本發(fā)明涉及一種節(jié)桿菌新菌株，可降解纖維素，特別涉及該菌株的在以農(nóng)業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)的廢棄物為原料生產(chǎn)農(nóng)家肥中的用途，屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：農(nóng)作物秸稈如稻草、麥稈和甘蔗渣等富含纖維素作物是一種重要的可再生資源，全世界每年秸稈產(chǎn)量約為22億噸(kimetal.，2004)，我國每年約產(chǎn)農(nóng)作物秸稈7億噸(徐杰等，2008)。農(nóng)作物秸稈除小部分用于堆肥和作為畜禽飼料外，大部分被隨意燒毀，這不僅浪費了寶貴的資源，而且污染了環(huán)境(chengetal.，2013)。目前，微生物法降解農(nóng)作物秸稈以其最經(jīng)濟、最有效的優(yōu)勢而為人們廣泛關(guān)注(顧文杰等，2012；張建峰等，2016)。在過去的幾十年里，國內(nèi)外學者陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些能夠降解纖維素的微生物，如真菌類中的毛霉屬(文自蘭等，2015)、白腐菌(doddapanenietal.，2005)等，放線菌類中的鏈霉菌屬(鄧輝等，2013；馮紅梅等，2016)、小單胞菌屬(kasusaretal.，2011)等，細菌類中的芽孢桿菌屬(王賢豐等，2015)、假單胞菌屬(尚曉瑛等，2012)等。在微生物降解纖維素的實際應(yīng)用中，常常采用纖維素降解混合菌群的方式，以堆肥或漚肥的形式來降解農(nóng)作物秸稈中的纖維素(梁東麗等，2009)，該過程周期較長且降解不充分。近些年來，雖然人工誘變和基因修飾(fujiietal.，2013)等生物工程技術(shù)逐漸應(yīng)用于纖維素降解菌改造中以提高菌株的產(chǎn)纖維素酶能力，但是獲得的菌株仍然存在產(chǎn)酶量少、酶活力低等問題。因此，篩選新型纖維素降解微生物，尋找最佳纖維素降解途徑，遺傳改造已有纖維素降解菌顯得尤為重要。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供了一種高產(chǎn)纖維素酶、降解性能強的細菌，該菌株可用于以農(nóng)業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)的廢棄物為原料生產(chǎn)農(nóng)家肥。本發(fā)明采用選擇性培養(yǎng)基，通過定向馴化的方法，從恩施土家族苗族自治區(qū)原始森林的腐木中篩選分離得到一株高產(chǎn)纖維素酶細菌，該菌株被命名為hw-17，屬一種節(jié)桿菌(arthrobacteroryzae)，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學；郵編430072，保藏日期為2017年3月30日，保藏編號為：cctccno：m2017156；該菌株的16srdna序列如seqidno.1所示。本申請所提供的hw-17菌株作為單一的纖維素降解菌對纖維素的降解能力雖然抵不上混合菌系對含纖維素樣品的降解能力，但將該hw-17菌株接種至含豬糞或雞糞的纖維素樣品中(v/w＝1∶1)，含纖維素的秸稈亦得到了有效的降解，而目前本領(lǐng)域中未見其他節(jié)桿菌對含雞糞或豬糞的混合纖維素樣品中纖維素降解效果的報道。因而該菌可用于堆肥，可用于工業(yè)上以雞糞或豬糞、農(nóng)作物秸稈、蔬菜爛葉等作為原料生產(chǎn)有機肥。此外，該hw-17菌株的生長特性及產(chǎn)纖維素酶特性非常清楚，因而該hw-17菌株既可作為工業(yè)上生產(chǎn)纖維素酶的候選菌株，還可用于商業(yè)上生產(chǎn)單一的纖維素酶。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范圍并不局限于以下實施例。菌株的篩選及培養(yǎng)本申請中以從湖北省恩施州七姊妹山采集到的腐木為篩選菌株的材料，采用以羧甲基纖維素鈉作為單一碳源的選擇性培養(yǎng)基[羧甲基纖維素鈉(cmc-na)10.0g/l，kh2po42.0g/l，nh4cl5.0g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，ph7.0-7.2]，將腐木加入該選擇性培養(yǎng)基中，于30℃、200r/min下馴化7d。將馴化后的菌液逐級稀釋，取少量不同稀釋度的菌液均勻涂布于該選擇性固體培養(yǎng)基上，于30℃下培養(yǎng)。挑取水解圈大的菌落進行劃線稀釋6次，以此得到純化的且纖維素降解能力強的單菌落。