本發(fā)明涉及一種金銀花克隆ljhqt基因。屬于基因克隆技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

hqt基因產(chǎn)物是綠原酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。2008年，rommens等對(duì)馬鈴薯塊莖特異表達(dá)經(jīng)過修改的myb轉(zhuǎn)錄因子基因stmtf1m，激活了苯丙醇生物合成途徑，使綠原酸的含量大幅提高，并同時(shí)檢測到奎尼酸-羥肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶基因(hqt)的表達(dá)顯著上升。carlaclé等將番茄在溫室內(nèi)培養(yǎng)，并對(duì)其hqt基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，hqt高表達(dá)的番茄葉綠原酸含量最高，而野生型次之，hqt基因沉默的番茄葉綠原酸含量最低。他們發(fā)現(xiàn)hqt高表達(dá)的番茄葉綠原酸含量是野生型的2.5倍，并最終得出了hqt對(duì)番茄葉中綠原酸含量的積累起到關(guān)鍵作用的結(jié)論，這也與niggeweg等的結(jié)論一致。再一次證實(shí)了hqt的表達(dá)量與番茄中綠原酸的含量直接相關(guān)。

綜上所述，金銀花中高含量的綠原酸及其同屬植物中hqt的發(fā)現(xiàn)，以及hqt與多種植物綠原酸的生物合成密切相關(guān)，hqt表達(dá)量的增減往往伴隨著綠原酸含量的升降這一事實(shí)，預(yù)示著金銀花植物體內(nèi)極有可能存在hqt基因的表達(dá)，并且它與金銀花中綠原酸的積累密切相關(guān)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種金銀花克隆ljhqt基因。

本發(fā)明還提供了上述基因的克隆方法，利用上述基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了上述基因的用途。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

金銀花克隆ljhqt基因，其核苷酸序列如seqidno.1所示，編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。

上述基因的克隆方法，包括以下步驟：

(1)提取金銀花rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna；

(2)參照其他植物hqt保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，以cdna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得核心序列；簡并引物如seqidno.3和seqidno.4所示；

(3)通過race方法從核心序列克隆全長cdna序列，即為ljhqt基因。

簡并引物的序列如下：

p1：5'-gacthtgcytaarghtngc-3'，如seqidno.3所示；

p2：5'-cachccaatcahtccytcnccngt-3'，如seqidno.4所示；

其中，n代表任意一種核苷酸；r代表a或g；y代表c或t；h代表a或c或t。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)中，rna的提取對(duì)象為金銀花幼葉片。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)中，所述其他植物為馬鈴薯、番茄、煙草或咖啡。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)中pcr擴(kuò)增使用extaq酶，擴(kuò)增程序如下：95℃變性4分鐘后，依次進(jìn)行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸15分鐘。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)中所得核心序列為860bp。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(3)所得ljhqt基因全長1,621bp，其中包括1,320bp的編碼區(qū)、209bp的5’非翻譯區(qū)和一個(gè)包含18個(gè)多聚腺苷酸尾的92bp3’非翻譯區(qū)，與其他植物hqt的同源性介于42～71％之間。

一種利用上述基因構(gòu)建的植物表達(dá)載體。

作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，所述植物表達(dá)載體是利用gateway技術(shù)構(gòu)建得到的。

上述基因的用途，利用上述基因構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得抗病性轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明從金銀花中克隆?；D(zhuǎn)移酶基因ljhqt，與其他植物hqt的同源性介于42～71％之間。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，ljhqt對(duì)奎尼酸的親和力更高。在香豆酰輔酶a飽和時(shí)，ljhqt對(duì)奎尼酸的親和力(km＝77±45μmol/l)比莽草酸(km＝5579±371μmol/l)高70倍。ljhqt能顯著提高轉(zhuǎn)基因株系中綠原酸含量，有效提高轉(zhuǎn)基因植株的抗病性。

附圖說明

圖1是金銀花ljhqt與其他植物hqt的序列比對(duì)(cae46932，煙草；abk79689，刺棘薊；abo77956，咖啡；aek80405，金銀花)；

