本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種能促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的sgrna，還涉及利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的方法。

背景技術(shù)：

植物根系在植物水分和氮素的吸收，碳的存貯以及支撐地上部分等生理活動(dòng)中起著重要作用；同時(shí)，植物根系也是植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的重要功能器官。棉花根系是典型的直根系，包括主根和側(cè)根。側(cè)根的發(fā)育對(duì)于根系的功能有著重要的作用。側(cè)根數(shù)增加，可使根表面積增加，進(jìn)一步促進(jìn)整個(gè)植株的發(fā)育，最終達(dá)到增加棉花纖維產(chǎn)量的目的。尤其在土地干旱或貧瘠條件下，根系的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。因此，增加側(cè)根數(shù)，以及增大根表面積，不僅能擴(kuò)大棉花的可種植面積，使其適應(yīng)在干旱和貧瘠的土地上生長，而且對(duì)提高棉花的纖維產(chǎn)量和纖維品質(zhì)具有重要意義。

精氨酸(arg)是植物體內(nèi)一種重要的氨基酸，它不僅是構(gòu)成蛋白的重要成分和氮素儲(chǔ)藏運(yùn)輸?shù)年P(guān)鍵分子，與植物氮素利用效率密切相關(guān)，而且是合成一氧化氮(no)、脲、多胺等重要分子的前體。no是促進(jìn)根系發(fā)育的重要信號(hào)分子，在植物體內(nèi)，no可由arg經(jīng)一氧化氮合酶(nos)催化合成(correa等.planta,2004,218:900-905)。而nos的活性受精氨酸酶(arg)活性的影響，當(dāng)arg活性增高時(shí)，nos活性降低，原因是它們有著共同的底物arg。在擬南芥中，argah1-1和argah2-1沉默的突變體植物體內(nèi)no含量增加，并且導(dǎo)致側(cè)根和不定根數(shù)增加，突變體植株側(cè)根的數(shù)量較野生型增長了一倍(teresita,plantphysiol,2008,147:1936-1946)。在陸地棉中過表達(dá)水稻精氨酸酶基因(osarg)，使得轉(zhuǎn)基因棉花中no含量降低，并抑制其側(cè)根的生長(meng等.plosone,2015,10(11):e0141530)。

crispr/cas9是一種新型高效的基因編輯技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于特定位點(diǎn)的基因編輯。與之前的鋅指核酸酶(zinc-fingernuclease,zfn)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,talen)基因編輯技術(shù)相比，由于其載體構(gòu)建方法簡單、編輯效率高、操作上更靈活便捷，在水稻、小麥、玉米、高粱、煙草和擬南芥等植物基因修飾研究中已得到廣泛應(yīng)用。

陸地棉(gossypiumhirsutumlinn.)是異源四倍體作物，其染色體包含a和d兩個(gè)染色體組，大多數(shù)基因?yàn)槎嗫截?。棉花精氨酸酶基因是棉花氮素利用相關(guān)的重要基因，該基因在陸地棉染色體上存在兩個(gè)拷貝(在a和d兩個(gè)染色體組中各一個(gè)拷貝)，兩個(gè)拷貝的基因序列同源性達(dá)到90％以上。由于棉花中色素和多酚類物質(zhì)含量較多，棉花原生質(zhì)體獲得較難，并且轉(zhuǎn)化效率低，不能有效驗(yàn)證sgrna是否具有引導(dǎo)cas9酶進(jìn)行基因編輯的活性，限制了crispr/cas9技術(shù)在棉花中的應(yīng)用。

經(jīng)檢索，未發(fā)現(xiàn)利用crispr/cas9技術(shù)調(diào)控棉花側(cè)根發(fā)育的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種能促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的crispr/cas9系統(tǒng)的靶標(biāo)序列。

本發(fā)明另一目的在于提供上述靶標(biāo)序列在抑制作物精氨酸酶基因表達(dá)上的用途。

本發(fā)明第三目的在于提供上述靶標(biāo)序列在促進(jìn)作物側(cè)根發(fā)育上的用途

本發(fā)明第四目的在于提供一種能促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的sgrna。

本發(fā)明地五目的在于提供上述sgrna在抑制作物精氨酸酶基因表達(dá)上的用途

本發(fā)明第六目的在于提供上述sgrna在促進(jìn)作物側(cè)根發(fā)育上的用途。

本發(fā)明第七目的在于提供一種crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體。

本發(fā)明第八目的在于提供利用上述sgrna促進(jìn)棉花側(cè)根生長發(fā)育的方法。

本發(fā)明第九目的在于提供一種側(cè)根數(shù)多的棉花品種的育種方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種能促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的crispr/cas9系統(tǒng)的靶標(biāo)序列，所述的靶標(biāo)序列為sgrna1或/和sgrna2；其中所述的sgrna1由seqidno.1所示的核苷酸序列組成；所述的sgrna2由seqidno.2所示的核苷酸序列組成；其所述序列如下：