所篩選到的菌株生理生化特性如下：objectsresultsobjectsresults革蘭氏染色+α-乳糖利用-vp試驗-蔗糖利用+甲基紅試驗-d-木糖利用-淀粉水解試驗+麥芽糖利用+檸檬酸鹽試驗-海藻糖利用+吲哚試驗-鼠李糖利用+產(chǎn)氨試驗+山梨醇利用-h2s試驗-甘露醇利用+尿素水解試驗-甲醇利用+h2o2接觸試驗+乙醇利用+明膠液化試驗-草酸利用-丙二酸鹽試驗-甘油利用-葡萄糖利用+酒石酸鉀鈉利用-注：+，陽性發(fā)應(yīng)；-，陰性反應(yīng)該菌株的生長特性如下：①氮源的偏好：在胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸出物、干酪素、kno3、nano2、nh4cl和甘氨酸這8種氮源中，arthrobacteroryzaehw-17對有機氮源的利用最好，特別是胰蛋白胨②碳源的偏好：在葡萄糖、蔗糖、淀粉、海藻糖、麥芽糖、甘露醇、乙醇、甲醇、纖維素這9種碳源中，arthrobacteroryzaehw-17對乙醇的利用最好③最適生長ph：在ph為3、4、5、6、7、8、9或10下，arthrobacteroryzaehw-17在ph為7下生長得最好。④最適生長溫度：arthrobacteroryzaehw-17能在15-50℃范圍下生長，且在30℃或35℃下生長得最好。菌株的鑒定與保藏采用tiangendna提取試劑盒(天根生化科技，北京)提取細菌總dna。使用細菌通用引物(lane,1991)來擴增菌株hw-1716srdna基因。pcr產(chǎn)物經(jīng)純化后送于武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序。將測得的16srdna序列上傳至ncbi中與已知的16srdna比對，使用mega6(tamuraetal.，2013)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，其16srdna序列如seqidno.1所示。對序列進行同源性分析，判斷其為節(jié)桿菌(arthrobacteroryzae)，將其命名為hw-17菌株。并將該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國，武漢，武漢大學；郵編430072，保藏日期為2017年3月30日，保藏編號為：cctccno：m2017156。菌株的性能實驗及分析本申請所提供的hw-17菌株在含羧甲基纖維素鈉的培養(yǎng)基(cmc培養(yǎng)基)中培養(yǎng)7天的過程中，纖維素酶活最高可達18.55u/ml。在這種單一碳源的培養(yǎng)基中，hw-17菌株表達的纖維素酶活明顯較其他人篩選到的纖維素降解菌株產(chǎn)生的纖維素酶活(2.80u/ml)高。因此，單就產(chǎn)纖維素酶而言，本申請所提供的hw-17菌株具有較大的應(yīng)用前景。本申請?zhí)峁┑膆w-17菌株能夠利用包菜葉、水稻葉、香樟葉、蘋果皮或雜木屑中有機物進行生長，且對蘋果皮和包菜葉的利用效果最好。因此，hw-17菌株可以作為合適的菌株以降解難以處理的果蔬，因而在果蔬殘渣發(fā)酵生產(chǎn)農(nóng)家肥這一領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用價值。具體實驗如下：分別取1g經(jīng)液氮研磨后的蘋果皮(apple)、水稻葉(rice)、香樟葉(camphor)、包菜葉(cabbage)或雜木屑(sawdust)加入至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中作為碳源以取代cmc-na，對照組為分別含上述5種未經(jīng)液氮研磨的纖維素樣品。將菌株hw-17接種至上述10種培養(yǎng)基中，30℃、200r/min下培養(yǎng)3d后測定d600值和纖維素酶活。結(jié)果如下：菌株hw-17在5種未經(jīng)研磨的纖維素樣品的培養(yǎng)基里呈現(xiàn)出如下的生長順序:包菜葉>水稻葉>香樟葉>蘋果皮>雜木屑，而在5種經(jīng)液氮研磨的纖維素樣品的培養(yǎng)基里呈現(xiàn)出以下生長順序：蘋果皮>包菜葉>水稻葉>香樟葉>雜木屑，且均較對照組的生物量高。此外，實驗組和對照組中的最大纖維素酶活分別為4.79u·ml-1和6.69u·ml-1，且兩者均在含蘋果皮的培養(yǎng)基里取得。研磨含纖維素的樣品能夠增大樣品與菌株的接觸面積，這樣有助于菌株更好地降解纖維素。由此可見，研磨后的纖維素樣品更適于菌株hw-17代謝利用，且產(chǎn)生的纖維素酶活更高。針對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上產(chǎn)生的大量農(nóng)作物秸稈，如水稻秸稈等，當水稻秸稈與豬糞或雞糞以合理的比例混合后，接種本申請所提供的hw-17菌株至兩種混合纖維素樣品中發(fā)酵20天，兩種混合樣品中的水稻秸稈明顯得到降解。此外，在豬糞-水稻混合樣品與雞糞-水稻混合樣品中檢測到最大纖維素酶活為7.38u/ml和9.71u/ml。因此，hw-17菌株能夠最為合適的堆肥菌株以降解農(nóng)作物秸稈，甚至可以用于工業(yè)生產(chǎn)有機農(nóng)家肥。具體試驗方法如下：稱取20g烘干的雞糞(chicken)或豬糞(pig)，分別加入至盛有20g磨碎的水稻葉片(rice)的錐形瓶中，1×105pa下滅菌20min。吸取20ml菌株hw-17種子溶液(d600＝1)接種至上述樣品中并混勻，然后置于30℃下培養(yǎng)。每隔2d，收集浸出液，測定纖維素酶活。此外，將浸出液進行梯度稀釋，吸取0.1ml稀釋度為10-6的稀釋液，均勻涂布于cmc-na固體平板上，30℃下培養(yǎng)24h后確定平板上單菌落。