圖2是ljhqt系統(tǒng)發(fā)育分析；

圖3是ljhqt的southernblot雜交分析；

圖4a～圖4c是ljhqt原核表達(dá)載體的構(gòu)建及分子檢測；

圖5是sds-page分析金銀花ljhqt誘導(dǎo)表達(dá)及純化回收情況；

圖6是ljhqt的酶促產(chǎn)物hplc分析；

圖7是ljhqt植物過表達(dá)載體的構(gòu)建；

圖8是ljhqt過表達(dá)擬南芥的篩選及pcr分析；

圖9是轉(zhuǎn)基因擬南芥的rt-pcr分析；

圖10a是綠原酸(cga)含量分析，圖10b是與野生型(wildtype)擬南芥相比，過表達(dá)ljhqt的轉(zhuǎn)基因株系綠原酸水平hplc圖譜，圖10c是綠原酸提高了擬南芥的抗病性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

1、ljhqt基因的分離

從金銀花葉中提取總rna，反轉(zhuǎn)錄獲得cdna。參照其它植物hqt保守區(qū)設(shè)計(jì)簡并引物，以cdna為模板，使用extaq酶(購自takara)成功擴(kuò)增出ljhqt的核心片段。引物的設(shè)計(jì)參照“保守-簡并雜合寡核苷酸引物”(codehop)策略，使用blockmaker程序(http://blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/make_blocks.html)完成簡并引物設(shè)計(jì)：

p1：5'-gacthtgcytaarghtngc-3'，如seqidno.3所示；

p2：5'-cachccaatcahtccytcnccngt-3'，如seqidno.4所示；

其中，n代表任意一種核苷酸；r代表a或g；y代表c或t；h代表a或c或t。

pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性4分鐘后，依次進(jìn)行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸15分鐘。為了獲得全長基因，根據(jù)已獲得的ljhqt核心序列的5’端和3’端各設(shè)計(jì)3個(gè)基因特異引物，使用race技術(shù)獲得該基因的兩端側(cè)翼序列。

2、異源表達(dá)和蛋白純化

重組質(zhì)粒經(jīng)過測序驗(yàn)證后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌e.colibl21-rosetta(de3)菌株(購自transgenbiotech)中。含有重組質(zhì)粒的菌株接入10ml含有卡那霉素(50μgml^-1)和氯霉素(34μgml^-1)的lb培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，次日稀釋100倍接入200mllb培養(yǎng)基中于37℃、200rpm繼續(xù)培養(yǎng)至od600為0.6～0.8時(shí)，添加終濃度為1mmol/l的iptg，降溫至30℃，6小時(shí)后，通過離心收集菌體并重懸于3ml0.1mol/l磷酸鉀緩沖液(ph7.5)，超聲波冰上破碎菌體。

冰上破碎的菌體勻漿于4℃10,000g下離心10分鐘。上清通過鎳瓊膠糖凝膠柱(novagen).用含有0.5mol/lnacl和40mmol/l咪唑的0.1mol/l磷酸鉀緩沖液洗滌鎳瓊膠糖凝膠柱三次后，重組目標(biāo)蛋白用含有400mmol/l咪唑的0.1mol/l磷酸鉀緩沖液洗滌洗脫。為了長期保持重組蛋白活性，洗脫緩沖液通過pd-10柱(amershampharmaciabiotech,uppsala,sweden)，用含10％體積濃度甘油的0.1mol/ltris–hcl(ph7.5)置換緩沖液重新洗脫，洗脫的重組蛋白保存于–80℃。重組蛋白的純化效率用sds-page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測。bradford法測定蛋白濃度。

3、體外酶促反應(yīng)及產(chǎn)物分析

20μl的反應(yīng)體系中含有100mmol/l磷酸鉀緩沖液(ph7.5)，1mmol/l二硫蘇糖醇，1μg重組ljhqt蛋白，0.1～5mmol/l的不同底物(香豆酰輔酶a，咖啡酰輔酶a，奎尼酸和莽草酸)。反應(yīng)自加入酶蛋白開始計(jì)時(shí)，30℃條件下反應(yīng)30分鐘，加入20μl乙腈/hcl(體積比99∶1)終止反應(yīng)。hplc檢測條件：c18column(lichrocart125-4,merck)，流動(dòng)相a：90％h2o，9.9％ch3cn0.1％hcooh；b：80％ch3cn，19.9％h2o，0.1％ch3cooh(流動(dòng)相各組分占比均為體積百分比)。

