本發(fā)明生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：甘蔗(saccharumofficinaruml.)屬于禾本科甘蔗屬，甘蔗屬又分為9個(gè)種，起源于印度及南太平洋島嶼。甘蔗作為熱帶作物之一，溫度限制其分布范圍，主要包括：北緯34°-南緯31°，分布在世界上的80多個(gè)國(guó)家地區(qū)。每年甘蔗的種植面積在世界范圍內(nèi)達(dá)到1500多萬(wàn)公頃，世界范圍內(nèi)種植甘蔗面積最大、產(chǎn)量最高的國(guó)家分別為印度和巴西。在中國(guó)也有十幾個(gè)省市種植甘蔗，主要集中分布在廣州、云南、廣西、海南及福建等地區(qū)。甘蔗的生長(zhǎng)周期一般為10-16個(gè)月，光飽和點(diǎn)高，碳固定能力強(qiáng)，同時(shí)光合速率較高，光照強(qiáng)度大，含糖量非常豐富，是世界上主要的糖料作物，同時(shí)也是蔗糖的主要原料，蔗糖占全國(guó)食糖的93％(王俊剛，2008)。甘蔗作為主要的制糖作物，其莖稈中要有充足的糖分來(lái)滿足制糖的生產(chǎn)需求，同時(shí)對(duì)莖稈中的纖維含量要求較高，相應(yīng)的非糖物質(zhì)的含量要低。甘蔗莖稈中的蔗糖等糖分隨生長(zhǎng)周期的延長(zhǎng)而正向增加，成熟時(shí)達(dá)到最高，隨后慢慢下降，收獲后甘蔗要盡快送去加工，不易儲(chǔ)存。甘蔗是最高產(chǎn)的大田作物之一，同時(shí)也是吸收、轉(zhuǎn)化以及儲(chǔ)存太陽(yáng)能效率最高的農(nóng)作物之一。甘蔗是莖用植物，含有大量的纖維。甘蔗莖稈中含糖量豐富，水分充足，漿汁叫甜，使用后可以為人體提供大量的能量。甘蔗莖稈中的糖分主要有蔗糖、果糖、葡萄糖等，這些食糖很容易被人體消化利用，因此具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，甘蔗中還發(fā)現(xiàn)含有大量的鈣、鐵、磷、鋅等人體必須的微量元素，甘蔗同時(shí)還具有清熱解毒、暖胃治嘔等作用。近年來(lái)，甘蔗作為一種新型生物能源(陳子云，2003)，受到人們的廣泛關(guān)注，尤其是世界石油資源日益枯竭的當(dāng)下。巴西是首個(gè)將甘蔗生產(chǎn)成乙醇并與汽油一定比例混合為汽車燃料的國(guó)家。隨后在一些生產(chǎn)甘蔗的國(guó)家也開(kāi)始研究，現(xiàn)已達(dá)到較高的規(guī)?；健Ｅc其他作物相比較，利用甘蔗生產(chǎn)燃料成本較低。用甘蔗生產(chǎn)出的乙醇不含硫，所以在大氣中，二氧化硫的排放量大大減少，同時(shí)碳?xì)浠衔锏呐欧帕恳泊蟠鬁p少，即溫室氣體的排放量減少，凈化空氣。迄今為止，在甘蔗的種植技術(shù)與栽培管理上存在諸多的問(wèn)題，這就需要科研工作者在今后的科研實(shí)驗(yàn)上努力改善。同時(shí)，我國(guó)的甘蔗品種較為單一，然而近幾年來(lái)甘蔗中的一些優(yōu)良品種的品質(zhì)逐漸下降、受病蟲害影響產(chǎn)量也隨之降低，所以培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的新品種迫在眉睫。但是由于甘蔗本身染色體數(shù)量較多、遺傳復(fù)雜，較難在傳統(tǒng)常規(guī)育種上取得較大改善。基因工程方法也只是改變了碳物質(zhì)的分配，并沒(méi)有整體上提高甘蔗糖含量，因此還遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)生活的需要(趙婷婷，2012)。研究甘蔗體內(nèi)糖積累和分配機(jī)制，找出糖分積累過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)，然后加以改良是實(shí)現(xiàn)甘蔗高產(chǎn)、高糖一條重要的途徑。將為提高甘蔗品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)甘蔗高產(chǎn)、高糖、和高抗的育種目標(biāo)提供科學(xué)參考。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2及其編碼基因和該基因的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因的克隆方法以及所用到的引物對(duì)。本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因，其核苷酸序列如seqidno:1所示。本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2，其為本發(fā)明第一個(gè)方面所述的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因編碼的蛋白質(zhì)，其核苷酸序列如seqidno:12所示。本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種本發(fā)明第一個(gè)方面所述的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因的克隆方法，包括以下步驟：(1)從成熟甘蔗的根、莖和/或葉中提取總rna；(2)以總rna為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cdna；(3)設(shè)計(jì)shhxt2基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物對(duì)，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收pcr產(chǎn)物，其中，shhxt2基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示；(4)pcr產(chǎn)物連接載體，轉(zhuǎn)化，測(cè)序，獲得shhxt2基因基因片段。本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因在細(xì)胞內(nèi)定位中的應(yīng)用。本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因在提高植物抗冷脅迫中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六個(gè)方面是提供如本發(fā)明第一個(gè)方面所述的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因在培育高糖高產(chǎn)高抗轉(zhuǎn)基因甘蔗中的應(yīng)用。本發(fā)明的第七個(gè)方面是提供一種表達(dá)載體，其含有本發(fā)明第一個(gè)方面所述的甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因。本發(fā)明的第八個(gè)方面是提供一種引物對(duì)，其核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。該引物對(duì)可用于shhxt2基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增。本發(fā)明的第九個(gè)方面是提供另一種引物對(duì)，其核苷酸序列如seqidno:4和seqidno:5所示。本發(fā)明的第十個(gè)方面是提供又一種引物對(duì)，其核苷酸序列如seqidno:6和seqidno:7所示。本發(fā)明的第十一個(gè)方面是提供又一種引物對(duì)，其核苷酸序列如seqidno:8和seqidno:9所示。本發(fā)明首次從甘蔗中克隆得到shhxt2基因，該基因具有糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，能定位于細(xì)胞的細(xì)胞膜中，能提高植物抗冷脅迫能力，有利于甘蔗等植物在逆條件下生長(zhǎng)，為揭示蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育和品質(zhì)改良的調(diào)節(jié)功能，為提高作物產(chǎn)量與改良品質(zhì)的基因工程研究提供遺傳學(xué)依據(jù)。