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鱘魚骨中提取硫酸軟骨素的方法與流程

文檔序號:11276883閱讀:878來源:國知局

本發(fā)明屬于材料加工技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種鱘魚骨中提取分離硫酸軟骨素的方法。



背景技術(shù):

鱘魚類是起源最早的現(xiàn)存脊椎動物類群,鱘魚資源極為豐富,全世界總共有27種鱘魚,在我國便可以找到8種,目前,鱘魚人工養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)在許多國家先后興起,而我國已經(jīng)成為鱘魚養(yǎng)殖第一大國,鱘魚全身都是寶,然而粗放型的加工現(xiàn)狀導(dǎo)致鱘魚這種寶貴資源沒有得到很好的利用。鱘魚全身遍布軟骨,從鱘魚骨中提取硫酸軟骨素,具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與藥用價(jià)值,對鱘魚產(chǎn)業(yè)的深度加工具有極大的促進(jìn)作用。

硫酸軟骨素(chondritinsulfate,chs),有chsa,c和d三種異構(gòu)體,均由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰-d-氨基酸半乳糖組成,只是硫酸基團(tuán)位置不同,chsa在哺乳動物中的骨中含量很高,chsc主要存在于魚類骨中。硫酸軟骨素是一種來源于動物骨骼組織的重要酸性粘多糖——糖胺聚糖,其鈉鹽為白色無定形吸濕粉未,無臭無味,易溶于水,其水溶液呈粘稠性可與陽離子形成多種金屬鹽而發(fā)生沉淀難溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有機(jī)溶劑。硫酸軟骨素遇熱不穩(wěn)定,乙酰基易發(fā)生水解脫落,在酸性條件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。

硫酸軟骨素臨床上主要用于治療神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)炎、耳鳴以及促進(jìn)潰瘍愈合和防止高血脂癥等。隨著其生理功能及生化性質(zhì)的深入研究,發(fā)現(xiàn)它具有凝血和防止血管硬化等活性,對冠心病、心肌梗塞等心血管病的防治有較好的療效,對神經(jīng)細(xì)胞、腎細(xì)胞等具有保護(hù)作用,因此在國外是很流行的保健品添加劑。還對多種細(xì)胞等具有保護(hù)作用還可活化脂解酶,使脂肪降解,因此是防止肥胖的有效物質(zhì)還具有保水性、保膠性和高粘性,可與某些物質(zhì)調(diào)制成化妝品用于保護(hù)皮膚的健美。硫酸軟骨素是結(jié)締組織中天然存在的成分,能夠結(jié)合水分子用于潤滑和支撐關(guān)節(jié),使關(guān)節(jié)活動自如,減輕關(guān)節(jié)疼痛,在短期內(nèi)服用沒有明顯的副作用。2002年國家衛(wèi)生部頒布了硫酸軟骨素原料以及其注射液、滴眼液、硫酸軟骨素鈉原料及其膠囊的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)。

目前硫酸軟骨素的提取主要有中性鹽法、堿法和酶法。中性鹽法是在一定的離子強(qiáng)度下,骨中的蛋白質(zhì)與硫酸軟骨素發(fā)生分離而沉淀,中性鹽法提取的硫酸軟骨素產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn),但是產(chǎn)率較低,造成原材料的浪費(fèi),對經(jīng)濟(jì)效益有影響;堿法是在堿性條件下,連接硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)的o-糖苷鍵在強(qiáng)堿作用下發(fā)生β-消去反應(yīng),使糖肽鍵斷裂,硫酸軟骨素從蛋白多糖中釋放出來,堿法提取的產(chǎn)品產(chǎn)率高,但是樣品溶液混濁,耗時(shí)長,污染嚴(yán)重,產(chǎn)品純度低;酶法是利用蛋白酶的特性,使膠原蛋白和蛋白聚糖中的核蛋白等水解成多肽、氨基酸,達(dá)到提取硫酸軟骨素目的,酶法條件溫和,產(chǎn)品純度高,但單一酶無法實(shí)驗(yàn)硫酸軟骨素的全部水解,產(chǎn)率略低于堿法。因此,產(chǎn)用堿-雙酶結(jié)合法,其中堿提取過程是提高硫酸軟骨素產(chǎn)率的關(guān)鍵,酶水解過程是提高硫酸軟骨素產(chǎn)品純度的關(guān)鍵。