sgrna1：5’-tcttacccttattcgggaga-3’(seqidno.1)；

sgrna2：5’-ctttgccctctcccgaataa-3’(seqidno.2)。

上述靶標(biāo)序列優(yōu)選為sgrna1。

本發(fā)明還提供了上述靶標(biāo)序列在抑制作物精氨酸酶基因表達(dá)上的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述靶標(biāo)序列在促進(jìn)作物側(cè)根發(fā)育上的應(yīng)用。

所述的靶標(biāo)序列是指sgrna1或sgrna2；其中所述的sgrna1由seqidno.1所示的核苷酸序列組成；所述的sgrna2由seqidno.2所示的核苷酸序列組成。

所述的作物是指棉花、大豆或油菜等直根系作物。

所述的棉花是指陸地棉(gossypiumhirsutumlinn.)；如r18等。

所述的靶標(biāo)序列sgrna1和sgrna2均來自棉花精氨酸酶基因(gharg)第一個(gè)外顯子。

本發(fā)明還提供了一種能促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的sgrna，其靶標(biāo)序列為sgrna1或/和sgrna2；其中所述的sgrna1由seqidno.1所示的核苷酸序列組成；所述的sgrna2由seqidno.2所示的核苷酸序列組成。

所述的sgrna包括靶標(biāo)序列和與cas9酶結(jié)合的通用核酸序列。所述的靶標(biāo)序列是指sgrna1或sgrna2。

本發(fā)明還提供了上述sgrna在抑制作物精氨酸酶基因表達(dá)上的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述sgrna在促進(jìn)作物側(cè)根發(fā)育上的應(yīng)用。

所述的sgrna的靶標(biāo)序列為sgrna1或sgrna2。

所述的作物是指棉花、大豆或油菜等直根系作物。

所述的棉花是指陸地棉(gossypiumhirsutumlinn.)；如r18等。

本發(fā)明還提供了含有上述sgrna的表達(dá)盒，包括在靶標(biāo)序列的上游添加煙草ntu6啟動(dòng)子，在靶標(biāo)序列的下游添加crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)中通用的與cas9酶結(jié)合的42bp發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列以及40bp終止子；所述的靶標(biāo)序列是指sgrna1或sgrna2。

本發(fā)明還提供了一種crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體(pbigfp-cas9-grna1或pbigfp-cas9-grna2)，該表達(dá)載體由gfp和cas9融合基因的表達(dá)盒與上述含有sgrna的表達(dá)盒同時(shí)插入pbi21植物表達(dá)載體構(gòu)建而成；其中所述的含有sgrna的表達(dá)盒由煙草ntu6啟動(dòng)子和40bpsgrna終止子調(diào)控表達(dá)；所述的gfp和cas9融合基因的表達(dá)盒是將cas9基因與綠色熒光蛋白(gfp)基因融合形成gfp-cas9融合基因，在其兩端各加一個(gè)核定位信號(hào)(nls)序列，融合基因由35s啟動(dòng)子和35s終止子調(diào)控表達(dá)。

本發(fā)明還提供了一種促進(jìn)棉花側(cè)根生長發(fā)育的方法，包括抑制棉花精氨酸酶基因的表達(dá)。

上述方法中所述的抑制棉花精氨酸酶基因表達(dá)是通過對(duì)棉花中精氨酸酶基因進(jìn)行基因編輯實(shí)現(xiàn)的。

上述方法中所述的基因編輯是通過crispr/cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的。

上述方法中所述的crispr/cas9系統(tǒng)中，sgrna的靶標(biāo)序列是sgrna1或sgrna2；所述的sgrna1由seqidno.1所示的核苷酸序列組成；所述的sgrna2由seqidno.2所示的核苷酸序列組成；

sgrna1：5’-tcttacccttattcgggaga-3’(seqidno.1)；

sgrna2：5’-ctttgccctctcccgaataa-3’(seqidno.2)。

所述的棉花精氨酸酶基因的登錄號(hào)分別為:galv01045531和xm_016842747。

上述促進(jìn)棉花側(cè)根生長發(fā)育的方法，包括如下步驟：

(1)設(shè)計(jì)靶標(biāo)序列sgrna1或sgrna2，按照seqidno.1或seqidno.2所示的核苷酸序列分別人工合成靶標(biāo)序列sgrna1或sgrna2；