附圖說(shuō)明圖1為甘蔗不同部位的總rna提取電泳圖。圖2為shhxt2基因cdna全長(zhǎng)擴(kuò)增的電泳圖。圖3為shhxt2基因全長(zhǎng)cdna的orf分析結(jié)果。圖4為shhxt2氨基酸跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果。圖5為sweet1氨基酸亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果。圖6為shhxt2-gfp酶切電泳圖。圖7為shhxt2基因在洋蔥內(nèi)表皮中的亞細(xì)胞定位，其中，a/e：gfp熒光(488nm藍(lán)光激發(fā))；b/f：白光觀察：e/f：轉(zhuǎn)有pshhxt2-gfp載體表皮細(xì)胞；a/b：轉(zhuǎn)有pcambia1302空載體表皮細(xì)胞。圖8為p413-phxt7-shhxt2酶切電泳圖。圖9為p413-phxt7-shhxt2酶切電泳圖。圖10為酵母突變體eby.vw果糖吸收功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖11為甘蔗不同組織shhxt2基因相對(duì)表達(dá)量。圖12為冷脅迫下shhxt2基因相對(duì)表達(dá)量。圖13為甘蔗不同病葉中shhxt2基因的相對(duì)表達(dá)量轉(zhuǎn)基因煙草shhxt2基因的pcr檢測(cè)結(jié)果。圖14為pcbi-shhxt2酶切電泳圖。圖15為抗性植株shhxt2的pcr檢測(cè)結(jié)果。圖16為冷脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草下shhxt2基因相對(duì)表達(dá)量。圖17為轉(zhuǎn)化幼苗的ppt篩選及煉苗。圖18為shhxt2轉(zhuǎn)化植株bar基因檢測(cè)pcr結(jié)果。圖19為shhxt2轉(zhuǎn)化植株bar基因試紙條檢測(cè)結(jié)果。圖20為shhxt2過(guò)表達(dá)抗性植株pcr檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施方式下面參照附圖，結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，以更好地理解本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(molecularcloning:alaboratorymanual,3rded.)或酵母遺傳法實(shí)驗(yàn)指南(methodsinyeastgenetics:acoldspringharborlaboratorycoursemanual，adamsaetal編，coldspringharborlaboratory,1998出版)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。1實(shí)驗(yàn)材料1.1植物材料實(shí)驗(yàn)中所有用到的甘蔗植物的材料為roc22的甘蔗品種，種植于中國(guó)熱科院生物所?？趨^(qū)和中國(guó)熱科院生物所臨高試驗(yàn)基地。本實(shí)驗(yàn)所用到的甘蔗roc22組培苗和煙草苗都由本實(shí)驗(yàn)室提供。1.2菌株和載體escherichiacoil.dh5α購(gòu)買于廣州富能公司。pmd19t-simple、pmd19-t購(gòu)買于takara公司；pcambia3300-gus植物表達(dá)載體、pcambia1302gfp載體、eha105根瘤農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)都保存在本實(shí)驗(yàn)室。1.3藥品試劑試劑公司實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒takarala-taq酶、限制性內(nèi)切酶takarat-4連接酶fermentas膠純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒axgen植物rna提取試劑盒omega1.4主要儀器設(shè)備儀器型號(hào)pcr擴(kuò)增儀biometra常溫離心機(jī)hettichd-78532恒溫?fù)u床、恒溫水浴鍋n.jg-27ekiso實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀stratagenemx3005p凝膠成像系統(tǒng)bio-rad電泳儀labneteq27051.5培養(yǎng)基的配制lb培養(yǎng)基(500ml)：酵母2.5g，氯化鈉5g，胰蛋白胨5g，ph約7.0，agar瓊脂粉6g，121℃，23min，高壓滅菌。yep培養(yǎng)基(500ml)：酵母5g，氯化鈉2.5g，胰蛋白胨5g，，在固體培養(yǎng)基100ml中加1.4g瓊脂粉，121℃，23min，高壓滅菌。mr用于甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的液體培養(yǎng)基(500ml)：ms其他成分，1/10ms大量元素，2,4-d0.5mg，葡萄糖5mmol/l，蔗糖15g，ph5.7。甘蔗誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基m1(500ml)：ms，蔗糖15g，2.4-d0.5mg，agar瓊脂粉4g,，ph5.7。甘蔗分化培養(yǎng)基m2(500ml)：ms，6-ba0.5mg，蔗糖15g，kt0.25mg，agar瓊脂粉4.2g，ph5.7。甘蔗生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(500ml)：ms，蔗糖12.5g，naa1mg，agar瓊脂粉4.2g，活性炭0.1g。2實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1甘蔗shhxt2基因的克隆2.1.1甘蔗根、莖、葉總rna的提取按invitrogenreagent試劑盒說(shuō)明書的方法進(jìn)行：(1)取甘蔗不同組織其中包括根、莖、葉各約0.1g左右，剪小塊，立即加入液氮，研磨成粉。(2)將上述磨好的樣品放入新的1.5ml無(wú)酶離心管中，加入800ultrizol溶液，迅速晃動(dòng)十幾下，做好標(biāo)記。(3)常溫條件下靜置4-6min，加入280μl氯仿。反復(fù)顛倒離心管，重復(fù)十幾次，靜置12min，4℃低溫，離心15-18min，12000g。(4)吸出500ul左右的上清，置于新無(wú)酶的1.5ml離心管中。加入500μl提前預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃靜止8-10min，4℃低溫，離心15-20min，12000g。(5)棄上清。加入75％乙醇800ul，溫和晃動(dòng)幾下離心管。(6)4℃低溫，離心12min，8000g，棄上清，吸出離心管內(nèi)的液體，吹干，加入45μlrnase-freeh2o，在56-65℃條件下溫浴15min。(7)冰上放置，混合放人dnasei5μl，dnaseibuffer5μl，水浴：37℃，28min。(8)55mmedta，10μl，65℃，水浴18min。2.1.2rna完整性及純度檢測(cè)在提取出的rna中吸3μl，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳跑膠并檢測(cè)其完整性，結(jié)果如圖1所示，提取的不同組織的rna條帶的完整性高，可適用于cdna的合成。再吸取2μlrna，經(jīng)核酸蛋白分析儀分析，測(cè)定其純度，剩余rna保存在超低溫冰箱備用。