4、動(dòng)力學(xué)分析

重組蛋白動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定是在一個(gè)底物濃度飽和的情況下，用另一個(gè)底物介于其km的0.2～6.0范圍內(nèi)的5個(gè)濃度值進(jìn)行計(jì)算獲得的。實(shí)驗(yàn)使用上述標(biāo)準(zhǔn)的250μl0.1mol/l磷酸鉀緩沖液反應(yīng)體系，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。常數(shù)參數(shù)的測定在35℃和ph6.5條件下完成。km和kcat值由lineweaver–burke曲線的結(jié)果得出。

5、southernblont印記雜交分析

(1)使用ecori,ecorv和hindiii分別酶切10μg基因組dna。

(2)配制0.7％的瓊脂糖凝膠，將完全酶解的基因組dna于4℃解凍后，70℃開蓋溫育5分鐘，取基因組dna30μl、10倍loadingbuffer10μl于一新的ep管中充分混勻后和dnamarker一并點(diǎn)入凝膠電泳孔中，在tae電泳緩沖液中，5v/cm電壓下電泳4小時(shí)。電泳后，將danmarker部位的凝膠切下放人溴化乙錠中染色。

(3)切除凝膠無用部分，將凝膠左上角切掉，作為指示凝膠方位標(biāo)記，蒸餾水淋洗后，置于0.2mol/lhcl中搖動(dòng)漂洗2分鐘，然后用去離子水漂洗；

(4)將凝膠置于數(shù)倍體積的1.5mol/lnacl和0.5mol/lnaoh中浸泡45min，期間溫和地振搖幾次，使dna變性；

(5)用去離子水漂洗凝膠，然后將凝膠浸泡于數(shù)倍體積的1mol/ltris-hcl(ph7.4)、1.5mol/lnacl中，于室溫下溫和地不斷振搖，使之中和。更換中和液，將凝膠繼續(xù)浸泡15min；

(6)當(dāng)凝膠仍浸于中和液時(shí)，用一張濾紙包裹一塊玻璃板做成一凝膠平臺(tái)，放入一個(gè)大玻璃皿內(nèi)，倒入轉(zhuǎn)移緩沖液10×ssc，使液面略低于平臺(tái)表面，將濾紙兩端浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，當(dāng)平臺(tái)上方的濾紙濕透后，用玻棒趕走濾紙和玻璃板之間的所有氣泡；

(7)準(zhǔn)備尼龍膜：用一干凈刀子裁制一張長度和寬度均比凝膠約大1mm的膜，切去膜的一角與凝膠的切角相對(duì)應(yīng)，將膜漂浮于一盤去離子水中，直至由下而上完全濕潤，然后將其浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中至少5min；

(8)從中和液中取出凝膠，將凝膠翻轉(zhuǎn)使其背面向上，將凝膠放于平臺(tái)上濕潤的濾紙中央，用玻棒趕走凝膠和濾紙間的氣泡；

(9)用保鮮膜圍繞凝膠周邊，在凝膠上方放置濕潤的尼龍膜，并使兩者的切角相重疊，用玻棒趕走尼龍膜與凝膠之間的氣泡；

(10)用轉(zhuǎn)移緩沖液濕潤兩張與凝膠同樣大小的濾紙，濕潤的濾紙放在尼龍膜上方，用玻棒趕走濾紙和尼龍膜之間的氣泡；

(11)放置高度為6cm，面積略小于濾紙的吸水紙于濾紙上方，并在吸水紙上方放一塊玻璃板，然后用一500g的重物壓實(shí)；

(12)轉(zhuǎn)移10h，定時(shí)更換吸水紙；

(13)轉(zhuǎn)好的膜于2xssc溶液中潤洗數(shù)分鐘。置兩層濾紙之間，于室溫晾干，80℃1h烘烤固定后，將膜用保鮮膜包裹，-20℃放置保存待用或直接用于分子雜交。

