本發(fā)明涉及環(huán)等溫擴增技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種用于檢測端粒酶活性的引物組、試劑盒和檢測方法。

背景技術(shù)：

端粒是真核染色體末端的dna蛋白復(fù)合物，它與染色體末端降解、端粒融合、dna損傷或端粒不恰當重組有著密切的關(guān)系。在脊椎動物中，端粒是由ttaggg六個堿基組成的dna重復(fù)序列，正常細胞(永生細胞除外，如造血細胞，生殖細胞等)通過不斷增殖，染色體分裂，端粒逐漸縮短，當染色體末端端?？s短到一定程度時，導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，細胞生存能力受損，直至細胞凋亡。

端粒酶是細胞中核糖核蛋白(ribonucleoprotein，rnp)反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase，rt)，它能夠阻止染色體分裂過程中端粒dna的縮短，端粒酶中自身rna序列作為合成模板，與端粒dna序列互補雜交后，由于端粒酶具有反轉(zhuǎn)錄功能，使染色體末端的端粒dna不斷得到復(fù)制。

現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，端粒與端粒酶的活性與多種生命現(xiàn)象相關(guān)：(1)腫瘤增殖：在正常細胞中端粒酶的活性極低，而在腫瘤細胞中，端粒酶的活性表達高至85％以上，穩(wěn)定染色體末端的端粒dna，使得盡管細胞分裂使得端粒縮短，也會在端粒酶的作用下重新延伸出完整的端粒dna，使腫瘤細胞可無限增殖。(2)運動員選材：運動員生長發(fā)育鑒定師運動員科學(xué)選材的重要環(huán)節(jié)。生長發(fā)育通常使用的生物學(xué)年齡而非生活年齡，端粒的縮短代表生物學(xué)年齡，因此，通過檢測端粒長度可以對運動員進行選材，避免單純根據(jù)人的生活年齡來取舍運動員，大大提高運動員選材的科學(xué)性。(3)運動組織損傷的修復(fù)：現(xiàn)代研究針對端粒酶能催化細胞永生的原理，應(yīng)用少量種子細胞經(jīng)體外擴增后與生物材料復(fù)合，構(gòu)建出新的組織或器官，用于替代和修復(fù)病變、缺損的組織器官。因此，基于端粒酶的重要功能，檢測端粒酶的活性十分必要。

但端粒酶活性在正常細胞中很難被檢測到，它一般在腫瘤或癌細胞中被激活，即使在癌細胞中，端粒酶的活性表達也很低，因此，本領(lǐng)域亟待建立一種高靈敏度的端粒酶活性檢測方法。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種用于檢測端粒酶活性的lamp引物組，所述引物組能夠用于快速、準確、便捷地檢測端粒酶活性。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種用于檢測端粒酶活性的試劑盒，所述試劑盒能夠用于快速、準確、便捷地檢測端粒酶活性。

本發(fā)明的第三目的在于提供一種非診斷目的的端粒酶活性檢測方法，通過該方法可以快速、準確、便捷地檢測端粒酶活性。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種用于檢測端粒酶活性的lamp引物組，所述引物組包括s-l-ts引物、bip引物和b3引物組成，其中所述s-l-ts引物、bip引物和b3引物的序列依次如seqidno：1～3所示。

本發(fā)明提供上述用于檢測端粒酶活性的lamp引物組，利用上述引物組可以建立一種簡單、快速、準確和靈敏的基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(lamp)檢測端粒酶活性的新方法，該lamp檢測端粒酶活性的原理如圖1所示：

上述引物組中的s-l-ts(step-loop-ts)引物，為5’端發(fā)夾結(jié)構(gòu)的端粒酶延伸反應(yīng)引物，該引物在端粒酶的作用下進行延伸，生成含有多個端粒重復(fù)序列b3c的延伸產(chǎn)物。

引物bip的3'端b2部分與s-l-ts引物b2c部分完全匹配，b3與端粒酶延伸產(chǎn)物重復(fù)序列b3c完全匹配，在具有鏈置換作用的dna聚合酶的作用下，bip和b3的3'端均發(fā)生延伸反應(yīng)，形成雙莖環(huán)的dna模板。