2.1.3反轉(zhuǎn)錄合成cdna鏈將以下組分依次加入到無(wú)酶離心管中:rna9.5μlprimeroligo(dt)2.5μlddh2o7.0μl65℃，靜置5min，立即至冰上1-3min。cdna鏈合成的反應(yīng)液：10×buffer2.0μlrnaseinhibitor1.5μl0.01mdntp2.0μlrevertaidm-mulv1.0μtotalvolume20.0μl在上述cdna鏈反應(yīng)液中加入上述提取的rna以及引物，混合均勻，溫育1h，42℃。65℃，10min，靜止。反轉(zhuǎn)錄合成的cdna保存?zhèn)溆谩?.1.4shhxt2基因的克隆通過(guò)ncbi公布的同源物種設(shè)計(jì)特異性引物克隆出甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因shhxt2，設(shè)計(jì)引物如下：pcr擴(kuò)增體系如下：擴(kuò)增程序：94℃5min；94℃90s，63℃90s，72℃90s，33個(gè)循環(huán)；72℃12min。2.1.5pcr擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳將擴(kuò)增得到的pcr產(chǎn)物，吸出2μl，并加上10×loadingbuffer約1μl，混勻后經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。135v，電泳，18min，若條帶單一，變進(jìn)行純化。電壓95v，電泳35min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中拍照記錄，并切下疑似目的條帶的凝膠。凝膠電泳結(jié)果如圖2所示，得到一條1900bp左右的條帶，與預(yù)測(cè)條帶大小一致，將其回收，連接轉(zhuǎn)化，并送公司測(cè)序后得到1969bp長(zhǎng)度的序列。2.1.6擴(kuò)增片段凝膠回收目的條帶的回收參照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。2.1.7目的條帶與t載體連接反應(yīng)目的條帶與pmd19-t載體連接體系如下：16℃，2-4h。(8)連接載體轉(zhuǎn)化及測(cè)序(1)連接產(chǎn)物輕輕放入70μl大腸感受態(tài)細(xì)胞(escherichiacoli.dh5α)中，慢慢混勻，冰浴25-30min。(2)42℃，熱激70-90s，再冰上放置90-180s。(3)加入800μllb液體培養(yǎng)基，混勻，恒溫培養(yǎng)箱37℃，200rpm，震蕩60min。(4)11000rpm，離心15s，倒出多余上清，約留200ul，槍頭吹打沉淀，混勻，在lb(100μg/mlamp)培養(yǎng)基上均勻涂板，在恒溫培養(yǎng)箱里，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h，直至形成單菌落。(5)待長(zhǎng)板后，挑取多個(gè)單菌落，放在含有amp抗性的lb液體培養(yǎng)基的離心管中，在恒溫培養(yǎng)箱中，37℃，振蕩培養(yǎng)2-5h。(6)將搖起后的菌液分裝保存。(7)從上述菌液中吸出1μl，當(dāng)作模板，pcr擴(kuò)增，若pcr產(chǎn)物大小一致，便送去公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：克隆獲得片段大小為954bp。2.2甘蔗shhxt2基因生物信息學(xué)分析通過(guò)ncbi上對(duì)shhxt2的氨基酸序列進(jìn)行blastp搜索，比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與hxt基因家族同源。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html對(duì)shhxt2基因cdna的序列開(kāi)放閱讀框orf的分析發(fā)現(xiàn)，具有完整orf，長(zhǎng)度為1623bp，從44位起始密碼子atg到1666位gta終止密碼子止，編碼540個(gè)氨基酸，如圖3。利用protparam軟件進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，其編碼的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量為56.64kda，理論等電點(diǎn)pi為9.16，不穩(wěn)定系數(shù)是37.33，說(shuō)明是穩(wěn)定蛋白?？偲骄杷笖?shù)為0.583，表明該蛋白為疏水性蛋白。tmhmmserverv.2.0在線軟件將shhxt2的氨基酸序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)，如圖4，shhxt2蛋白具有12個(gè)跨膜區(qū),跨膜區(qū)分別位于98-120，140-162，171-189，194-216，228-250，255-277，339-361，376-396，403-425，440-459,471-493，497-519。這與之前報(bào)道真核生物的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)一致。根據(jù)softberrry亞細(xì)胞定位軟件分析發(fā)現(xiàn)shhxt2可能位于質(zhì)膜上，如圖5，推測(cè)其可能是一種質(zhì)膜蛋白。2.3shhxt2基因在洋蔥內(nèi)表皮中的亞細(xì)胞定位(1)gfp融合載體的構(gòu)建a.對(duì)shhxt2基因序列分析，找到完整orf并在其兩端設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，下游引物去掉終止密碼子，如下所示：sh2gf：5′ggccatggatgcgctgatacgctgtaacg3′ncoish2gr：5′ggactagcctttctgctacagttcgttca3′speib.以shhxt2-pmd19-t質(zhì)粒為模板，引物(sh2gf，sh2gr)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序如下：反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min，94℃70s，62℃90s，72℃3min，33個(gè)循環(huán)，72℃12min。將pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其大小與目的條帶一致，純化連接到pmd19t-simple載體，轉(zhuǎn)到大腸桿菌，在含有氨芐青霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，分別以同樣的引物進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性單克隆，送測(cè)序公司測(cè)序。c.提取測(cè)序正確shhxt1-pmd19t-simple和shhxt2-pmd19t-simple的單克隆質(zhì)粒，以及含pcambia1302載體的菌株的質(zhì)粒。參照試劑盒上的說(shuō)明書提取質(zhì)粒。d.用限制性內(nèi)切酶spei，ncoi對(duì)質(zhì)粒shhxt2-pmd19t-simple和pcambia1302進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：e.然后1％的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖6所示回收shhxt2-pmd19t小片段和pcambia1302大片段，用t4dnaligase連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)入感受態(tài)dh5α，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證，送公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果正確，獲得shhxt2-gfp融合載體。