(14)使用地高辛標(biāo)記一個(gè)ljhqt片斷(364bp)作為探針，該片斷包括啟動(dòng)子和部分5’端編碼區(qū)。用于擴(kuò)增該片斷的引物如下：

正向引物：5'-gtacacaacagagagataactgtc-3'，如seqidno.5所示；

反向引物：5'-ggtcatgtgctcgctgttggtg-3'，如seqidno.6所示。

取15μlpcr擴(kuò)增回收產(chǎn)物在pcr儀中99℃變性10min，迅速投入冰水浴中驟冷5min；稍離心后，加入以下成分：六聚體隨機(jī)引物2.0μl，dntp標(biāo)記混合物2.0μl，klenow酶1.0μl，37℃溫浴20h以上。65℃加熱10min終止反應(yīng)，于-20℃保存待用。

(15)洗膜和結(jié)果檢測

雜交結(jié)束后，用100ml2倍漂洗緩沖液(2×ssc，0.1％sds)于50℃洗膜2次，每次5分鐘；用100ml0.5倍漂洗緩沖液(0.5×ssc，0.1％sds)于68℃洗膜2次，每次15分鐘；用100ml緩沖液1(100mmol/l馬來酸，150mmol/lnacl，ph7.5)于37℃洗膜2次，每次5分鐘；室溫下在20ml緩沖液2(100mmol/l馬來酸，150mmol/lnacl，1％(m/v)封閉液，ph7.5)浸膜30分鐘，并在振蕩器上進(jìn)行；室溫下在20ml抗體復(fù)合物溶液(每次使用前將anti—digoxigenin—ap在10000rpm離心5min，取上清做1∶5000倍稀釋，用buffer2稀釋)中溫育30min，并在振蕩器上進(jìn)行；倒掉上述溶液，室溫下用100ml緩沖液1洗膜2次，每次15分鐘；倒掉緩沖液1，室溫下在20ml緩沖液3(100mmol/ltris-cl，100mmol/lnacl，50mmol/lmgcl2ph9.5)中平衡5分鐘；倒掉緩沖液3，并將混有200μl的nbt/bcip的10ml緩沖液3倒入裝有膜的器皿中，避光數(shù)小時(shí)后，可見到雜交帶。用50ml蒸餾水洗膜5min終止顯色反應(yīng)。觀察結(jié)果。

6、系統(tǒng)發(fā)育分析

19個(gè)植物?；D(zhuǎn)移酶基因的氨基酸序列使用clustalxversion1.81(thompsonetal.,1997)進(jìn)行比對(duì)。比對(duì)結(jié)果運(yùn)用phylip軟件包進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，自展值設(shè)定為100。最終的發(fā)育樹使用treeviewwin32(page,1996)軟件觀察分析。

7、花侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥

(7-1)擬南芥(col-0野生型)生長至抽苔1cm時(shí)，將頂端減掉以誘導(dǎo)側(cè)生花序的生成；

(7-2)在轉(zhuǎn)化前一天，取1ml活化過的含有表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌gv3101加到含相應(yīng)抗生素及50μg/ml利福平的40mlyep培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至od600約為1.0～1.2；

(7-3)室溫，4200rpm，離心10分鐘，收集菌體，用浸染液(5w.t.％蔗糖，0.05w.t.％silwetl-77)重懸菌體，使od600約為0.8；

(7-4)用移液器將農(nóng)桿菌滴到花序上進(jìn)行浸染，待所有花序都被侵染后，將擬南芥放入真空干燥器中抽真空1分鐘；

(7-5)用保鮮袋覆蓋花序，置于20～22℃避光培養(yǎng)一天剪開頂部露出花序，再培養(yǎng)一天后揭去保鮮袋，培養(yǎng)至種子成熟。

8、轉(zhuǎn)基因植株的篩選

將適量待滅菌的擬南芥中子放入1.5ml離心管中，加入1ml體積濃度75％的乙醇(含有0.03％體積比的tritonx-100)震蕩消毒1分鐘，再用體積濃度70％的乙醇震蕩消毒1分鐘(兩次)，最后用吸頭將種子吸到無菌濾紙上吹干，然后用無菌的牙簽將其點(diǎn)入培養(yǎng)基中。

