本發(fā)明屬于葡萄糖激酶應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄糖激酶在人重組fgf21蛋白活性檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肥胖和2型糖尿病的新藥研制一直是科研和開發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其中具有代謝調(diào)控作用的生物活性蛋白類物質(zhì)也是中國(guó)研發(fā)公司的開發(fā)重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21(fgf21)重組蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、減輕體重、降低血糖、顯著減輕2型糖尿病及其并發(fā)癥。在藥物研發(fā)中，一個(gè)穩(wěn)定高效的藥物效果檢測(cè)體系是評(píng)價(jià)候選藥物優(yōu)劣的關(guān)鍵，因此，建立一個(gè)客觀評(píng)價(jià)fgf21重組蛋白治療糖尿病效果的檢測(cè)體系對(duì)于fgf21研發(fā)十分重要。

目前，脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)室測(cè)定普遍采用的fgf21重組蛋白活性檢測(cè)方法，該方法通過在培養(yǎng)液中加入2-脫氧葡萄糖來測(cè)定，2-脫氧葡萄糖攝入細(xì)胞后被己糖激酶磷酸化為6-磷酸-2-脫氧葡萄糖，6-磷酸-2-脫氧葡萄糖不能進(jìn)入后續(xù)代謝步驟，從而在細(xì)胞中聚集，直接成比例地反映細(xì)胞的葡萄糖攝入水平。該方法雖然可以檢測(cè)fgf21活性，但是有以下不足之處：一是該方法使用放射性物質(zhì)標(biāo)記2-脫氧葡萄糖，對(duì)于實(shí)驗(yàn)防護(hù)和環(huán)境保護(hù)要求較高，而且該方法使用熒光檢測(cè)方法測(cè)定6-磷酸-2-脫氧葡萄糖的水平，價(jià)格昂貴，不利于高通量篩選使用；二是2-脫氧葡萄糖攝取受到己糖激酶活性的影響，在酶活性發(fā)生變化時(shí)不能很好地反映葡萄糖攝取能力變化。因此，如果發(fā)明新的fgf21重組蛋白功能檢測(cè)體系來彌補(bǔ)葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)的不足，并且能夠做到更加簡(jiǎn)便、可靠，那這對(duì)于客觀評(píng)價(jià)fgf21重組蛋白效果具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種葡萄糖激酶在人重組fgf21蛋白活性檢測(cè)中的應(yīng)用，為判斷人重組fgf21蛋白活性提供了新的思路，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法成本昂貴、對(duì)環(huán)境要求高的問題。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，葡萄糖激酶在人重組fgf21蛋白活性檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明的特征還在于，

葡萄糖激酶的基因表達(dá)水平與人重組fgf21蛋白的添加濃度的關(guān)系為：當(dāng)人重組fgf21蛋白的添加濃度c≥4-6ng/ml時(shí)，葡萄糖激酶基因表達(dá)水平隨人重組fgf21蛋白的添加濃度的增加而減少。

本發(fā)明的另一個(gè)技術(shù)方案是，用于判斷人重組fgf21蛋白活性的葡萄糖激酶，葡萄糖激酶的引物序列為：

上游引物：5’-cacccaactgcgaaatcacc-3’；

下游引物：5’-catttgtggggtgtggagtc-3’。

本發(fā)明的特征還在于，

葡萄糖激酶的基因表達(dá)水平被人重組fgf21蛋白下調(diào)，且呈劑量依賴性下降。

葡萄糖激酶為脂肪細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖激酶。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過人重組fgf21蛋白處理脂肪細(xì)胞，采用定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)檢測(cè)脂肪細(xì)胞的基因表達(dá)，從而確定脂肪細(xì)胞葡萄糖激酶表達(dá)水平可成為fgf21活性檢測(cè)的新指標(biāo)，操作過程簡(jiǎn)單，對(duì)環(huán)境的要求低，有很好的實(shí)用價(jià)值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒熘炯?xì)胞的顯微圖片；

圖2是本發(fā)明定量pcr觀察葡萄糖激酶和beta-actin基因的擴(kuò)增曲線圖；

圖3是本發(fā)明pcr產(chǎn)物的溶解曲線；

圖4是本發(fā)明人重組fgf21對(duì)葡萄糖激酶基因表達(dá)的影響的柱狀圖；

圖5是本發(fā)明人重組fgf21對(duì)葡萄糖激酶基因表達(dá)的量效關(guān)系圖；

圖6是本發(fā)明人重組fgf21受體抑制劑對(duì)fgf21作用的抑制效應(yīng)的柱狀圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明葡萄糖激酶在人重組fgf21蛋白活性檢測(cè)中的應(yīng)用，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