酶切體系如下：(2)農(nóng)桿菌感受態(tài)的制備a.取出保存在-80℃超低溫冰箱的eha105農(nóng)桿菌菌株，放置在冰上解凍后，用接種環(huán)在含有二抗(10mg/mlstr+20mg/mlrif)的yep固體培養(yǎng)基上用接種環(huán)劃線，28℃，2d，倒置培養(yǎng)。b.長(zhǎng)出單克隆后，挑取單菌落，接種于含有三抗(10mg/mlstr+20mg/mlrif+10mg/mlkan)yep液體培養(yǎng)基中，28℃，振蕩培養(yǎng)，約12～25h，直菌液變渾濁。c.取上述菌液接種到含二抗的yep液體培養(yǎng)基中，28℃，210rmp/h，培養(yǎng)5～8h，od值達(dá)0.5～0.55。d.搖到想要的濃度后放置在打離心管中，冰上靜置25-30min。e.4℃，4500xg，低溫離心3-5min，收集菌體。f.棄上清，取提前預(yù)的冷50mmol/lcacl2，20ml，重懸菌體。g.重復(fù)e。h.棄上清，吸取50mmcacl21ml，重懸菌液，然后分裝到1.5ml離心管中，液氮迅速冷凍，超低溫冰箱保存，待用。(3)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化取出保存在超低溫冰箱中的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，立即放在冰上，待溶解；溶解后，加入少量質(zhì)粒，均勻混合，冰浴18min，液氮放置3-5min；37℃，解凍5min，加入yep液體培養(yǎng)基(不含抗生素)800μl，28℃，230rmp，2-3h；8000rmp離心30s，倒出多余培養(yǎng)基，將剩余的150μl的菌液均勻放在含有三抗的yep固體培養(yǎng)基平板上，28℃，36-48h，倒置培養(yǎng)；挑取單菌落，放在yep含有三抗的液體培養(yǎng)基上，28℃，230rmp，36～48h；菌液pcr鑒定，提取質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證。(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染洋蔥表皮細(xì)胞挑取固體培養(yǎng)基平板上的重組質(zhì)粒shhxt2-gfp及空載質(zhì)粒pcambia1302的陽(yáng)性單克隆，放在含有三抗的液體培養(yǎng)基上，28℃，200rmp，12-16h。吸取上述菌液中的4ml，放到新的含有三抗的yep液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3h。8000rmp，10min，離心，收集菌體，吸取50ml農(nóng)桿菌侵染液懸浮菌體，重復(fù)重懸2次，最后用調(diào)od600至0.01。在注射前將洋蔥放置在28℃條件下，暗培養(yǎng)2天。注射：用小注射器吸取200ul菌液注入洋蔥表皮下，形成一個(gè)1cm2的小泡，28℃暗培養(yǎng)72h。用鑷子輕輕撕下洋蔥內(nèi)表皮，輕壓成片，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。使用熒光顯微鏡，并在紫外光下觀察農(nóng)桿菌侵染的洋蔥表皮細(xì)胞，觀察細(xì)胞中g(shù)fp情況，如圖7，結(jié)果顯示：a為空載pcambia1302，在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等各個(gè)部位都能觀察到gfp綠色熒光現(xiàn)象，而e中是轉(zhuǎn)化的shhxt2-gfp融合載體的洋蔥細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在膜上有明顯的gfp綠色熒光現(xiàn)象，定位明顯，因此推測(cè)shhxt2基因編碼的蛋白是一種膜蛋白。2.4shhxt2單糖吸收功能鑒定2.4.1酵母表達(dá)載體構(gòu)建(1)分析shhxt2基因序列，找到其完整開(kāi)放閱讀框orf，在orf兩端設(shè)計(jì)引物，加入酶切位點(diǎn)和加保護(hù)堿基，如下所示：sh2pf：5′ggggatccatgcgctgatacgctgtaacg3′bamhish2pr：5′gggtcgacctttctgctacagttcgttca3′sali(2)以構(gòu)建的shhxt2-pmd19-t質(zhì)粒為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序如下：反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5min，94℃70s，62℃90s，72℃3min，33個(gè)循環(huán)，72℃12min。將pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其大小與目的條帶一致，純化連接到pmd19t-simple載體，轉(zhuǎn)到大腸桿菌，在含有氨芐青霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，分別以同樣的引物進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性單克隆，送測(cè)序公司測(cè)序。(3)提取測(cè)序正確shhxt2-pmd19t-simple的單克隆質(zhì)粒，以及含p413-phxt7載體的菌株的質(zhì)粒。參照試劑盒上的說(shuō)明書提取質(zhì)粒。(4)用限制性內(nèi)切酶bamhi、sali對(duì)質(zhì)粒shhxt2-pmd19t-simple和p413-phxt7進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：(6)回收酶切產(chǎn)物中的shhxt2-pmd19t小片段和p413-phxt7大片段，t4連接酶連接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證，如圖8所示。送公司測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果正確，獲得p413-phxt7-shhxt1/shhxt2融合載體。酶切鑒定體系如下：2.4.2酵母突變菌株eby.vw4000感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化(1)復(fù)蘇酵母突變菌株eby.vw4000：取10μl用甘油保存菌液加入5mlypd培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，搖過(guò)夜。(2)將復(fù)蘇菌液在ypd固體平板上劃線，30℃，培養(yǎng)24h。(3)挑取一個(gè)單克隆接種于5mlypd液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，搖16～18h。(4)轉(zhuǎn)移3ml至含有50mlypd液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃，230rpm，培養(yǎng)2～4h。(5)將菌液轉(zhuǎn)入50ml離心管，室溫5000rpm，離心5min。棄上清，倒置于滅菌濾紙上流出殘留培養(yǎng)液。(6)加8ml滅菌水，充分重懸沉淀，轉(zhuǎn)入15ml離心管中，7000rpm離心5min，棄上清。(7)加250μl1×te/liac,充分重懸沉淀，得到酵母感受態(tài)細(xì)胞。(8)分別在兩個(gè)1.5ml離心管中加入0.5～1μgp413-shhxt2質(zhì)粒和p413空質(zhì)粒，再加入5μl(100mg/ml)鮭魚精dna，混勻，加入50μl酵母感受態(tài)細(xì)胞，吹打混勻。