鱘魚骨是提取硫酸軟骨素的理想材料,鱘魚骨中硫酸軟骨素的含量高于鯊魚骨中硫酸軟骨素的含量。從鱘魚骨中提取硫酸軟骨素是對鱘魚骨的綜合應(yīng)用,能夠極大的促進(jìn)鱘魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明目的在于提供一種鱘魚骨中提取分離硫酸軟骨素的方法,進(jìn)一步提高硫酸軟骨素的產(chǎn)率。

為達(dá)到上述目的,采用技術(shù)方案如下:

鱘魚骨中提取硫酸軟骨素的方法,包括以下步驟:

1)鱘魚骨的預(yù)處理:以鱘魚骨切片為原料,放入水浴鍋中翻煮,去除肌肉、殘余組織,撈起用naoh溶液浸泡然后洗至中性,接著用異丙醇溶液浸泡然后洗凈,粉碎、干燥備用;

2)堿解:將預(yù)處理的粉料鱘魚骨加入naoh溶液,在20~50℃下反應(yīng)2~3h得鱘魚骨的堿解液;

3)鹽處理:將鱘魚骨堿解液中加入nacl,在30~50℃下間歇攪拌2~3h得鱘魚骨的鹽解液;

4)雙酶水解:所得鹽解液調(diào)節(jié)ph值至8,加入胰蛋白酶與木瓜蛋白酶組成的雙酶進(jìn)行酶解,酶解完成后在沸水中滅活,離心分離取上清液;

5)三氯乙酸沉降蛋白:向上清液中加入三氯乙酸,混勻后低溫靜置,離心收集上清液,調(diào)節(jié)ph至7.5~8.0;

6)活性炭脫色:加入活性炭于吸附,抽濾,取濾液;

7)乙醇沉淀:將濾液中加入無水乙醇,有沉淀產(chǎn)生,低溫靜置,除去上層液,取沉淀;

8)透析、冷凍干燥:將沉淀溶蒸餾水中,透析,冷凍干燥得硫酸軟骨素產(chǎn)品。

按上述方案,步驟1中用20倍量(v/w)0.1mol/l的naoh溶液浸泡2h;用20倍量(v/w)10wt%的異丙醇溶液浸泡2h。

按上述方案,步驟2中naoh溶液濃度為5wt%,料液比為1:6;35℃下反應(yīng)2.5h得鱘魚骨的堿解液。

按上述方案,步驟3中nacl溶液濃度為6wt%,40℃下反應(yīng)2.5h得鱘魚骨的鹽解液。

按上述方案,步驟4中酶解溫度為40℃,酶解時(shí)間為2h,酶量為3wt%。

按上述方案,步驟5中加入60wt%的三氯乙酸;4℃條件下靜置4h。

按上述方案,步驟6中加入1%(w/v)的活性炭于50℃條件下吸附30min。

按上述方案,步驟7中乙醇最終的體積分?jǐn)?shù)為70%。

相對于現(xiàn)有技術(shù),本發(fā)明有益效果如下:

利用本發(fā)明方法從鱘魚骨中提取硫酸軟骨素,方法簡單,提高了硫酸軟骨素產(chǎn)品的產(chǎn)率與純度,為鱘魚的綜合利用提供指導(dǎo),具有極大的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益。

堿解處理鱘魚骨,在堿性條件下硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)連接的糖肽鍵斷裂,使硫酸軟骨素從蛋白多糖中釋放出來,縮短提取時(shí)間,提高硫酸軟骨素的產(chǎn)率。

鹽處理鱘魚骨,在一定的離子濃度下條件下,使得鱘魚骨中的蛋白質(zhì)與硫酸軟骨素沉淀分離,提高硫酸軟骨素產(chǎn)品純度。

雙酶水解處理鱘魚骨,利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)的特性,使與硫酸軟骨素連接的蛋白質(zhì)水解成多肽和氨基酸,進(jìn)一步提高硫酸軟骨素的純度。

三氯乙酸沉降蛋白能將游離的蛋白質(zhì)、短肽、酶沉降分離,提高硫酸軟骨素產(chǎn)品的純度。

透析能將剩余的小分子蛋白質(zhì)、鹽等物質(zhì)除掉,進(jìn)一步提高了硫酸軟骨素產(chǎn)品的純度。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明的技術(shù)效果,但不作為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。