隨后fip的5'端f1c部分與雙鏈f1完全匹配，3'端f2部分與單鏈環(huán)上f2c完全匹配，引發(fā)鏈頂替dna合成反應(yīng)，生成了成環(huán)部分含有b2c序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)dna序列，bip的5'端b1c部分與雙鏈b1完全匹配，3'端b2部分與單鏈環(huán)上b2c完全匹配，繼續(xù)引發(fā)鏈頂替dna合成反應(yīng)。產(chǎn)生更多的環(huán)狀dna序列與引物fip和bip作用后，通過鏈頂替反應(yīng)形成了多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜式結(jié)構(gòu)的lamp終產(chǎn)物。

這種自動循環(huán)的反應(yīng)能夠重復(fù)持續(xù)的進行，形成dna的指數(shù)擴增反應(yīng)，通過檢測lamp擴增結(jié)果從而檢測端粒酶的活性。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾比為3～7:100～400:30～70:100～400。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾比為4～7:100～300:40～70:100～300。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾比為4～6:150～250:40～60:150～250。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾比為5:200:50:200。

本發(fā)明上述引物組對各引物的摩爾比進行限定，在該摩爾比范圍內(nèi)，lamp反應(yīng)的擴增信號強，同時樣品與空白的poi差值也大，因此，采用該lamp探針組檢測端粒酶活性，檢測效果好，靈敏度高。

本發(fā)明還提供一種用于檢測端粒酶活性的試劑盒，所述試劑盒包括上述引物組，所述試劑盒還包括dntps、具有鏈置換作用的dna聚合酶、甜菜堿、端粒酶延伸反應(yīng)緩沖液、lamp反應(yīng)緩沖液、顯色劑或熒光指示劑中的一種或多種。

本發(fā)明上述試劑盒包括前述引物組，因此，該試劑盒能夠快速、準確地檢測端粒酶的活性，同時，試劑盒中還包括lamp反應(yīng)中所需的其他試劑，不需要再另行配置，使得端粒酶活性的檢測能夠更便捷。

在一些實施方式中，所述具有鏈置換作用的dna聚合酶為bstdna聚合酶。

在一些實施方式中，所述端粒酶延伸反應(yīng)緩沖液為含mg²⁺，egta、kcl和tween20的tris-hcl緩沖液，優(yōu)選地，所述tris-hcl緩沖液中tris-hcl為0mm、mg²⁺為1.5mm、egta為1mm、kcl為70mm、tween20為0.05％(v/v)，ph8.3。

在一些實施方式中，所述lamp反應(yīng)緩沖液為1×thermopol反應(yīng)緩沖液。

在一些實施方式中，所述顯色劑或熒光指示劑選自sybrgreeni、sybrgold、picogreen、pekogreen、eb、genefinder、calcein、evagreen、碘化丙啶、鈣黃綠素和羥基萘酚藍。

本發(fā)明還涉及一種使用上述探針組或上述試劑盒對端粒酶活性進行非診斷目的的檢測的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)端粒酶延伸：將端粒酶提取液與s-l-ts引物混合，恒溫孵育進行端粒酶延伸反應(yīng)，最后加熱使端粒酶失活；

(2)配制含延伸產(chǎn)物、lamp反應(yīng)緩沖液、b3引物、bip引物、fip引物、dntps和具有置換作用的dna聚合酶的lamp反應(yīng)體系；

(3)將配制好的lamp反應(yīng)體系進行恒溫擴增，反應(yīng)過程中或反應(yīng)后檢測反應(yīng)體系中顯色劑或熒光指示劑的顏色變化或熒光強度變化。