(9)加入300μl40％peg4000/liac/te，充分混勻，30℃,200rpm，培養(yǎng)0.5h。(10)42℃，熱激15min，置于冰上；12000rpm離心15s。(11)棄上清，加入1mlypd液體培養(yǎng)基重懸沉淀；30℃,200rpm，培養(yǎng)1.5h。(12)取150μl菌液涂布于sd/ura3固體選擇培養(yǎng)基上，30℃，倒置培養(yǎng)。2.2.4.3轉(zhuǎn)化酵母質(zhì)粒酶切驗(yàn)證分別挑取p413-phxt7-shhxt2-eby.vw4000以及p413-phxt7-eby.vw4000酵母單克隆，用sc-his(含有麥芽糖)液體培養(yǎng)基搖菌，進(jìn)行小量酵母質(zhì)粒提取，所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化dh5α，再提取大腸桿菌質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證pcr陽(yáng)性酵母陽(yáng)性克隆是否包含正確目的質(zhì)粒，小量酵母質(zhì)粒提取方法參照tiangen酵母小提質(zhì)粒試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。結(jié)果如圖9所示，p413-phxt7-shhxt2已轉(zhuǎn)入酵母中。2.4.4shhxt2酵母單糖吸收功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分別挑p413-phxt7-shhxt2-eby.vw4000以及p413-phxt7-eby.vw4000酵母單克隆，放入含有2％麥芽糖的sc-his液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，培養(yǎng)24h。測(cè)定od600＝1.0，并用無(wú)菌水分別稀釋10、100倍，充分混勻。吸取4μl接種在含有不同單糖為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2-4d，觀測(cè)生長(zhǎng)狀況，以轉(zhuǎn)化的空載體p413-phxt7為陰性對(duì)照。選擇培養(yǎng)基成分：結(jié)果如圖10所示，己糖吸收功能缺陷型酵母轉(zhuǎn)入shhxt1和shhxt2基因后可以在以果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而僅轉(zhuǎn)入p413-phxt7空載的酵母卻不能在以果糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在以葡萄糖、半乳糖和甘露糖各為唯一碳源的培養(yǎng)基上都不能正常生長(zhǎng)。對(duì)照組中，在以麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基上，這幾種酵母轉(zhuǎn)化體可以能正常生長(zhǎng)。結(jié)果表明，甘蔗的單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2在酵母突變體中可以正確表達(dá)，并且所表達(dá)的蛋白具有果糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而恢復(fù)了酵母突變體對(duì)果糖的吸收能力。2.5shhxt2基因的表達(dá)量分析2.5.1樣品的采集(1)甘蔗不同組織樣品的采集待到甘蔗伸長(zhǎng)期時(shí)，在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所臨高甘蔗試驗(yàn)基地中取樣。秤取新鮮的甘蔗組織，包括：根、未成熟葉、未成熟莖、成熟葉、成熟莖。秤取樣品時(shí)，選取同一時(shí)期、生長(zhǎng)相似的健壯甘蔗植株9株，每3株為一個(gè)重復(fù)，混合取樣。分別收集未成熟葉、成熟葉、未成熟莖、成熟莖。未成熟葉為甘蔗未抽出心葉；成熟葉為甘蔗植株由上及下完全展開(kāi)且可見(jiàn)肥厚帶的+3葉。未成熟莖為植株上部莖頂端生長(zhǎng)點(diǎn)以下第二節(jié)；成熟莖為甘蔗植株由下及上第3或4節(jié)。根為挖取植株后成熟根。(2)甘蔗組培苗冷脅迫處理將實(shí)驗(yàn)所需要的甘蔗組培苗植株接種在ms培養(yǎng)基中，28℃，16h/8h(光照/黑暗)，3000lx，預(yù)培養(yǎng)20d，選取葉齡相同且長(zhǎng)勢(shì)一致的甘蔗組培苗轉(zhuǎn)入ms液體培養(yǎng)基，28℃，16h/8h(光照/黑暗)，3000lx，培養(yǎng)48h。低溫4℃，16h/8h(光照/黑暗)，3000lx，脅迫處理。冷脅迫0h，6h，12h，24h，36h，48h，72h后進(jìn)行取樣，每次取樣9株植株，3株為一個(gè)重復(fù)混合取樣，3次重復(fù)。每次取樣完成后立即放入液氮中保存。(3)甘蔗病葉的采集采集的樣品種植在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所臨高甘蔗試驗(yàn)基地。在甘蔗大田中觀察甘蔗發(fā)病情況，采集感染甘蔗褐條病、甘蔗赤腐病和甘蔗黑穗病的，且處于發(fā)病中期的甘蔗植株葉片，分別采集甘蔗褐條病病葉、甘蔗赤腐病病葉、甘蔗黑穗病病葉；采樣時(shí)每種病害分別選取典型且單一發(fā)病的發(fā)病中期植株，每個(gè)植株選取一片發(fā)病葉片，共選取9片，每3片一個(gè)重復(fù)，3次重復(fù)。以未發(fā)病的甘蔗健康植株葉片為對(duì)照。采集完葉片，立即放入液氮中保存。2.5.2rt-qpcr擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析參照reagent說(shuō)明書提取rna的方法提取甘蔗的不同組織、冷處理不同時(shí)間、不同病葉的甘蔗幼苗rna后，反轉(zhuǎn)錄成cdna，模板濃度均一化。在實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀(mx3000p)上，進(jìn)行熒光定量pcr，檢測(cè)shhxt2在不同組織及不同處理下的相對(duì)表達(dá)量的變化。引物：sh2f1:5′-tcgttaagaagatgatac-3′sh2r1:5′-tagtttcatgtagtttg-3′甘蔗的內(nèi)參引物(gapdh)(引自iskandaretal.,2004)：gf：5′cacggccactggaagca3′gr：5′tcctcagggttcctgatgcc3′pcr擴(kuò)增體系：pcr反應(yīng)體系：94℃2min30s；94℃17s，58℃90s，72℃20s，34個(gè)循環(huán)。每個(gè)模板重復(fù)3次，減少實(shí)驗(yàn)誤差。2.5.3檢測(cè)結(jié)果熒光定量real-timepcr檢測(cè)甘蔗不同組織shshxt2表達(dá)量變化，如圖11。結(jié)果表明：shshxt2在甘蔗的不同組織中表達(dá)量存在差異，shshxt2在不同組織中都表達(dá)，表達(dá)量也相對(duì)高。在葉中的表達(dá)量高于莖中，未成熟組織中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成熟組織中。在未成熟葉，表達(dá)量達(dá)到最高。shshxt2在不同組織里面的相對(duì)表達(dá)量為：未成熟葉>成熟葉>未成熟莖>成熟莖>根。由此說(shuō)明shshxt2在未成熟組織中表達(dá)量高。熒光定量real-timepcr檢測(cè)甘蔗幼苗冷脅迫誘導(dǎo)后，shhxt2基因的表達(dá)量變化，如圖12。在0-72h內(nèi)，shhxt2表達(dá)量隨處理時(shí)間的增加而增高。6h時(shí)，shhxt2被誘導(dǎo)，之后的72h內(nèi)表達(dá)量穩(wěn)步增加。這表明，甘蔗在受到冷脅迫時(shí)，shhxt2基因上調(diào)來(lái)抵抗冷脅迫。