一、細(xì)胞培養(yǎng)和處理：小鼠前體脂肪細(xì)胞種植于12孔培養(yǎng)板中，在37℃孵箱培養(yǎng)，所用培養(yǎng)液為普通培養(yǎng)液即dmem培養(yǎng)液，其中加入體積分?jǐn)?shù)10％的新生牛血清，每2天更換新鮮培養(yǎng)液；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至接觸抑制2天后，更換到誘導(dǎo)培養(yǎng)液，誘導(dǎo)培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)液，其中加入體積分?jǐn)?shù)10％的新生牛血清、0.3iu/ml胰島素、20μmol/l地塞米松和20μmol/l羅格列酮，處理2天后；更換到胰島素培養(yǎng)液，胰島素培養(yǎng)液為dmem培養(yǎng)液，其中加入體積分?jǐn)?shù)為10％的新生牛血清和0.3iu/ml胰島素，繼續(xù)培養(yǎng)2天后；更換到普通培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后可見細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積，向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化，每2天更換新鮮培養(yǎng)液，6天后細(xì)胞用于fgf21處理。如圖1所示，細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后全部出現(xiàn)脂滴沉積，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓闹炯?xì)胞。

在脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入不同濃度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml人重組fgf21蛋白，處理12小時(shí)后，脂肪細(xì)胞用于rna提取。

二、脂肪細(xì)胞的rna提取和反轉(zhuǎn)錄：將12孔板中的培養(yǎng)液去除干凈，每孔加入350μl裂解液rl。用細(xì)胞研磨棒研磨裂解，再將所有溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱cs中12000rpm離心2min，收集濾液；向?yàn)V液中加入350μl70％乙醇，混勻并轉(zhuǎn)入吸附柱cr3中12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室溫放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；重復(fù)向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3置于室溫放置5min以徹底晾干殘余的漂洗液；將吸附柱cr3轉(zhuǎn)入rnase-free離心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到rna溶液。

酶標(biāo)儀檢測(cè)rna濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna質(zhì)量。在八連管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分別加入1μlgdnaeraser，再分別加入1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o補(bǔ)足至10μl，混勻，室溫反應(yīng)5min。在各管中依次加入以下試劑，4μl5xprimescriptbuffer2，4μlrnasefreedh2o，1μlprimescriptrtenzymemixi，1μlrtprimermix，總反應(yīng)體系為20μl，混勻。反應(yīng)條件為37℃15min，85℃5s。反應(yīng)完成后將cdna存于4℃?zhèn)溆茫L(zhǎng)期保存時(shí)轉(zhuǎn)入-20℃。

三、葡萄糖激酶表達(dá)水平的檢測(cè)：葡萄糖激酶基因表達(dá)水平采用定量pcr方法檢測(cè)，以beta-actin基因的表達(dá)作為參考基因。在八連管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μl葡萄糖激酶引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，總反應(yīng)體系為20μl，混勻。

反應(yīng)條件是：第一步是94℃、5min；第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，循環(huán)以上順序40次；第三步是進(jìn)行加溫溶解擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得溶解曲線。

葡萄糖激酶引物序列是：

上游引物：5’-cacccaactgcgaaatcacc-3’；

下游引物：5’-catttgtggggtgtggagtc-3’。

beta-actin的引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

以beta-actin基因表達(dá)為參考，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行表達(dá)水平分析。如圖2所示，隨著擴(kuò)增次數(shù)的增加，葡萄糖激酶和beta-actin基因的拷貝數(shù)在一定擴(kuò)增次數(shù)后呈指數(shù)增加，最后到達(dá)平臺(tái)期，如圖3所示，溶解曲線表現(xiàn)單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性強(qiáng)。如圖4所示，人重組fgf21(美國(guó)peprotech公司產(chǎn)品，濃度100ng/ml)處理細(xì)胞12小時(shí)可顯著降低脂肪細(xì)胞內(nèi)葡萄糖激酶的表達(dá)(**表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p<0.01，n＝6)。如圖5所示，葡萄糖激酶表達(dá)隨人重組fgf21(美國(guó)peprotech公司產(chǎn)品，處理細(xì)胞12小時(shí))濃度的增加而減少，表現(xiàn)為良好的量效關(guān)系。如圖6所示，設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，一組為對(duì)照組即空白組，二組加入人重組fgf21蛋白，三組加入人重組fgf21蛋白抑制劑azd4547，四組同時(shí)加入人重組fgf21蛋白和抑制劑azd4547，結(jié)果表明，人重組fgf21受體抑制劑azd4547(美國(guó)mce公司產(chǎn)品，濃度10nmol/l)處理后顯著抑制fgf21對(duì)葡萄糖激酶表達(dá)的作用(**表示統(tǒng)計(jì)學(xué)分析p<0.01，n＝6)。

四、擴(kuò)增特異性的鑒定：把定量pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行dna測(cè)序，葡萄糖激酶的擴(kuò)增序列如下：

“cacccaactgcgaaatcaccttcattgaatcagaggagggcagcggcaggggagccgcactggtctctgcggtggcctgcaagaaggcttgcatgctgggccagtgaaatccaggcaaggacagggacctgggttccacggggactccacaccccacaaatg”，擴(kuò)增片段大小為162bp，與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心報(bào)道的葡萄糖激酶mrna(序號(hào)：xm006514443.3)的1563-1724堿基序列完全一致。

根據(jù)以上可知，葡萄糖激酶表達(dá)水平被人重組fgf21下調(diào)，且呈劑量依賴性下降，脂肪細(xì)胞葡萄糖激酶表達(dá)水平可成為fgf21活性檢測(cè)的新指標(biāo)。