本發(fā)明上述方法為簡單、快速的基于lamp檢測端粒酶活性的方法，該方法不需要精確控溫的熱循環(huán)步驟，擴增效率高，操作簡單，可以快速、準確地實現(xiàn)端粒酶活性的檢測，該方法可以檢測低至從80個hela細胞中提取的端粒酶的活性，極大降低對檢測樣品量的要求。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾濃度分別為3～7nm、100～400nm、30～70nm和100～400nm，所述dna聚合酶為2～2.8u。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾濃度分別為4～7nm、100～300nm、40～70nm和100～300nm，所述dna聚合酶為2～2.5u。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾濃度分別為4～6nm、150～250nm、40～60nm和150～250nm，所述dna聚合酶為2.2～2.5u。

在一些實施方式中，所述s-l-ts引物、bip引物、b3引物和fip引物的摩爾濃度為5nm、200nm、50nm和200nm。

在一些實施方式中，所述lamp反應(yīng)體系中還包括甜菜堿，優(yōu)選地，所述甜菜堿的濃度為0.5～2m，或0.5～1.5m，或1～1.5m，更優(yōu)選地所述甜菜堿的濃度為1m。

在一些實施方式中，所述lamp反應(yīng)體系中還包括熒光染料，優(yōu)選地，所述熒光染料為sybrgreeni。

在一些實施方式中，所述擴增溫度的溫度為50～60℃，優(yōu)選為55℃。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)、本發(fā)明提供一種檢測端粒酶活性的新型的引物組、試劑盒和方法，上述引物組、試劑盒和方法基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)，不需要精確控溫的熱循環(huán)步驟，擴增效率高，操作簡便，能夠快速、準確、靈敏地檢測端粒酶的活性。

2)、本發(fā)明上述引物組、試劑盒和方法對引物和/或具有鏈置換作用的dna聚合酶的濃度進行優(yōu)化，使得所述引物組、試劑盒和方法對端粒酶活性的檢測靈敏度更高，可檢測低至80個hela細胞中提取的端粒酶的活性。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為；lamp檢測端粒酶活性原理示意圖；

圖2為：b3引物濃度對lamp反應(yīng)檢測端粒酶活性的影響；

圖3為：bip和fip引物濃度對lamp反應(yīng)檢測端粒酶活性的影響；

圖4為：bstdna聚合酶濃度對lamp反應(yīng)檢測端粒酶活性的影響；

圖5為：基于恒溫擴增反應(yīng)檢測不同hela細胞數(shù)中端粒酶活性的實時熒光強度；

圖6為：熒光強度曲線poi值與相應(yīng)細胞個數(shù)的對數(shù)值的線性關(guān)系。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1引物設(shè)計與合成

設(shè)計并合成如表1所示引物，表1所示引物均經(jīng)聚丙烯酰胺電泳純化，其中s-l-ts引物由integrateddnatechnologies,inc.(idt,美國)合成，其余dna序列由上海生物工程公司合成。

表1引物序列表

實施例2端粒酶提取

培養(yǎng)的hela細胞計數(shù)后用冷的1×pbs洗滌3次，然后在4℃、2000轉(zhuǎn)/分離心10min。分離出的細胞加入適量的冷的1×chaps細胞裂解緩沖液，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×104cell/μl，在冰上放置30min，期間震蕩多次，然后在4℃，12000轉(zhuǎn)/分離心30min。最終取出含有端粒酶的上層溶液，放置在-80℃的超低溫冰箱中保存。

其中，1×pbs緩沖溶液：137mmol/lnacl,10mmol/l磷酸鹽緩沖,2.7mmol/lkcl,ph7.4；

1×chaps細胞裂解緩沖液購于millipore(美國)。

實施例3端粒酶延伸和lamp反應(yīng)

端粒酶延伸過程：取適量的端粒酶提取液，5nms-l-ts引物，在端粒酶延伸反應(yīng)緩沖溶液中混合，終反應(yīng)體積為20μl。該混合溶液在37℃孵育20min進行端粒酶延伸反應(yīng)，然后至90℃加熱10min使端粒酶失活。

lamp反應(yīng)：parta：1μl延伸產(chǎn)物溶液，0.8×thermopol反應(yīng)緩沖液，50nmb3引物，0.2μmbip引物，0.2μmfip引物，1m甜菜堿，200μmdntps。partb：0.2×thermopol反應(yīng)緩沖液，0.4×sybrgreeni熒光染料，2.4ubstdna聚合酶。總反應(yīng)體積為10μl。混合后立即放到stepone實時定量pcr儀器中。55℃進行l(wèi)amp反應(yīng)，每隔1min監(jiān)測一次實時熒光強度信號。