對(duì)收獲的t0代種子進(jìn)行表面消毒，然后均勻涂布于1/2ms平板上(含卡那霉素50mg.l^-1)。春化處理3天后移入人工氣候室生長。萌發(fā)約10天，子葉深綠色的植株為轉(zhuǎn)基因植株，而子葉發(fā)淺綠甚至黃化的植株為非轉(zhuǎn)基因植株。將轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)入土中生長直至收獲得到t1代轉(zhuǎn)基因種子，t1代植株單株收種子，每株收取的種子繼續(xù)篩選，將后代分離比為3∶1(陽性：陰性)的陽性植株移栽后生長至收獲t2代轉(zhuǎn)基因種子，單株收種后，每株收取的種子經(jīng)篩選可以得到純系t2代轉(zhuǎn)基因種子。

9、病原菌接種

pseudomonassyringaepv.tomatodc3000在含利福平50mg.l^-1的lb培養(yǎng)基中生長，30℃下過夜收集菌體，用10mlmgcl2溶液(80mmol.l^-1)重懸，密度為2×10⁸個(gè)菌落/ml。用無菌注射器吸取菌液，拔掉針頭，輕壓葉片進(jìn)行侵染。

10、結(jié)果與分析

10.1ljhqtcdna的分離

利用簡并引物，以金銀花幼葉片cdna為模板，通過pcr擴(kuò)增，獲得了一個(gè)860bp的核心序列。序列比對(duì)表明，該片段屬于?；D(zhuǎn)移酶。通過race方法，克隆了該基因的全長cdna序列，命名為ljhqt(accessionnumberaek80405)，其序列如seqidno.1所示。ljhqtcdna全長1,621bp，其中包括1,320bp的編碼區(qū)、209bp的5’非翻譯區(qū)和一個(gè)包含18個(gè)多聚腺苷酸尾的92bp3’非翻譯區(qū)。用expasy開發(fā)的protparam工具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)的分析，ljhqt編碼一個(gè)439個(gè)氨基酸的多肽，推測的分子量為48.4kda，等電點(diǎn)(pi)為6.42，其序列如seqidno.2所示。ljhqt的氨基酸序列含有2個(gè)保守域：hxxxdg和dfgwg(圖1)。ljhqt與其它植物hqt的同源性介于42～71％之間。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，ljhqt蛋白與其他物種的hqt組成一個(gè)分支，與hct蛋白形成兩個(gè)獨(dú)立的亞家族(圖2)。

seqidno.1

seqidno.2

mgsegsvktmnitvkdssmvqpakntpekklwnsnldlvvgrihiltvyfyrsngsqnffeprvlkealsnvlvsfypmagrlgkddegrveincngegvlfveaesdccvddfgdftpstemrrltptvdysgdissypliilqvtyfkcggvslgvgvhhtlsdgvsslhfintwsdmarglsiaippfidrtllrprtpptptfdhveyhpppsmitkplsgpkgvstailklsldqlttlkakaknegngkdhstyeilaahlwrcackardlsanqtsklyiatdgrsrlcpplppgylgnvvftatpmadsgdlqaepvtstakrihnsltrmdneylrsaldflettpdlktlvrgpnyfaspnlninswtrlpvhdadfgwgrpifmgpasilyegtiyiipsttndrslslavcldaghmarfekclyef

10.2ljhqt在金銀花中的基因組結(jié)構(gòu)

從金銀花幼葉中提取基因組dna，分別用ndei,hindiii和ecorv酶切。一個(gè)380bp的ljhqt片斷(位于ljhqt核酸序列1～380位之間)作為探針。southernblot雜交結(jié)果顯示，存在2-4個(gè)不同大小的條帶(圖3)。由于ndei,hindiii和ecorv在ljhqt內(nèi)沒有酶切位點(diǎn)，此結(jié)果表明金銀花基因組中存在2～4個(gè)ljhqt拷貝。