實(shí)施例1

(1)鱘魚骨預(yù)處理:以冷凍的鱘魚脊骨切片為原料,解凍后將其放入水浴鍋中80℃煮20min,去除肌肉等殘余的組織,用20倍量(v/w)0.1mol的naoh溶液浸泡2h后洗至中性,用20倍量(v/w)10%的異丙醇溶液浸泡2h后洗凈,組織搗碎機(jī)粉碎鱘魚骨樣品,干燥備用。

(2)堿解:將(1)中預(yù)處理的鱘魚骨按料液比1:6(w/v)加入4%~6%的naoh溶液,在30℃~40℃條件下反應(yīng)3~4h,反應(yīng)結(jié)束后得鱘魚骨的堿解液。

(3)鹽處理:將(2)中鱘魚骨的堿解液中加入nacl至其濃度為4wt%~8wt%,在30~50℃下間歇攪拌2~3h得鱘魚骨的鹽解液。

(4)雙酶水解:將步驟(3)中的鹽解液,用2mol/l的hcl調(diào)節(jié)ph=7.5~8.5,向溶液中加入有胰蛋白酶與木瓜蛋白酶比為2:1或1:1或1:2(w:w)組成的雙酶進(jìn)行酶解,酶解完成后在沸水浴中滅酶活10min,離心分離取上清液。

(5)三氯乙酸沉降蛋白:將步驟(4)中的上清液中加入60%的三氯乙酸至其濃度為8%~12%,混勻后于4℃條件下靜置4h,離心收集上清液,上清液用5%的naoh調(diào)節(jié)ph至7.0~8.0。

(6)活性炭脫色:將(5)中溶液加入1%(w/v)的活性炭于50℃條件下吸附吸附30min,抽濾,取濾液。

(7)乙醇沉淀:將步驟(6)中的溶液中加入無水乙醇,至其乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%~75%,有沉淀產(chǎn)生,在4℃的條件下靜止過夜,除上層液,取沉淀。

(8)透析,冷凍干燥:將步驟(7)中的沉淀溶于2倍量的蒸餾水中,用截留分子量為3000da~4000da的透析袋進(jìn)行透析,冷凍干燥得硫酸軟骨素產(chǎn)品。

(9)實(shí)施例1中,5g干燥鱘魚骨為原料,得到呈純白色的硫酸軟骨素產(chǎn)品1.35g,產(chǎn)率為27%,純度為91.26%。

對比例1

(1)鱘魚骨預(yù)處理:以冷凍的鱘魚脊骨切片為原料,解凍后將其放入水浴鍋中80℃煮20min,去除肌肉等殘余的組織,用20倍量(v/w)0.1mol的naoh溶液浸泡2h后洗至中性,用20倍量(v/w)10%的異丙醇溶液浸泡2h后洗凈,組織搗碎機(jī)粉碎鱘魚骨樣品,干燥備用。

(2)堿解:將(1)預(yù)處理的鱘魚骨按料液比1:6(w/v)加入4%~6%的naoh溶液,在30℃~40℃條件下反應(yīng)3~4h,反應(yīng)結(jié)束后得鱘魚骨的堿解液。

(3)雙酶水解:將步驟(2)中的堿解液,用2mol/l的hcl調(diào)節(jié)ph=7.5~8.5,向溶液中加入有胰蛋白酶與木瓜蛋白酶比為2:1或1:1或1:2(w:w)組成的雙酶進(jìn)行酶解,酶解完成后在沸水浴中滅酶活10min,離心分離取上清液。

(4)三氯乙酸沉降蛋白:將步驟(3)中的上清液中加入60%的三氯乙酸至其濃度為8%~12%,混勻后于4℃條件下靜置4h,離心收集上清液,上清液用5%的naoh調(diào)節(jié)ph至7.0~8.0。

(5)活性炭脫色:將(4)中溶液加入1%(w/v)的活性炭于50℃條件下吸附吸附30min,抽濾,取濾液。

(6)乙醇沉淀:將步驟(5)中的溶液中加入無水乙醇,至其乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%~75%,有沉淀產(chǎn)生,在4℃的條件下靜止過夜,除上層液,取沉淀。

