本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羧化殼聚糖去雜純化的方法及應用。
背景技術(shù)：
殼聚糖又稱聚氨基-d-葡萄糖或甲殼素，其化學名為聚(1,4)-2-氨基-2-脫氧-β-d-葡聚糖，是甲殼素的n-脫乙酰基產(chǎn)物，也是甲殼素最重要的衍生物，它是自然界中唯一存在的堿性多糖。殼聚糖具有生物相容性、無毒、無過敏反應，有很好的吸附性、成膜性、通透性、成纖性、吸濕性和保濕性，廣泛應用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域。
國內(nèi)外眾多研究已經(jīng)證實，殼聚糖具有一定的止血功能，加上它們固有的特性，如無毒、無抗原性，并具有生物相容性、抑菌活性、促進傷口愈合等，賦予其作為止血材料的潛能。但是殼聚糖不溶于水和有機溶劑，只溶于稀酸，導致止血時間長，對于較大出血的效果不理想，限制了臨床上的推廣使用。
因此，需要對殼聚糖進行改性以提高其溶解性。將殼聚糖改性制成它的衍生物，例如水溶性羧化殼聚糖。中國發(fā)明專利(cn103848926a)公開了一種羧化殼聚糖的制備方法和用途。密閉反應器中加入戊二酸酐的二甲亞砜溶液，加熱，放入殼聚糖反應后再置于氫氧化鈉溶液中反應，取出即獲得羧化殼聚糖。但是，羧化殼聚糖在制備過程中，會產(chǎn)生一些雜質(zhì)如反應過程中產(chǎn)生的顆粒物質(zhì)以及本身帶有的蛋白質(zhì)等，如果不去除，會影響其應用效果及生物安全性，如皮內(nèi)刺激試驗會出現(xiàn)陽性等。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羧化殼聚糖去雜純化的方法及應用，使得經(jīng)過純化后的羧化殼聚糖在皮內(nèi)刺激試驗時不會出現(xiàn)陽性反應。
本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為：
一種羧化殼聚糖去雜純化的方法，將羧化殼聚糖溶于naoh或na2co3溶液中攪拌反應，用酸調(diào)ph至中性，之后用微孔膜過濾，納濾膜濃縮，濾液真空干燥，得到純化后的羧化殼聚糖。
上述技術(shù)方案中，naoh或na2co3能夠使得吸附在羧化殼聚糖中的雜質(zhì)脫附；其次，naoh或na2co3也可以與部分雜質(zhì)反應生成沉淀。之后使用微孔膜可以將脫附的雜質(zhì)或者沉淀物質(zhì)(主要為反應過程產(chǎn)生的顆粒、蛋白質(zhì))與濾液分離；繼續(xù)經(jīng)納濾膜濃縮濾液，可以減少干燥時間及有機溶劑的使用；最終干燥得到純化后的羧化殼聚糖，在皮內(nèi)刺激試驗時不會出現(xiàn)陽性反應。
優(yōu)選的，所述naoh或na2co3溶液的摩爾濃度為0.05～0.15mmol/l。進一步優(yōu)選為0.1mmol/l。
優(yōu)選的，所述羧化殼聚糖在溶液中的投料量為質(zhì)量分數(shù)1～10％。進一步優(yōu)選為1～3％。
優(yōu)選的，所述攪拌反應的溫度為35～40℃，攪拌時間25～35min。進一步優(yōu)選，溫度為37℃，攪拌時間30min。
優(yōu)選的，所述微孔膜的孔徑為0.22～5μm。
優(yōu)選的，所述微孔膜的孔徑為0.22～0.5μm。進一步優(yōu)選為0.44μm。
優(yōu)選的，所述真空干燥的溫度為40～100℃。進一步優(yōu)選為60℃。
優(yōu)選的，所述酸為鹽酸。
本發(fā)明提供一種羧化殼聚糖在止血中的應用，所述羧化殼聚糖由上述的方法去雜純化得到。
本發(fā)明還提供一種羧化殼聚糖在制備止血藥物中的應用，所述羧化殼聚糖由上述的方法去雜純化得到。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
采用該去雜純化的方法，能夠?qū)Ⅳ然瘹ぞ厶窃谥苽溥^程中引入的雜質(zhì)或者原料殼聚糖中的雜質(zhì)有效的去除，使得羧化殼聚糖在皮內(nèi)刺激試驗時不會出現(xiàn)陽性反應(如皮膚紅斑及水腫狀況)。