10.3ljhqt的功能鑒定及酶學(xué)特性分析

將ljhqt與原核表達(dá)載體pet30a融合，轉(zhuǎn)化bl21大腸桿菌菌株(圖4a～圖4c)。經(jīng)1.0mmol/liptg(異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷)28℃誘導(dǎo)4小時(shí)后，菌體經(jīng)超聲波破碎，分別取少量破碎液和經(jīng)離心后的蛋白上清sds-page電泳檢測，結(jié)果顯示，在c末端添加組氨酸標(biāo)簽的重組ljhqt在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了體外表達(dá)。通過鎳瓊脂糖凝膠柱純化的方法獲得純化的蛋白。sds-page結(jié)果顯示，純化的重組蛋白在48kda的位置上形成一個(gè)單一條帶(圖5)。

取純化的重組金銀花hqt蛋白，加入到體外催化反應(yīng)體系中。酶促產(chǎn)物的定性及定量分析結(jié)果顯示，重組的ljhqt能有效催化奎尼酸與咖啡酰輔酶a和香豆酰輔酶a的轉(zhuǎn)酰基反應(yīng)，分別生成綠原酸和香豆?？崴?圖6)，而對(duì)照沒有反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)。為研究ljhqt的底物特異性，同時(shí)以莽草酸為底物進(jìn)行了測試，hplc檢測幾乎沒有產(chǎn)物出現(xiàn)。

分別以咖啡酰輔酶a和香豆酰輔酶a為?；w，以奎尼酸和莽草酸為?；荏w，開展了ljhqt的酶動(dòng)力學(xué)研究。結(jié)果表明，ljhqt對(duì)奎尼酸的親和力更高(表1)。在香豆酰輔酶a飽和時(shí)，ljhqt對(duì)奎尼酸的親和力(km＝77±45μmol/l)比莽草酸(km＝5579±371μmol/l)高70倍。同時(shí)以cga(chlorogenicacid，綠原酸)為底物，通過檢測咖啡酰輔酶a生成量，測定了ljhqt催化cga裂解的能力。結(jié)果表明，ljhqt能夠催化該反應(yīng)，km為146±25μmol/l。

表1ljhqt的酶動(dòng)力學(xué)分析

10.4過表達(dá)ljhqt擬南芥植株的獲得

為了進(jìn)一步研究ljhqt基因?qū)τ诰G原酸積累的影響，利用gateway技術(shù)構(gòu)建了ljhqt植物高效表達(dá)載體，在該載體中l(wèi)jhqt置于花椰菜花葉病毒35s強(qiáng)效啟動(dòng)子之下，其序列如seqidno.7所示，空載體作為對(duì)照，二者分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌gv3101，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化擬南芥(圖7)。經(jīng)過kan篩選和后代分離鑒定，共獲得5個(gè)ljhqt轉(zhuǎn)基因純系和2個(gè)空載體轉(zhuǎn)化株系(圖8)。

seqidno.7

10.5過表達(dá)ljhqt擬南芥綠原酸含量與抗病性分析

rt-pcr結(jié)果表明，5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有l(wèi)jhqt基因表達(dá)，其中以line5和line8表達(dá)量較高，而對(duì)照中沒有(圖9)。通過hplc檢測了各株系中綠原酸含量，結(jié)果表明，各轉(zhuǎn)基因株系中均有綠原酸積累(圖10a)。其中含量最低的為0.33μg/mg(鮮重)，最高為0.92μg/mgfw，對(duì)照中無綠原酸。

有研究表明，綠原酸能提高植物抗病性。野生型擬南芥并不合成綠原酸，而轉(zhuǎn)ljhqt基因后，在轉(zhuǎn)基因株系里檢測到了綠原酸的積累，本發(fā)明對(duì)綠原酸含量最高的lon5和對(duì)照分別進(jìn)行了研究。葉片在接種病原菌dc30004d后，表現(xiàn)出明顯差異(圖10b和圖10c)。lon5的抗病能力明顯高于對(duì)照。