分析該類基因可能參與輸送糖類物質(zhì)，調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓，維持甘蔗各組織在非生物脅迫下的正常生長(zhǎng)。熒光定量real-timepcr檢測(cè)到甘蔗不同的病葉中shhxt2基因的表達(dá)量的變化，如圖13。shhxt2基因在甘蔗赤腐病、甘蔗褐條病及甘蔗黑穗病的病葉中相對(duì)表達(dá)量都高于健康葉，在甘蔗褐條病病葉中的相對(duì)表達(dá)量最高，相當(dāng)于健康葉片的5.5.倍；甘蔗褐條病次之，相當(dāng)于健康葉片的3.5倍，在甘蔗黑穗病中表達(dá)量最低。這表明，當(dāng)病原菌侵入葉片時(shí)，可能激活和誘導(dǎo)shhxt2基因在葉肉細(xì)胞膜上表達(dá)，輸送更多的糖分泌到葉肉細(xì)胞間隙，為病原微生物的侵入和繁殖提供一個(gè)良好的環(huán)境。2.6shhxt2基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草2.6.1構(gòu)建shhxt2的植物表達(dá)載體(1)分析shhxt2基因序列，找到其完整開(kāi)放閱讀框orf，并在orf兩端設(shè)計(jì)引物，加上酶切位點(diǎn)和加保護(hù)堿基，如下所示：sh2f2：5′ggggatcgatacatcgctcgctgtaacg3′bamhish2r2：5′gggagctctcactgctttaacacgttcccgt3′saci(2)構(gòu)建的shhxt2-pmd19-t質(zhì)粒為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及程序如下：(3)反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃4min30d，94℃90s，62℃1min30s，72℃1min30s，36個(gè)循環(huán)，72℃12min。pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大小與目的條帶一致，純化連接到pmd19t-simple載體，轉(zhuǎn)到大腸桿菌，在含有氨芐青霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，分別以同樣的引物進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增驗(yàn)證，挑取陽(yáng)性單克隆，送測(cè)序公司測(cè)序。載體正確命名為pcbi-shhxt2。(4)提取測(cè)序正確的pcbi-shhxt2的單克隆和含pcambia3300-gus載體的菌株質(zhì)粒。(5)用限制性內(nèi)切酶bamhi，saci對(duì)質(zhì)粒pmd-shhxt2和pcambia3300-gus進(jìn)行雙酶切，酶切體系如下：(6)回收酶切產(chǎn)物中shhxt2-19t小片段和pcambia3300-gus大片段，t4連接酶轉(zhuǎn)化到dh5α，重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖14所示。送公司測(cè)序，結(jié)果正確，獲得pcbi-shhxt2植物表達(dá)載體。酶切驗(yàn)證體系如下：2.6.2煙草外植體培養(yǎng)用90％的酒精浸泡普通煙草(nicotiamtabacum)種子15s，再用提前高溫滅菌的鑷子將浸泡的種子移至40％次氯酸鈉溶液(加一滴tween-20)中，不停的攪動(dòng)，約20min，用無(wú)菌水漂洗，重復(fù)幾次后放置在滅過(guò)菌的濾紙上吹干種子，帶吹干后，放置在ms固體的培養(yǎng)基上，每皿大約放15粒種子，28℃，光培養(yǎng)。每隔一周更換一次培養(yǎng)基，直至成到3-5片葉子出來(lái)。2.6.3遺傳轉(zhuǎn)化煙草(1)蘸取保存在超低溫冰箱的eha105菌種，在yep固體培養(yǎng)基(10mg/mlstr+20mg/mlrif+50mg/mlkan)中劃線，28℃條件下倒置培養(yǎng)16-24h。挑單克隆，放入三抗的yep液體的培養(yǎng)基中，28℃，12-16h，培養(yǎng)，200rpm。(2)從上述菌液里面吸出5ml再次放到含三抗yep液體的培養(yǎng)基中，od600達(dá)到0.4～0.6。將液體倒入50ml大的離心管，4℃，4700rpm，10min離心，棄上清，用槍頭吸出殘余液，加入mr液體培養(yǎng)基100ml，重懸菌體，220rpm，28℃振蕩培養(yǎng)2h，即可獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化侵染液。(3)浸染：選取長(zhǎng)勢(shì)新鮮的煙草嫩葉，將葉子用提前滅菌的打孔器打成直徑5mm的葉盤，放到提前配好的侵染液中，每個(gè)基因大約50片左右，完成后放在搖床上，搖3min左右，80rpm。然后真空抽10min。再在室溫下靜置5-l0min后，放到超凈臺(tái)中倒出葉片，在無(wú)菌濾紙上吹干。放在ms固體培養(yǎng)基，28℃，暗培養(yǎng)2-3d。(4)黑暗培養(yǎng)后，將其放到ms分化培養(yǎng)基(含1mg/l6-ba)上培養(yǎng)，每四天更換一次培養(yǎng)基，直至分化出幼苗。(5)待長(zhǎng)出的分化苗后，將其放置在ms固體培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)。(6)培養(yǎng)幾周好將苗移至含有篩選標(biāo)記的(2mg/lppt)ms固體培養(yǎng)基中，每隔幾天更換一次培養(yǎng)基，直至篩選出抗性苗。(7)將篩選出來(lái)的抗性幼苗從培養(yǎng)箱拿出來(lái)，放在室溫條件下，煉苗幾天，待適應(yīng)后種到小盆中。2.6.4轉(zhuǎn)基因煙草植株的分子檢測(cè)(1)分別提取野生型以及轉(zhuǎn)基因煙草葉片的dna：參照張計(jì)育等設(shè)計(jì)的提取煙草總dna的ctab法(張計(jì)育等,2011)。(2)轉(zhuǎn)基因植株煙草的pcr檢測(cè)對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和野生型葉片rna的提取和反轉(zhuǎn)錄。對(duì)所獲得轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行目的基因的pcr檢測(cè)，檢測(cè)以sh2f/sh2r為引物。正對(duì)照為連到pcambia3300上質(zhì)粒，負(fù)對(duì)照為ddh2o及野生型煙草，以初篩得到9株抗性苗提取的葉片總dna當(dāng)做模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果表明：在所得到的轉(zhuǎn)基因抗性苗中，轉(zhuǎn)shhxt2煙草中9株可以得到到與正對(duì)照條帶大小一致的目的片段，野生型煙草和假陽(yáng)性苗都未擴(kuò)增到目的條帶(圖15)。將擴(kuò)增到的條帶純化、測(cè)序，證明是目的基因的序列，這說(shuō)明該目的基因整合到煙草基因組中。(3)冷脅迫處理轉(zhuǎn)基因煙草選取葉齡相同且長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因煙草的一個(gè)株系小苗轉(zhuǎn)入ms固體培養(yǎng)基中28℃，16h/8h(光照/黑暗)，光照強(qiáng)度3000lx，恢復(fù)培養(yǎng)兩天，然后放入4℃，16h/8h(光照/黑暗)，光照強(qiáng)度為3000lx條件下進(jìn)行冷脅迫。冷脅迫0d，5d，10d，15d，20d后進(jìn)行取樣，每次取樣9株植株，3株為一個(gè)重復(fù)混合取樣，3次重復(fù)。每次取樣完成后立即放入液氮中保存。