(7)透析,冷凍干燥:將步驟(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸餾水中,用截留分子量為3000da~4000da的透析袋進(jìn)行透析,冷凍干燥得硫酸軟骨素產(chǎn)品。

(8)對比例1中,5g鱘魚骨為原料,得到呈白色的硫酸軟骨素產(chǎn)品1.36g,產(chǎn)率為27.2%,純度為86.15%。與實(shí)施例1對比,硫酸軟骨素產(chǎn)品產(chǎn)率略高,而產(chǎn)品純度下降。

對比例2

(1)鱘魚骨預(yù)處理:以冷凍的鱘魚脊骨切片為原料,解凍后將其放入水浴鍋中80℃煮20min,去除肌肉等殘余的組織,用20倍量(v/w)0.1mol的naoh溶液浸泡2h后洗至中性,用20倍量(v/w)10%的異丙醇溶液浸泡2h后洗凈,組織搗碎機(jī)粉碎鱘魚骨樣品,干燥備用。

(2)鹽處理:將(1)預(yù)處理的鱘魚骨按料液比1:6(w/v)加入4wt%~8wt%的nacl溶液,在30~50℃下間歇攪拌2~3h得鱘魚骨的鹽解液。

(3)雙酶水解:將步驟(2)中的鹽解液,調(diào)節(jié)ph=7.5~8.5,向溶液中加入有胰蛋白酶與木瓜蛋白酶比為2:1或1:1或1:2(w:w)組成的雙酶進(jìn)行酶解,酶解完成后在沸水浴中滅酶活10min,離心分離取上清液。

(4)三氯乙酸沉降蛋白:將步驟(3)中的上清液中加入60wt%的三氯乙酸至其濃度為8%~12%,混勻后于4℃條件下靜置4h,離心收集上清液,上清液用5%的naoh調(diào)節(jié)ph至7.0~8.0。

(5)活性炭脫色:將(4)中溶液加入1%(w/v)的活性炭于50℃條件下吸附吸附30min,抽濾,取濾液。

(6)乙醇沉淀:將步驟(5)中的溶液中加入無水乙醇,至其乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%~75%,有沉淀產(chǎn)生,在4℃的條件下靜止過夜,除上層液,取沉淀。

(7)透析,冷凍干燥:將步驟(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸餾水中,用截留分子量為3000da~4000da的透析袋進(jìn)行透析,冷凍干燥得硫酸軟骨素產(chǎn)品。

(8)對比例2中,5g鱘魚骨為原料,得到呈白色的硫酸軟骨素產(chǎn)品0.79g,產(chǎn)率為15.8%,純度為90.42%。與實(shí)施例1對比,硫酸軟骨素產(chǎn)品產(chǎn)率明顯下降,而產(chǎn)品純度略低。

實(shí)施例2

(1)鱘魚骨預(yù)處理:以冷凍的鱘魚頭骨切片為原料,解凍后將其放入水浴鍋中80℃煮20min,去除肌肉等殘余的組織,用20倍量(v/w)0.1mol的naoh溶液浸泡2h后洗至中性,用20倍量(v/w)10%的異丙醇溶液浸泡2h后洗凈,組織搗碎機(jī)粉碎鱘魚骨樣品,干燥備用。

(2)堿解:將(1)將預(yù)處理的鱘魚骨按料液比1:6(w/v)加入4%~6%的naoh溶液,在30℃~40℃條件下反應(yīng)3~4h,反應(yīng)結(jié)束得鱘魚骨的堿解液。

(3)鹽處理:將(2)中鱘魚骨的堿解液中加入nacl至其濃度為4wt%~8wt%,在30~50℃下間歇攪拌2~3h得鱘魚骨的鹽解液。

(4)雙酶水解:將步驟(2)中的堿解液,用2mol/l的hcl調(diào)節(jié)ph=7.5~8.5,向溶液中加入有胰蛋白酶與木瓜蛋白酶比為2:1或1:1或1:2(w:w)組成的雙酶進(jìn)行酶解,酶解完成后在沸水浴中滅酶活10min,離心分離取上清液。

(5)三氯乙酸沉降蛋白:將步驟(3)中的上清液中加入60%(w%)的三氯乙酸至其濃度為8%~12%,混勻后于4℃條件下靜置4h,離心收集上清液,上清液用5%(w%)的naoh調(diào)節(jié)ph至7.0~8.0。