11、結(jié)論

本發(fā)明成功克隆了金銀花中一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶基因ljhqt。植物?；D(zhuǎn)移酶家族(bahd)利用?；鵦oa為底物，產(chǎn)生各種揮發(fā)性脂類、修飾后的花青素以及與植物抵抗病原微生物侵害的相關(guān)化合物。bahd家族成員在結(jié)構(gòu)上都有一定的相似性。ljhqt與其它植物hqt的同源性介于42～71％之間。與其家族成員一致，ljhqt含有兩個(gè)主要的保守區(qū)域，hxxxd和dfgwg。這兩個(gè)區(qū)域基本上在所有的成員中都有體現(xiàn)。但是，這些保守區(qū)在一些酶中會(huì)發(fā)生變化，如dfgwg這個(gè)保守區(qū)就會(huì)在楊樹中變成dfg-fg、dfgwa、dfgwk、nfgwg和dygwg這樣的一些區(qū)域。

體外酶促反應(yīng)表明，ljhqt更傾向于催化奎尼酸為酰基受體的反應(yīng)。這一催化特點(diǎn)與來源于煙草、番茄等物種的hqt蛋白相似，表明ljhqt參與了金銀花中綠原酸的生物合成。但目前還無法推斷l(xiāng)jhqt是催化咖啡酰輔酶a和奎尼酸直接生成綠原酸，還是催化香豆酰輔酶a和奎尼酸生成香豆?？崴?，進(jìn)而在c3’h作用下羥化生成綠原酸。兩個(gè)不同的合成途徑，可能取決于不同組織中咖啡酰輔酶a與香豆酰輔酶a的相對(duì)含量。niggeweg等利用rnai方法，降低番茄中hqt基因的表達(dá)，結(jié)果使番茄葉片中綠原酸含量降低了98％。另有研究表明，擬南芥中由于缺乏hqt基因，盡管hct和c3’h基因都有功能，其體內(nèi)依然沒有檢測到綠原酸積累。本發(fā)明驗(yàn)證了ljhqt在轉(zhuǎn)基因擬南芥中持續(xù)表達(dá)，其表達(dá)量與擬南芥中綠原酸含量呈正相關(guān)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了ljhqt在綠原酸生物合成中的重要功能。

本發(fā)明以高綠原酸含量的轉(zhuǎn)基因擬南芥為對(duì)象，通過葉片接種致病菌dc3000，研究了綠原酸在植物抗病中的作用。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，綠原酸提高了擬南芥葉片的抗病性，減緩了病原菌的侵染。相似結(jié)果在煙草抗尾孢真菌和病原細(xì)菌dc3000侵染的研究中也有報(bào)道。cga可能通過其抗氧化能力，介導(dǎo)植物的抗病反應(yīng)。植物傷口部位感染后，cga被多酚氧化酶氧化，生成苯醌。苯醌通過細(xì)胞壁物質(zhì)交聯(lián)抑制病原菌的侵染。

上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。

sequencelisting

<110>山東中醫(yī)藥大學(xué)

<120>金銀花克隆ljhqt基因、克隆方法、植物表達(dá)載體及用途

<130>2017

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1320

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgggaagtgaaggaagtgtgaagacgatgaatatcaccgtcaaagattcgtctatggta60