(2)sgrna表達(dá)盒的構(gòu)建：sgrna表達(dá)盒由煙草ntu6啟動(dòng)子、靶標(biāo)序列(sgrna1或sgrna2)和crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)中通用的42bpcas9酶結(jié)合的發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列以及40bp終止子序列組成；通過分段人工合成單鏈dna片段然后退火形成互補(bǔ)雙鏈dna的方式，將完整的sgrna表達(dá)盒克隆連接于表達(dá)載體上，具體方法為：依據(jù)pbi121的酶切位點(diǎn)，在靶標(biāo)序列sgrna1或sgrna2的5’端添加4個(gè)堿基tcga，分別獲得seqidno.3或seqidno.5所示的核苷酸序列，將seqidno.3或seqidno.5反向互補(bǔ)分別得到sgrna1或sgrna2的反向序列，在其反向序列5’端引入4個(gè)堿基ctag分別獲得序列seqidno.4或seqidno.6，人工合成seqidno.3～6；將seqidno.3和seqidno.4退火，或?qū)eqidno.5和seqidno.6退火，分別形成雙鏈dna片段；

(3)將cas9蛋白基因序列連接到pbi121載體上，并在其序列前插入綠色熒光蛋白(gfp)基因序列，形成gfp-cas9融合基因序列，在其前后兩端各加一個(gè)核定位信號(hào)(nls)序列，由35s啟動(dòng)子和35s終止子啟動(dòng)和終止轉(zhuǎn)錄；

(4)將步驟(2)所得的含有靶標(biāo)序列sgrna的雙鏈dna片段與步驟(3)中所得的gfp-cas9融合基因序列串聯(lián)到同一個(gè)載體上，形成crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體；分別命名為pbigfp-cas9-grna1或pbigfp-cas9-grna2。

(5)將步驟(4)所得的基因編輯表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花遺傳轉(zhuǎn)化，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入棉花，篩選獲得棉花精氨酸酶基因(gharg)發(fā)生突變而沉默表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，即獲得側(cè)根數(shù)增多的棉花植株。

所述棉花精氨酸酶基因(gharg)的登錄號(hào):galv01045531和xm_016842747)；所述gharg是指棉花中編碼精氨酸酶的基因。

本發(fā)明還提供一種增加棉花側(cè)根數(shù)的方法，包括抑制棉花中精氨酸酶基因(gharg)的表達(dá)。

本發(fā)明還提供一種側(cè)根數(shù)多的棉花品種的育種方法，以上述方法獲得的側(cè)根數(shù)多的棉花品種為親本之一，通過雜交或回交的方法，在后代中選擇側(cè)根數(shù)多的材料，選擇4～5代，即可獲得新的側(cè)根數(shù)多的棉花品種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明分別利用棉花精氨酸酶基因(gharg)第一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)獲得兩個(gè)sgrna(其靶標(biāo)序列為sgrna1或sgrna2)，單獨(dú)或兩個(gè)sgrna組合使用均可以實(shí)現(xiàn)對(duì)棉花基因組中精氨酸酶基因進(jìn)行基因編輯，造成移碼突變，從而敲除精氨酸酶基因。與野生型相比，本發(fā)明獲得的gharg定點(diǎn)編輯棉花株系側(cè)根數(shù)顯著增加，根表面積增大，no含量增加，提高了棉花對(duì)氮素和其他營養(yǎng)的吸收和利用，本發(fā)明對(duì)于提高棉花纖維產(chǎn)量和質(zhì)量、以及提高棉花的抗逆性均有重要意義。

附圖說明

圖1.本發(fā)明靶標(biāo)位點(diǎn)序列(sgrna1和sgrna2)示意圖。

圖2.pbigfp-cas9-sgrna1/sgrna2表達(dá)載體示意圖。

圖3.部分轉(zhuǎn)化pbigfp-cas9-sgrna1愈傷系編輯效率檢測(cè)電泳圖譜；其中1-15為轉(zhuǎn)化pbigfp-cas9-sgrna1的愈傷系，wt為野生型。

圖4.部分轉(zhuǎn)化pbigfp-cas9-sgrna2愈傷系編輯效率檢測(cè)電泳圖譜；其中1-15為轉(zhuǎn)化pbigfp-cas9-sgrna2的愈傷系，wt為野生型。

圖5.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株在高氮(hn)條件下的根系掃描圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

圖6.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株在低氮(ln)條件下的根系掃描圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

圖7.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株在高氮(hn)和低氮(ln)條件下側(cè)根數(shù)測(cè)定結(jié)果的柱形圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