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明。
實施例1
將15g羧化殼聚糖溶于1.5l的0.1mmol/l的naoh溶液中，37℃下攪拌30min，用稀鹽酸調(diào)ph至7.0，過0.44μm的醋酸纖維素濾膜，用30kd的納濾膜濃縮，濾液在60℃下真空干燥，得白色粉狀物11.25g。
實施例2
將12g羧化殼聚糖溶于1.2l的0.1mmol/l的naoh溶液中，35℃下攪拌30min，用稀鹽酸調(diào)ph至7.0，過0.22μm的醋酸纖維素濾膜，用30kd的納濾膜濃縮，濾液在45℃下真空干燥，得白色粉狀物10.2g。
實施例3
將90g羧化殼聚糖溶于3.3l的0.05mmol/l的naoh溶液中，35℃下攪拌30min，用稀鹽酸調(diào)ph至7.0，過0.22μm的醋酸纖維素濾膜，用30kd的納濾膜濃縮，濾液在45℃下真空干燥，得白色粉狀物79.2g。
性能試驗
1、兔子皮內(nèi)刺激試驗
按國家標準gb/t16886.10-2005/iso10993-10:2002進行。
分別精密稱取實施例1純化后的羧化殼聚糖和未純化的羧化殼聚糖各1.00g，加生理鹽水10ml，攪拌均勻，室溫靜置過夜，進行兔子皮內(nèi)0.2ml/點注射，平行注射5個點，記為純化組和未純化組。
對照組注射生理鹽水，0.2ml/點皮內(nèi)注射，平行注射5個點，記為對照組。
注射24h、48h、72h按照皮內(nèi)反應記分系統(tǒng)分別記錄兔子皮膚紅斑及水腫狀況，在72h評分后，分別將每一試驗樣品和溶劑對照的全部紅斑與水腫記分相加，再除以12[2(動物數(shù))×3(觀察期)×2(記分類型)]計算出每一試驗樣品和每一對應溶劑對照的綜合平均記分。如試驗樣品和溶劑對照平均記分之差不大于1.0，則符合試驗要求。
純化后的羧化殼聚糖對兔子皮內(nèi)刺激的影響如表1所示，純化后的羧化殼聚糖的皮內(nèi)紅斑水腫評分0.16，對照組評分0.00，兩組評分差小于1.0，提示純化后的羧化殼聚糖對兔子皮內(nèi)刺激符合要求。
而羧化殼聚糖的皮內(nèi)紅斑水腫評分1.5，對照組評分0.00，兩組評分差大于1.0，提示未純化的羧化殼聚糖對兔子皮內(nèi)刺激不符合要求。
表1羧化殼聚糖對家兔皮內(nèi)刺激的影響
2、大鼠尾靜脈止血和大鼠肝臟止血
將sd大鼠隨機分成3組，純化后的羧化殼聚糖組、未純化的羧化殼聚糖組和空白對照組。用75％酒精棉球不斷刷洗大鼠的尾巴，直到清楚得看見大鼠的靜脈為止，用刀片在尾靜脈處劃一深約1mm的傷痕，自由出血5s后，用三組粉末覆蓋在受傷處，觀察各組產(chǎn)品尾靜脈止血效果。
采用純化后的羧化殼聚糖組、未純化的羧化殼聚糖組和空白對照組。大鼠用10％烏拉糖(1300mg/kg)行腹腔注射麻醉，麻醉后大鼠仰臥固定，逐層打開腹腔，暴露出肝臟，用手術(shù)刀在肝左葉往上1.5cm處劃一深約1mm的刀痕，待自由出血5s后，給藥并計時。另外在肝右葉往上1.5cm處切同樣大小及深度的刀痕，以不用藥時肝止血時間作為空白對照組。
各羧化殼聚糖止血效果如表2所示，純化后的羧化殼聚糖對大鼠尾靜脈、肝臟出血模型的止血時間明顯比對照組和未純化組的短(p＜0.01)。
表2羧化殼聚糖對大鼠尾靜脈及肝臟出血模型的止血作用
注：“*”，與對照組比較，p＜0.05；“**”，與對照組比較，p＜0.01?！埃！?，與未純化的羧化殼聚糖比較，p＜0.05；“＃?！保c對照組比較，p＜0.01。
3、小鼠斷尾止血
距小鼠尾尖2mm處斷尾，當?shù)谝坏窝毫鞒龊?，將小鼠尾巴放入適量止血粉末中，使粉末與小鼠尾尖充分接觸，開始計時，取出尾巴觀察出血情況，以血液不再溢出為血止，并記錄小鼠止血時間。對照組小鼠斷尾出血后任其自由出血至止血為止，作為小鼠斷尾自然止血對照。
表3羧化殼聚糖對小鼠斷尾出血模型的止血作用
注：“*”，與對照組比較，p＜0.05；“**”，與對照組比較“?！?，與未純化的羧化殼聚糖比較，p＜0.05；“＃?！保c對照組比較，p＜0.01。