結(jié)果如下：菌株hw-17在rice-chicken混合樣品里堆肥發(fā)酵12d后，纖維素酶活最大(9.71u·ml-1)；在rice-pig混合樣品里發(fā)酵14d后，纖維素酶活最大(7.38u·ml-1)。纖維素酶活變化趨勢與樣品里菌株數(shù)量變化趨勢一致，且同一時刻下rice-chicken混合樣品里纖維素酶活均高于rice-pig混合樣品里纖維素酶活。復(fù)合微生物菌劑發(fā)酵含雞糞或豬糞纖維素樣品產(chǎn)生的纖維素酶的變化率與該結(jié)果一致。此外，實際觀測到的雞糞和水稻葉片混合樣品較豬糞和水稻葉片混合樣品降解得更厲害。豬糞和水稻的混合樣品(c/n＝24.7)較雞糞和水稻的混合樣品(c/n＝19.7)的碳氮比高，前者更適于菌株hw-17的代謝。在堆肥發(fā)酵的初期，菌株hw-17優(yōu)先利用雞糞或豬糞里的有機物以維持自身的生長和繁殖，待混合樣品營養(yǎng)度降低時，菌株hw-17開始利用水稻葉片里的纖維素。<110>：中南民族大學<120>：一株降解纖維素的節(jié)桿菌hw-17菌株及其用途<160>：1<210>：1<211>：1421<212>：dna<213>：節(jié)桿菌（arthrobacteroryzae）<400>：1gggggggcgtctaaatgcagtcgaacgatgatgcccagcttgctgggtggattagtggcg60aacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttaactctgggataagcctgggaaactgg120gtctaataccggatatgactcctcatcgcatggtggggggtggaaagctttttgtggttt180tggatggactcgcggcctatcagcttgttggtgaggtaatggcttaccaaggcgacgacg240ggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactccta300cgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcg360tgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtagggaagaagcgaaagtgacg420gtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcg480caagcgttatccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgccg540tgaaagtccggggctcaactccggatctgcggtgggtacgggcagactagagtgatgtag600gggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatg660gcgaaggcaggtctctgggcattaactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaaca720ggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtgggggacattc780cacgttttccgcgccgtagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaag840gctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattc900gatgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatggaccggaccgggctggaaacagtc960cttcccctttggggctggttcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgaga1020tgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttctatgttgccagcacgtgatggt1080ggggactcataggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaaatca1140tcatgccccttatgtcttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaaagggttgcga1200tactgtgaggtggagctaatcccaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaact1260cgaccccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgt1320tcccgggccttgtacacaccgcccgtcaagtcacgaaagttggtaacacccgaagccggt1380ggcctaaccccttgtgggagggagcttcgaagtgacgcatc1421當前第1頁12