圖8.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株在高氮(hn)和低氮(ln)條件下根表面積測(cè)定結(jié)果柱形圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

圖9.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株精氨酸酶活性測(cè)定柱形圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

圖10.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株no含量測(cè)定柱形圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

圖11.轉(zhuǎn)pbigfp-cas9-sgrna1的t1代植株nos活性測(cè)定柱形圖；其中wt為野生型，l24為t1代植株材料，l28為t1代植株材料。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋和說明，但不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。

實(shí)施例1棉花精氨酸酶(arg)基因gharg靶標(biāo)序列的獲得

利用ncbi在線數(shù)據(jù)庫查找棉花精氨酸酶基因gharg并下載，依據(jù)wagnerjc等(naturemethods,2014,11(9):915-8)sgrna設(shè)計(jì)方法，在棉花精氨酸酶(gharg)基因第一個(gè)外顯子序列設(shè)計(jì)靶標(biāo)序列，根據(jù)靶向位點(diǎn)、錯(cuò)配堿基數(shù)、錯(cuò)配位置等進(jìn)行優(yōu)化，共獲得兩個(gè)靶點(diǎn)序列，分別命名為sgrna1和sgrna2(圖1)。

sgrna1：5’-tcttacccttattcgggaga-3’(seqidno.1)；

sgrna2：5’-ctttgccctctcccgaataa-3’(seqidno.2)。

實(shí)施例2、crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)表達(dá)載體構(gòu)建

按照如下方法進(jìn)行：

(1)在實(shí)施例1中所得的sgrna1序列的3’端添加煙草ntu6啟動(dòng)子，5’端添加與cas9酶結(jié)合的發(fā)卡結(jié)構(gòu)和終止子序列，組合成完整的表達(dá)盒。根據(jù)載體pbi121的酶切位點(diǎn)，在表達(dá)盒的5’端引入額外的4個(gè)堿基tcga獲得序列3(見seqidno.3)，將序列3(seqidno.3)反向互補(bǔ)得到sgrna1的反向序列，在其反向序列5’端引入4個(gè)堿基ctag，獲得序列4(見seqidno.4)。

序列3：

5’-tcgacatagcgattgtcttacccttattcgggagagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt-3’(seqidno.3)

序列4:

5’-ctagaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaactctcccgaataagggtaagacaatcgctatg-3’(seqidno.4)

按照上述同樣方法，獲得sgrna2靶標(biāo)序列的相應(yīng)序列5(seqidno.5)和序列6(seqidno.6)

序列5:

5’-tcgacatagcgattgctttgccctctcccgaataagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttt-3’(seqidno.5)

序列6:

5’-ctagaaaaaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaacttattcgggagagggcaaagcaatcgctatg-3’(seqidno.6)

(2)依據(jù)步驟(1)中設(shè)計(jì)的序列，送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列3(seqidno.3)和序列4(seqidno.4)。然后將序列3和序列4退火合成雙鏈dna片段。具體操作如下：序列3和序列4的dna單鏈加水溶解至10μm，各取5μl于pcr管中，運(yùn)行pcr程序，95℃5min；90℃1min，85℃1min；80℃1min；75℃1min；70℃1min；隨即放入65℃水中自然冷卻至室溫，最終獲得包含sgrna1的雙鏈dna片段，將所得雙鏈dna稀釋30倍備用。

按照上述同樣方法，將序列5和序列6退火，獲得有關(guān)sgrna2靶標(biāo)序列相應(yīng)的雙鏈dna片段。

(3)pbi21gfp-cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

本發(fā)明所用的cas9酶為ⅱ型cas核酸酶，為了能夠在活細(xì)胞中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)cas9酶表達(dá)量，本發(fā)明將gfp基因與cas9基因融合表達(dá)。為了能夠提高gfp：cas融合蛋白核定位效率，在融合基因兩端分別加一個(gè)核定位信號(hào)(nls)序列。包含兩個(gè)nls的融合基因orf，由35s啟動(dòng)子和35s終止子調(diào)控表達(dá)。利用ecorⅰ和hindⅲ雙酶切融合基因表達(dá)盒和pbi21，連接后獲得pbi21gfp-cas9載體。反應(yīng)體系為：融合基因表達(dá)盒1μl，pbi121載體3μl，t4連接酶(購自neb公司)1μl，t4連接酶buffer1μl,h2o4μl。16℃過夜連接，得連接產(chǎn)物pbi21gfp-cas9載體。