(6)活性炭脫色:將(4)中溶液加入1%(w/v)的活性炭于50℃條件下吸附吸附30min,抽濾,取濾液。

(7)乙醇沉淀:將步驟(5)中的溶液中加入無水乙醇,至其乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%~75%,有沉淀產(chǎn)生,在4℃的條件下靜止過夜,除上層液,取沉淀。

(8)透析,冷凍干燥:將步驟(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸餾水中,用截留分子量為3000da~4000da的透析袋進(jìn)行透析,冷凍干燥得硫酸軟骨素產(chǎn)品。

(9)實(shí)施例2中,5g鱘魚骨為原料,得到呈白色的硫酸軟骨素產(chǎn)品1.37g,產(chǎn)率為27.4%,純度為91.71%。

實(shí)施例3

(1)鱘魚骨預(yù)處理:以冷凍的鱘魚脊骨切片為原料,解凍后將其放入水浴鍋中80℃煮20min,去除肌肉等殘余的組織,用20倍量(v/w)0.1mol的koh溶液浸泡2h后洗至中性,用20倍量(v/w)10%的正丁醇溶液浸泡2h后洗凈,組織搗碎機(jī)粉碎鱘魚骨樣品,干燥備用。

(2)堿解:將(1)將預(yù)處理的鱘魚骨按料液比1:6(w/v)加入4%~6%的koh溶液,在30℃~40℃條件下反應(yīng)3~4h,反應(yīng)結(jié)束得鱘魚骨堿解液。

(3)鹽處理:將(2)中鱘魚骨的堿解液中加入nacl至其濃度為4wt%~8wt%,在30~50℃下間歇攪拌2~3h得鱘魚骨的鹽解液。

(4)雙酶水解:將步驟(2)中的堿解液,用2mol/l的乙酸調(diào)節(jié)ph=7.5~8.5,向溶液中加入有胰蛋白酶與木瓜蛋白酶比為2:1或1:1或1:2(w:w)組成的雙酶進(jìn)行酶解,酶解完成后在沸水浴中滅酶活10min,離心分離取上清液。

(5)三氯乙酸沉降蛋白:將步驟(3)中的上清液中加入60%(w%)的三氯乙酸至其濃度為8%~12%,混勻后于4℃條件下靜置4h,離心收集上清液,上清液用5%的koh調(diào)節(jié)ph至7.0~8.0。

(6)活性炭脫色:將(4)中溶液加入1%(m/v)的活性炭于50℃條件下吸附吸附30min,抽濾,取濾液。

(7)乙醇沉淀:將步驟(5)中的溶液中加入無水乙醇,至其乙醇的體積分?jǐn)?shù)為65%~75%,有沉淀產(chǎn)生,在4℃的條件下靜止過夜,除上層液,取沉淀。

(8)透析,冷凍干燥:將步驟(6)中的沉淀溶于2倍量的蒸餾水中,用截留分子量為3000da~4000da的透析袋進(jìn)行透析,冷凍干燥得硫酸軟骨素產(chǎn)品。

(9)實(shí)施例3中,5g鱘魚骨為原料,得到呈純白色硫酸軟骨素產(chǎn)品1.33g,產(chǎn)率為26.6%,純度為92.13%。

在堿提取部分綜合利用單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化堿提取部分工藝,考察堿液濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對硫酸軟骨素提取效果的影響,以硫酸軟骨素的產(chǎn)率為考察指標(biāo),得到影響硫酸軟骨素提取率的主次因素為:料液比>提取時(shí)間>堿液濃度>提取溫度。優(yōu)化最佳的堿提取部分的最佳工藝為:料液比為1:6,提取時(shí)間為2.5h,堿液濃度為5%,提取溫度為35℃。

在雙酶提取部分綜合利用單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化雙酶提取部分工藝,考察酶量、酶解溫度、ph、酶解時(shí)間對硫酸軟骨素提取效果的影響,以硫酸軟骨素額產(chǎn)率與純度為考察指標(biāo),以硫酸軟骨素產(chǎn)品的純度為主要的考察指標(biāo),得到影響硫酸軟骨素提取效果的主次因素為:酶解溫度>酶解時(shí)間>ph>酶量。優(yōu)化最佳的雙酶提取部分的最佳工藝為:酶解溫度為40℃,酶解時(shí)間為2h,ph為8.0,酶量為3%。

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