cagccggcgaagaatacgccggagaagaagctctggaactcgaatctggaccttgtagtc120

ggtcggatccacatcttgaccgtctatttctacagatcgaacggatctcagaatttcttc180

gaacctagggttttgaaggaggctctgagtaatgttttggtctcgttttacccaatggcc240

ggaagattagggaaggatgatgaaggaagagttgagattaactgtaacggtgaaggtgtg300

ttgtttgttgaggctgaatctgattgttgtgttgatgattttggtgatttcactccttct360

acggagatgcggaggcttacgccgactgtggattattccggcgatatttcttcttatccg420

ctcatcattttacaggtaacatatttcaagtgtgggggagtgtctctaggagttggggtg480

catcacaccctatcagatggtgtttcctccctccacttcatcaacacatggtccgacatg540

gctcgtggcctctcaatagcaatcccaccgttcatcgaccgcaccctccttcgtccaaga600

accccacccaccccaacatttgatcacgtcgaataccacccaccgccctccatgatcacc660

aaacccttgtcaggccccaagggcgtctcaaccgccatcctaaagctctccctcgaccaa720

cttaccaccctcaaggctaaagccaagaatgaaggtaacggaaaggaccacagcacctac780

gagatcctagctgctcacttgtggcggtgtgcctgcaaggcccgggacctcagcgccaac840

cagacgagcaagttatacatagccacagacgggcgatcgaggctttgcccaccactcccg900

ccgggctacctaggaaatgtggtgttcacagccacgccaatggcggattccggtgatctc960

caggcagagccggtaactagcacagctaagagaatccacaactcattgaccagaatggat1020

aatgagtacttgaggtccgctctcgactttctggagacaacaccagacctcaaaactctt1080

gtgcgagggccaaactactttgctagcccgaacctcaacatcaatagctggactaggctc1140

ccggttcacgacgcggatttcgggtggggccggcccatatttatgggacctgcaagtata1200

ctatacgagggtacaatatatataataccgagcacaacaaacgaccggagcttgtcattg1260

gcggtgtgcttagacgcgggtcacatggctcggttcgaaaagtgcttgtatgagttctaa1320

<210>2

<211>439

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

metglysergluglyservallysthrmetasnilethrvallysasp

151015

sersermetvalglnproalalysasnthrproglulyslysleutrp

202530

asnserasnleuaspleuvalvalglyargilehisileleuthrval

354045

tyrphetyrargserasnglyserglnasnphephegluproargval

505560

leulysglualaleuserasnvalleuvalserphetyrprometala

65707580

glyargleuglylysaspaspgluglyargvalgluileasncysasn

859095

glygluglyvalleuphevalglualagluseraspcyscysvalasp

100105110

asppheglyaspphethrproserthrglumetargargleuthrpro

115120125

thrvalasptyrserglyaspilesersertyrproleuileileleu

130135140

glnvalthrtyrphelyscysglyglyvalserleuglyvalglyval

145150155160

hishisthrleuseraspglyvalserserleuhispheileasnthr

165170175

trpseraspmetalaargglyleuserilealailepropropheile

180185190

aspargthrleuleuargproargthrproprothrprothrpheasp

195200205

hisvalglutyrhisproproprosermetilethrlysproleuser

210215220

glyprolysglyvalserthralaileleulysleuserleuaspgln

225230235240

leuthrthrleulysalalysalalysasngluglyasnglylysasp

245250255

hisserthrtyrgluileleualaalahisleutrpargcysalacys

260265270

lysalaargaspleuseralaasnglnthrserlysleutyrileala

275280285

thraspglyargserargleucysproproleuproproglytyrleu

290295300

glyasnvalvalphethralathrprometalaaspserglyaspleu

305310315320

glnalagluprovalthrserthralalysargilehisasnserleu

325330335

thrargmetaspasnglutyrleuargseralaleuasppheleuglu

340345350

thrthrproaspleulysthrleuvalargglyproasntyrpheala

355360365

serproasnleuasnileasnsertrpthrargleuprovalhisasp

370375380

alaasppheglytrpglyargproilephemetglyproalaserile

385390395400

leutyrgluglythriletyrileileproserthrthrasnasparg

405410415

serleuserleualavalcysleuaspalaglyhismetalaargphe

420425430

glulyscysleutyrgluphe

435

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n代表任意一種核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<223>n代表任意一種核苷酸；r代表a或g；y代表c或t；h代表a或c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>nisa,c,g,ort

<400>3

gacthtgcytaarghtngc19

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>n代表任意一種核苷酸；y代表c或t；h代表a或c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>nisa,c,g,ort

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(22)

<223>nisa,c,g,ort

<400>4

cachccaatcahtccytcnccngt24

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtacacaacagagagataactgtc24

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ggtcatgtgctcgctgttggtg22

<210>7

<211>800

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cccacagatggttagagaggcttacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaa60

taatctccaggaaatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcag120

gactaactgcatcaagaacacagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattcc180

agtatggacgattcaaggcttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctc240

taaaaaggtagttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacct300

aacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatga360

caagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatat420

caaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatc480

cggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtgga540

aaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaaga600

tgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaa660

agaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgt720

aagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttc780

atttcatttggagagaacac800