將100μle.coli感受態(tài)(購自全式金公司trans1-t1感受態(tài))加入連接體產(chǎn)物中，冰浴30min，42℃熱激45s，迅速置于冰上3min。加入500μl液體lb培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)1小時(shí)使菌體復(fù)蘇。用移液器接入含有kan抗性的固體lb培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

挑取單菌落于500ul含有50ng/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)8h(37℃，250rpm)。隨機(jī)挑取5個(gè)卡那霉素抗性陽性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果中g(shù)fp:cas9融合基因表達(dá)盒正確的克隆子，即為pbi21gfp-cas9表達(dá)載體。

(4)crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體構(gòu)建

將步驟(2)中得到的雙鏈dna片段與步驟(3)pbigfp-cas9載體用kpni和apai進(jìn)行雙酶切，并用t4連接酶進(jìn)行連接，獲得pbigfp-cas9-sgrna1表達(dá)載體。反應(yīng)體系為：dna片段1μl，pbigfp-cas9表達(dá)載體3μl，t4連接酶(購自neb公司)1μl，t4連接酶buffer1μl,h2o4μl。16℃過夜連接，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

取100μle.coli感受態(tài)(購自全式金公司trans1-t1感受態(tài))加入鏈接產(chǎn)物中，冰浴30min，42℃熱激45s，迅速置于冰上3min。加入500μl液體lb培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)1小時(shí)使菌體復(fù)蘇。用移液器接入含有kan抗性的固體lb培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

挑取單菌落于500ul含有50ng/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)8h(37℃，250rpm)。隨機(jī)挑取5個(gè)卡那霉素抗性陽性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果中g(shù)fp:cas9融合基因表達(dá)盒和sgrna1序列正確的克隆子，即為crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體，命名為pbigfp-cas9-sgrna1。

按照上述同樣方法，獲得靶標(biāo)序列sgrna2的crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體pbigfp-cas9-sgrna2。

實(shí)施例3、棉花轉(zhuǎn)基因植株的獲得

包括如下步驟：

1、將實(shí)施例2中所得的表達(dá)載體pbigfp-cas9-sgrna1導(dǎo)入農(nóng)桿菌gv3101(農(nóng)桿菌gv3101由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供)，獲得含有基因編輯表達(dá)載體的農(nóng)桿菌。具體步驟如下：將實(shí)施例1中所得的10ng表達(dá)載體pbigfp-cas9-sgrna1加入100μl農(nóng)桿菌gv3101感受態(tài)中，冰上放置30min，液氮冷凍10min，42℃熱激90s，冰上放置3min；加入700μl液體yeb培養(yǎng)基，28℃、200rpm搖床培養(yǎng)6小時(shí)使菌體復(fù)蘇。用移液器接入含有壯觀霉素和卡納霉素抗性的固體yeb培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天。挑取單菌落于500ul含有50ng/l卡那霉素的yeb液體培養(yǎng)基中于28℃、250rpm震蕩培養(yǎng)10h。隨機(jī)挑取5個(gè)卡那霉素抗性陽性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序結(jié)果中g(shù)fp:cas9融合基因表達(dá)盒和sgrna1或sgrna2序列正確的克隆子，即為含有crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體的農(nóng)桿菌。

按照上述同樣的方法，將表達(dá)載體pbigfp-cas9-sgrna2導(dǎo)入農(nóng)桿菌gv3101，獲得含有sgrna2的基因編輯表達(dá)載體的農(nóng)桿菌。

2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

以陸地棉r(nóng)18(r18由陸地棉coker312選育獲得，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供)為受體，以步驟1中所得的含有pbigfp-cas9-sgrna1農(nóng)桿菌侵染棉花下胚軸，通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因t0代再生植株。其具體步驟如下：

(1)取飽滿、干凈的r18棉花種子，用無水乙醇消毒5min，然后用無菌ddh2o漂洗一遍；之后用30％雙氧水消毒4-6小時(shí)，再用無菌ddh2o漂洗3次，去除多余的雙氧水。將種子浸泡在無菌水中過夜萌發(fā)，去除種皮并播種于ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周。

(2)挑取含有crispr/cas9基因編輯表達(dá)載體的農(nóng)桿菌單菌落于500ul含有50ng/l卡那霉素的yeb液體培養(yǎng)基中，于28℃、250rpm下震蕩培養(yǎng)10h。在4℃、1500rpm下離心，收集菌體，并用ms液體培養(yǎng)基重懸，獲得od600nm＝0.3-0.6的農(nóng)桿菌懸液。用于侵染棉花下胚軸。

