)果顯示野生型和轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根均在423bp處有條帶，說明所獲的兩種毛狀根中均有rolb基因；并且圖6電泳圖結(jié)果顯示只有轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根在963bp處有條帶，表明成功獲得轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根。

(2)轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根的熒光檢測：取野生型和轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根進行熒光檢測，圖7顯示野生型毛狀根在熒光顯微鏡下不能觀察到綠色熒光，而圖8顯示轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根出現(xiàn)熒光，進一步表明成功獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。實施例4龍葵轉(zhuǎn)基因毛狀根富集cd能力的測定

(1)將在ms液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d的轉(zhuǎn)基因毛狀根和野生型毛狀根，轉(zhuǎn)到含0、25、50、75、100μmcdcl2的ms培養(yǎng)基中進行cd刺激，在28℃，150rpm的搖床中培養(yǎng)20d后檢測毛狀根中的cd含量。圖9和圖10分別給出了是野生型毛狀根和轉(zhuǎn)基因毛狀根在含100μmcdcl2的ms培養(yǎng)基中生長20d后的狀態(tài)。

(2)將毛狀根烘干后研磨成粉末，稱取0.1g，與2ml硝酸混合于消解罐中室溫靜置12h，隨后置于150℃的烘箱內(nèi)加熱2h，冷卻至室溫后用超純水定容到50ml即可進行icp-ms檢測。轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根與野生型龍葵毛狀根cd富集能力的測定結(jié)果如圖11所示，從圖中可以看出：轉(zhuǎn)gshb基因毛狀根中所能富集的cd含量最高可達野生龍葵毛狀根的2倍，說明轉(zhuǎn)gshb基因龍葵毛狀根具有更強的cd富集能力，轉(zhuǎn)入的gshb基因提高了龍葵毛狀根對cd富集的能力，后續(xù)可以將這一轉(zhuǎn)基因毛狀根再生成轉(zhuǎn)基因龍葵植物應(yīng)用于cd污染土壤的修復(fù)。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。

sequencelisting

<110>北京交通大學(xué)

<120>轉(zhuǎn)gshb基因提高龍葵毛狀根cd富集的方法

<130>jlc17i0154e

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工合成gshb-f引物

<400>1

gctctagaatgatcaagctcggcatc26

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工合成gshb-r引物

<400>2

cccccgggttctgctgctgtaaacgtgc28

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工合成rolb-f引物

<400>3

tactgcagcaggcttcatgac21

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工合成rolb-r引物

<400>4

gctttcccgaccagagactg20