結(jié)果如圖16所示：在0-20d內(nèi)，shhxt2隨處理時(shí)間的增加表達(dá)量也持續(xù)增高，5d時(shí)，shhxt2表達(dá)量開(kāi)始增加，到20d時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，這表明，轉(zhuǎn)shhxt2基因的煙草幼苗遇冷脅迫時(shí)，誘導(dǎo)shhxt2基因上調(diào)來(lái)抵抗冷脅迫，由此分析該基因可能參與輸送糖分，調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓，維持轉(zhuǎn)基因煙草在冷脅迫下的正常生長(zhǎng)。2.7shhxt2基因遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗(1)轉(zhuǎn)基因甘蔗的獲得選擇生長(zhǎng)良好的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)分生組織，切小放在m1培養(yǎng)基上，培養(yǎng)25d左右，直至形成疏松的薄片組織，其分裂能力較強(qiáng)，選為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。放在含有pcbi-shhxt2表達(dá)載體的農(nóng)桿菌里侵染，然后暗培養(yǎng)幾天，移至m2選擇培養(yǎng)基上篩選，待到愈傷周圍長(zhǎng)處小苗。小苗長(zhǎng)出1-2cm后，移至含有ppt抗性的培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選，期間不斷更換培養(yǎng)基，并減掉老苗及變黃的苗，直至獲得10株抗性植株。待到篩選出來(lái)的抗性植株在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好、根系較多時(shí)移至水晶泥中，煉苗幾天后移至盆中，如圖17。(2)轉(zhuǎn)基因植株bar基因的檢測(cè)提取的轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片dna為模板，植物表達(dá)載體pcambia3300-gus上攜帶的抗除草劑基因(bar)設(shè)計(jì)引物bf/br，正對(duì)照為pcbi-shhxt2質(zhì)粒，負(fù)對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因甘蔗葉片dna，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果表明：在所篩選出來(lái)的轉(zhuǎn)基因抗性苗中，都能擴(kuò)增到與正對(duì)照一致的條帶，都約為400bp左右的特異性條帶(圖18)。擴(kuò)增得到的條帶純化、測(cè)序，證明是bar基因序列，這說(shuō)明bar基因已整合到甘蔗基因組中。按envirologixquickstixtmkitfor(bar)cotton試劑盒說(shuō)明書上的步驟進(jìn)行，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因甘蔗中的bar基因編碼的蛋白，結(jié)果表明：篩選得到的轉(zhuǎn)shhxt2甘蔗葉片都能夠檢測(cè)到bar基因的表達(dá)(圖19)，這與bar基因pcr檢測(cè)結(jié)果一致，更進(jìn)一步說(shuō)明bar基因已整合到甘蔗基因組中。(3)shhxt2過(guò)表達(dá)抗性植株pcr檢測(cè)以u(píng)bi啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)上游引物和基因區(qū)設(shè)計(jì)下游引物分別設(shè)計(jì)shhxt2過(guò)表達(dá)抗性植株目的基因檢測(cè)引物，通過(guò)對(duì)ppt篩選過(guò)的抗性植株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，結(jié)果如圖20，表明：在所得到的轉(zhuǎn)基因抗性苗中，轉(zhuǎn)shhxt2甘蔗中有10株可以擴(kuò)增到與正對(duì)照條帶一致的目的片段。其中非轉(zhuǎn)基因甘蔗及假陽(yáng)性植株都未擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段。擴(kuò)增得到的條帶純化、測(cè)序，證明是目的基因的序列，這說(shuō)明shhxt2基因已整合到甘蔗基因組中。以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。sequencelisting<110>中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所<120>一種甘蔗單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白shhxt2基因及其應(yīng)用<130>123456<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>1969<212>dna<213>artificial<220><223>shhxt2基因<400>1gtgatgtgcgatcgcaggaacagtcgtcaccatcgttaagaagatgatacgctgcgctgt60aacgggcggcgggtgcgtcgcttcgtggagcggcgatcggaggtcgccggcggtcaaccc120ttgcagcgtgcggatgccgacgggcaacggtggtgggtggtgcggtggcctgaggtcgcg180ggcggcggatctcgccggcctcgagatggccagcctgcgcggcgtcgtcggggggctctt240ccgcgcgagcccacgctatgggcgcttgcaagccacggccgcagttgaccctgaagatat300tccattggagaaggttcaagttaaatcctcaggacatgttctgccatatgttggcgttgc360ttgtttgggggctattctgtttggttatcatcttggcgtggtcaatggcgcgcttgaata420tctcgcgaaggatcttgggattgctgaaaatgctgtcttgcagggatgggtggttagcac480atccctggctggtgcaacactaggttcttttaccgggggatctttggcagataaatttgg540gcggacaagaacattcatcctggatgcagtcccacttgctctaggtgcattcttgagcgc600aacagctcaagatatccgcaccatgattattggtcggttgcttgctggaattggtattgg660gatctcatctgctcttgtacccctttacatatctgagacctcaccaactgaaattcgtgg720aacacttggttctgttaatcaactttttatctgcattggaattcttgcggctttgttagc780tggattgcctttggcaggaaatcctgcctggtggaggacaatgtttggaattgctgtagt840tccatccgttttgctggctgtaggaatggccttttcgcctgaaagccctcgttggctatt900ccagcaaggaaaggtcattcaagcagaatcagctgtaaaaagactgtatggaaaagaaat960ggttaccgaaattatgtatgatctgagagctagtggccaaagttcttctgagcccgaagc1020tgtctggtttgatcttttcagcaagcgttactggaaagttgtgagtgtgggggcagcact1080gtttttgttccagcagcttgctggtataaatgccgttgtatattactctacatcggtgtt1140ccgcagtgcaggcattgcatctgatgttgctgctagtgctcttgttggagcagccaatgt1200tttcggcaccatgatcgcatcttctctaatggacaagcaaggaaggaaaagccttctgat1260gacaagcttttctggagtgggtgcttcaatgctactcctagcattgtccttcacctggaa1320agctctggcaccttattctggtactcttgctgttgttggcactgttctgtatgtgctgtc1380ttttgctctaggtgctggtcctgttcctgccctgcttcttcctgaaatatttgcctctag1440aataagggcaaaggctgttgcattatctctaggcatgcactgggtatccaacttctttat1500tggcctgtacttcttgagtgtcgtcaacaagttcgggatcagcaatgtatatttgggatt1560cgcaccagtgtgcgcccttgcagttctttacatagctgggaatgtggtcgagaccaaggg1620gcgatcacttgaagaaattgaacgggaactaagtgtagcagaatgatgtgctgttgctag1680tcatgctgcggcgccgttttggtgattgagaatgcaaccaagcacacagccgagcatcct1740tggagctagagactcttctagtttcatgtagtttcagaaataagcgaacggcaagagtgc1800caatcgtaggtgacctggtgtgtgcagtgaggggttgtgttcgagcagtagtttagctgt1860gcctcccctacccccctgtcatcaatcagaattcagaaacaatgaacccgtcgatgtttc1920tggagataaatttttcgttttttgttctcaaatttcgtcgcttctcgtg1969<210>2<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>2f<400>2cttgacaaattagccatgata21<210>3<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>2r<400>3tgttttgcattgcatacta19<210>4<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2gf<400>4ggccatggatgcgctgatacgctgtaacg29<210>5<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2gr<400>5ggactagcctttctgctacagttcgttca29<210>6<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2pf<400>6ggggatccatgcgctgatacgctgtaacg29<210>7<211>29<212>dna<213>artificial<220><223>sh2pr<400>7gggtcgacctttctgctacagttcgttca29<210>8<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>sh2f1<400>8tcgttaagaagatgatac18<210>9<211>17<212>dna<213>artificial<220><223>sh2r1<400>9tagtttcatgtagtttg17<210>10<211>28<212>dna<213>artificial<220><223>sh2f2<400>10ggggatcgatacatcgctcgctgtaacg28<210>11<211>31<212>dna<213>artificial<220><223>sh2r2<400>11gggagctctcactgctttaacacgttcccgt31<210>12<211>4821<212>prt<213>artificial<220><223>shhxt2蛋白<400>12metileargcysalavalthrglyglyglycysvalalasertrpser151015glyaspargargserproalavalasnprocysservalargmetpro202530thrglyasnglyglyglytrpcysglyglyleuargserargalaala354045aspleualaglyleuglumetalaserleuargglyvalvalglygly505560leupheargalaserproargtyrglyargleuglnalathralaala65707580valaspprogluaspileproleuglulysvalglnvallysserser859095glyhisvalleuprotyrvalglyvalalacysleuglyalaileleu100105110pheglytyrhisleuglyvalvalasnglyalaleuglutyrleuala115120125lysaspleuglyilealagluasnalavalleuglnglytrpvalval130135140serthrserleualaglyalathrleuglyserphethrglyglyser145150155160leualaasplyspheglyargthrargthrpheileleuaspalaval165170175proleualaleuglyalapheleuseralathralaglnaspilearg180185190thrmetileileglyargleuleualaglyileglyileglyileser195200205seralaleuvalproleutyrilesergluthrserprothrgluile210215220argglythrleuglyservalasnglnleupheilecysileglyile225230235240leualaalaleuleualaglyleuproleualaglyasnproalatrp245250255trpargthrmetpheglyilealavalvalproservalleuleuala260265270valglymetalapheserprogluserproargtrpleupheglngln275280285glylysvalileglnalagluseralavallysargleutyrglylys290295300glumetvalthrgluilemettyraspleuargalaserglyglnser305310315320sersergluproglualavaltrppheaspleupheserlysargtyr325330335trplysvalvalservalglyalaalaleupheleupheglnglnleu340345350alaglyileasnalavalvaltyrtyrserthrservalpheargser355360365alaglyilealaseraspvalalaalaseralaleuvalglyalaala370375380asnvalpheglythrmetilealaserserleumetasplysglngly385390395400arglysserleuleumetthrserpheserglyvalglyalasermet405410415leuleuleualaleuserphethrtrplysalaleualaprotyrser420425430glythrleualavalvalglythrvalleutyrvalleuserpheala435440445leuglyalaglyprovalproalaleuleuleuprogluilepheala450455460serargileargalalysalavalalaleuserleuglymethistrp465470475480valserasnphepheileglyleutyrpheleuservalvalasnlys485490495pheglyileserasnvaltyrleuglyphealaprovalcysalaleu500505510alavalleutyrilealaglyasnvalvalgluthrlysglyargser515520525leuglugluilegluarggluleuservalalaglu530535540當(dāng)前第1頁(yè)12