(3)取步驟(1)中棉花幼苗的下胚軸，切成5mm左右小段，用步驟(2)中所得的農(nóng)桿菌懸液侵染30min，于添加200mg/l卡納霉素和500mg/l羧卞青霉素的1/2ms培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選，長出的愈傷組織在添加200mg/l卡那霉素的1/2ms培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，一個(gè)月繼代一次，直至胚性愈傷組織長出幼芽。取健壯幼芽轉(zhuǎn)移至1/2ms固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周誘導(dǎo)生根。發(fā)育完整的再生苗經(jīng)過煉苗后移至土壤中繼續(xù)生長。

按照上述步驟(1)、(2)、(3)所述方法，以陸地棉r(nóng)18為受體，以步驟1中所得的含有pbigfp-cas9-sgrna2農(nóng)桿菌侵染棉花下胚軸，通過組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因t0代再生植株。

實(shí)施例4、基因編輯效率檢測(cè)鑒定

1、愈傷組織gharg基因編輯效率檢測(cè)鑒定

(1)實(shí)施例3中的農(nóng)桿菌侵染一個(gè)月后，分別隨機(jī)取15個(gè)其轉(zhuǎn)化pbigfp-cas9-sgrna1的愈傷組織，提取基因組dna用于檢測(cè)編輯效率。以基因編輯位點(diǎn)上下游分別設(shè)計(jì)正向和反向引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，由于兩個(gè)編輯位點(diǎn)(sgrna1和sgrna2)在基因組距離非常近，所以設(shè)計(jì)一對(duì)引物(fp和rp)即可以同時(shí)鑒定兩個(gè)編輯位點(diǎn)的編輯效率。當(dāng)基因組發(fā)生基因編輯而導(dǎo)致染色體發(fā)生斷裂，同時(shí)由于細(xì)胞內(nèi)非同源重組修復(fù)導(dǎo)致靶標(biāo)位點(diǎn)基因組序列發(fā)生插入或者缺失突變而改變了靶標(biāo)位點(diǎn)的基因組序列，進(jìn)一步改變了pcr產(chǎn)物序列。同時(shí)，由于靶標(biāo)位點(diǎn)序列含有一個(gè)bsli酶切位點(diǎn)，所以當(dāng)基因發(fā)生編輯時(shí)，pcr產(chǎn)物中bsli酶切位點(diǎn)也發(fā)生了突變，導(dǎo)致pcr產(chǎn)物不能被bsli酶消化。

所述的引物fp和rp如下：

fp:

5’-caaagcacgcacaagttctccctagtaacaatattattattataaatttcaaaagggttaaaatggaatggaaaaaaac-3’(seqidno.7)；

rp：5’-gagactgggactgttcatacaaggcacg-3’(seqidno.8)。

其中pcr反應(yīng)體系(50ul)：dntp3ul；buffer5ul；fp2ul；rp2ul；模版2ul；tag1ul；ddh2o35ul。pcr反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。

(2)愈傷組織基因編輯效率檢測(cè)。取步驟(1)中的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，用bsli進(jìn)行酶切；然后將所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以酶切和沒有酶切的r18非轉(zhuǎn)基因基因組pcr產(chǎn)物為對(duì)照，對(duì)比分析電泳圖中不同愈傷組織基因組dnapcr產(chǎn)物中酶切條帶和不能酶切的條帶光密度比值計(jì)算基因編輯效率，即基因編輯效率為單一樣本中不能酶切條帶光密度值與不能酶切條帶和酶切開條帶光密度值之和的比值。

(3)愈傷組織基因編輯類型檢測(cè)。取步驟(1)中得到的不同樣本pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ta克隆后，選20-30個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因編輯表達(dá)載體pbi-cas9-grna1在目標(biāo)靶點(diǎn)均成功的發(fā)生了編輯。酶切pcr產(chǎn)物電泳圖光密度分析表明，隨機(jī)抽取的15個(gè)sgrna1愈傷組織編輯位點(diǎn)的編輯效率為10～98％(見圖3)。sgrna1的編輯效率高，15個(gè)愈傷系中有5個(gè)(見圖3，sgrna1泳道5，6，7，9，14)編輯效率達(dá)到80-98％。選擇sgrna1的愈傷系進(jìn)行繼代并獲得再生植株。

同時(shí)，pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明所選15個(gè)愈傷系中的gharg均有編輯，并且在a和d兩個(gè)染色體組上gharg的均被編輯，證明本發(fā)明的sgrna是有效的。然而由于愈傷組織可能并非由同一個(gè)細(xì)胞分裂而來，所以編輯類型較復(fù)雜，包括堿基的插入和刪除等多種類型，同時(shí)也有未編輯的野生型序列。

按照上述同樣方法，對(duì)轉(zhuǎn)化pbigfp-cas9-sgrna2的愈傷組織進(jìn)行基因編輯效率的檢測(cè)，結(jié)果(見圖4)sgrna2中只有3個(gè)愈傷系(圖4，sgrna2泳道1，7和13)的基因編輯效率超過70％。

2、對(duì)t0代再生植株的鑒定

t0代再生植株line1-15，均來自sgrna1轉(zhuǎn)化的愈傷系經(jīng)過繼代產(chǎn)生的再生苗，提取再生植株的dna，按照上述步驟1的方法進(jìn)行鑒定。

提取t0代再生植株line1-15基因組dna進(jìn)行pcr檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果表明陸地棉r(nóng)18a和d兩個(gè)染色體組上的精氨酸酶基因gh_a05g2143和gh_d05g2397均被編輯。序列比對(duì)分析表明兩個(gè)基因編輯后，產(chǎn)生了不同的序列突變，導(dǎo)致在同一個(gè)轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)產(chǎn)生多個(gè)不同的基因編輯類型。

3、對(duì)t1代植株的鑒定

分別對(duì)t0代編號(hào)為line6和line9的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行田間自交選育，獲得t1代植株材料l24和l28。按照步驟1所述的的方法對(duì)不同轉(zhuǎn)基因植株基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，測(cè)序分析靶點(diǎn)的編輯類型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，t1代植株中兩個(gè)拷貝的精氨酸酶基因gh_a05g2143和gh_d05g2397均發(fā)生了基因編輯，且基因編輯類型比親本t0代材料明顯減少，證明crispr/cas9基因編輯可以遺傳，其基因編輯類型也隨著自交代數(shù)的增加而減少并趨于純合。

實(shí)施例5t1代植株的根系表型的觀測(cè)試驗(yàn)

1、根系表型的分析

取t1代植株l24和l28的種子以及對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因r18)種子，用無水乙醇消毒5min，然后用無菌ddh2o漂洗一次，再用30％雙氧水消毒4-6小時(shí)，接著用無菌ddh2o漂洗3次，將種子浸泡在無菌ddh2o中過夜，待種子萌發(fā)后去除種皮，分別于低氮培養(yǎng)基ln(不含氮1/2ms培養(yǎng)基)和高氮培養(yǎng)基hn(1/2ms培養(yǎng)基添加2.475g/lnh4no3)上培養(yǎng)，在28℃，光照16h和黑暗8h條件下培養(yǎng)一周。培養(yǎng)一周后，隨機(jī)挑取l24和l28以及野生型每個(gè)株系取三棵幼苗作為重復(fù)實(shí)驗(yàn)，將根系從培養(yǎng)基中取出，用水沖去殘留培養(yǎng)基，利用winrhizo植物根系掃描系統(tǒng)掃描根系圖片并計(jì)算側(cè)根數(shù)及根表面積。

結(jié)果(見圖5、圖6、圖7和圖8)在不同氮素含量水平下，l24和l28轉(zhuǎn)基因棉花植株的側(cè)根數(shù)和根表面積均較野生型有所增加。在高氮條件下，l24和l28的側(cè)根數(shù)分別比野生型增加了25％和46％，根表面積分別增加了52％和74％。表明轉(zhuǎn)基因棉花中由于基因編輯導(dǎo)致精氨酸酶基因發(fā)生突變，抑制了精氨酸酶基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)棉花側(cè)根數(shù)和根表面積的增加。

實(shí)施例6t1代植株的精氨酸酶活性檢測(cè)試驗(yàn)

利用精氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒(sigma公司)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉花中精氨酸酶活性。其檢測(cè)原理為：精氨酸酶催化精氨酸生成尿素和鳥氨酸，尿素可與底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過測(cè)定產(chǎn)物的od值來計(jì)算精氨酸酶的活性，具體步驟如下：

(1)取t1代植株l24和l28及野生型植株根0.1g，用液氮研磨成粉末，加入1ml細(xì)胞和組織裂解液(含磷酸酶抑制劑)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；然后在13000×g離心10min，取上清得到酶粗提取液；

(2)在96孔板中加入反應(yīng)液(精氨酸和mn離子溶液)10μl，加入40μl酶粗提取液，37℃反應(yīng)4h，避光。以未加底物精氨酸的酶液作為陰性對(duì)照，分別加入50μl1mm標(biāo)準(zhǔn)工作液和50μl水作為陽性對(duì)照和空白對(duì)照。

(3)加入與尿素反應(yīng)的顯色試劑200μl，并補(bǔ)加10μl反應(yīng)液，室溫下顯色1h。

(4)使用酶標(biāo)儀讀取430nm的od值(a430)。精氨酸酶的計(jì)算公式為：

精氨酸酶活性＝(a樣品-a陰性)*(1mm×50×10³)/(a標(biāo)準(zhǔn)-a水)*v*t

其中t＝反應(yīng)時(shí)間；v＝樣品體積；1mm＝尿素標(biāo)準(zhǔn)品濃度。

結(jié)果(見圖9)轉(zhuǎn)基因植株l24和l28中的精氨酸酶活性較野生型顯著降低，說明t1代植株l24和l28中的精氨酸酶基因的表達(dá)受到了抑制。

實(shí)施例7t1代植株中no含量和nos活性檢測(cè)試驗(yàn)

(一)no含量檢測(cè)：

利用硝酸鹽/亞硝酸(nox)鹽檢測(cè)試劑盒(sigma公司)測(cè)定轉(zhuǎn)基因材料中硝酸鹽和亞硝酸(nox)的含量。由于no在植物體內(nèi)極不穩(wěn)定，迅速的轉(zhuǎn)換成no^-3和no2^-(nox)，因此常用測(cè)量nox的含量來表示no的含量，測(cè)定方法便是griess實(shí)驗(yàn)方法。其利用磺胺與no2的耦合產(chǎn)物在540nm或570nm顯色的吸光度值與no含量成線性關(guān)系來計(jì)算no的含量。具體步驟如下：

(1)取t1代轉(zhuǎn)基因植株l24和l28及野生型植株根0.1g，用液氮研磨成粉末，加入1ml細(xì)胞和組織裂解液(含磷酸酶抑制劑)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，然后在13000×g離心10min，取上清。

(2)以0.1nmol/μl濃度nano3標(biāo)準(zhǔn)品分別配制濃度為0，0.0125，0.05，0.1nmol/μl的標(biāo)準(zhǔn)液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(3)96孔板中加入樣品格80μl，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品孔均加入硝酸還原酶，25℃反應(yīng)2h，將溶液中no^-3全部還原為no2^-。

(4)加入griess試劑a50μl，25℃反應(yīng)5min；在加入griess試劑b50μl，25℃反應(yīng)10min，使用酶標(biāo)儀測(cè)量540nm吸光度值(a450)。

(5)計(jì)算時(shí)，將a450帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出nox^-(no2^-+no3^-)便是no濃度。

(二)、t1代轉(zhuǎn)基因材料中一氧化氮合成酶(nos)活性測(cè)定：

利用nos活性檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)t1代轉(zhuǎn)基因材料中nos的活性。nos可將l-精氨酸分解為l-鳥氨酸和no，通過一種與no結(jié)合的熒光染料daf-fmda，測(cè)定生成no含量，從而計(jì)算出nos相對(duì)活性。具體步驟如下：

(1)取t1代轉(zhuǎn)基因植株l24和l28及野生型植株根0.1g，用液氮研磨成粉末，加入1ml細(xì)胞和組織裂解液(含磷酸酶抑制劑)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，然后在13000×g離心10min，取上清。

(2)96孔板中加入100μl樣品提取液，再加入100μlnos檢測(cè)緩沖液(含有nos檢測(cè)緩沖液，50μl；超純水，39.8μl；精氨酸溶液，5μl；nadph，5μl；daf-fmda，0.2μl)，混勻后于37℃孵育1h。

(3)使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，以沒有樣品提取液的孔為空白對(duì)照，激發(fā)波長495nm，發(fā)射波長515nm。以野生型nos活性為1，則轉(zhuǎn)基因株系中nos的相對(duì)活性為(rfu轉(zhuǎn)基因-rfu空白)/(rfuwt-rfu空白)

rfu轉(zhuǎn)基因?yàn)檗D(zhuǎn)基因株系樣品的吸光度值；rfuwt為野生型樣品的吸光度值。

結(jié)果表明(見圖10和圖11)轉(zhuǎn)基因植株l24和l28的根中no含量較野生型顯著增加，nos活性提高，證明轉(zhuǎn)基因棉花中精氨酸酶活性的降低使得nos活性提高，促使精氨酸的代謝向著合成no的方向進(jìn)行，而no含量的提高促進(jìn)了植株側(cè)根數(shù)和根表面積的增加，從而達(dá)到促進(jìn)棉花根系發(fā)育的目的。

sequencelisting

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所

<120>一種能促進(jìn)棉花側(cè)根發(fā)育的sgrna及其應(yīng)用

<160>8

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<223>靶標(biāo)序列sgrna1

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ttaacttgctatttctagctctaaaacttattcgggagagggcaaagcaatcgctatg118

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