其中：端粒酶延伸反應(yīng)緩沖溶液：20mmtris-hcl，1.5mmmgc12·6h2o，1mmegta，70mmkcl，0.05％tween20，200μmdntps，ph8.3；

1×thermopol反應(yīng)緩沖液：20mmtris-hcl，10mmkcl,10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100，ph8.8；

dntpmixture(each2.5mm)購于大連寶生物工程有限公司；

甜菜堿購于sigma(美國)；

sybrgreeni核酸染料(20×)購于廈門致善生物科技有限公司；

bstdna聚合酶，大片段(10×thermopolreactionbuffer,8000u/ml)購自于newenglandbiolabs(美國)；

stepone實時定量pcr(appliedbiosystems，美國)。

實驗例1檢測條件的優(yōu)化

1、優(yōu)化b3引物濃度：參照實施例1～3檢測從4000個hela細胞中提取的端粒酶，區(qū)別僅在于b3、bip、fip和dna聚合酶的濃度如表2所示。不同b3引物濃度下，端粒酶活性實時熒光檢測lamp擴增結(jié)果如圖2所示，根據(jù)圖2所示數(shù)據(jù)可知，b3引物的濃度為50nm時，樣品與空白之間的poi差值最大，因此，b3引物的最佳濃度為50nm。

表2不同實驗組中b3、bip、fip和dna聚合酶的濃度

2、優(yōu)化bip和fip引物濃度：參照實施例1～3檢測從4000個hela細胞中提取的端粒酶，區(qū)別僅在于b3、bip、fip和dna聚合酶的濃度如表3所示。不同bip和fip引物濃度下，端粒酶活性實時熒光檢測lamp擴增結(jié)果如圖3所示，根據(jù)圖3所示數(shù)據(jù)可知，當bip和fip引物濃度為0.05μm時，由于bip和fip引物濃度太小，無擴增信號；當增加bip和fip引物濃度為0.2μm時，樣品與空白poi差值達到最大，繼續(xù)增加引物濃度后，空白和樣品的poi差值逐漸減小。因此，選擇bip和fip引物的最佳濃度濃度分別為0.2μm。

表3不同實驗組中b3、bip、fip和dna聚合酶的濃度

3、2、優(yōu)化bstdna聚合酶的濃度：參照實施例1～3檢測從4000個hela細胞中提取的端粒酶，區(qū)別僅在于b3、bip、fip和dna聚合酶的濃度如表3所示。在不同bstdna聚合酶濃度下，端粒酶活性實時熒光檢測lamp擴增結(jié)果如圖4所示。

根據(jù)圖4所示數(shù)據(jù)可知，反應(yīng)體系在55℃條件下恒溫擴增，隨著bstdna聚合酶濃度的增加，樣品與空白信號出現(xiàn)的時間均縮短。當bstdna聚合酶濃度增加至為2.4u時，樣品與空白poi相差最大，繼續(xù)增加bstdna聚合酶濃度，樣品與空白poi相差減小。所以，選擇bstdna聚合酶的最佳濃度為2.4u。

表4不同實驗組中b3、bip、fip和dna聚合酶的濃度

實驗例2hela細胞中端粒酶活性的測定

參照實施例1～3檢測不同樣品的端粒酶的活性，所述樣品的具體信息如表5所示。不同樣品的熒光檢測結(jié)果如圖5所示，熒光強度曲線poi值與相應(yīng)的細胞個數(shù)的對數(shù)值的線性關(guān)系如表6所示。根據(jù)圖5可知，對照樣品(control)與空白產(chǎn)生的熒光曲線非常相近，與樣品溶液(8000個hela細胞提取的端粒酶)產(chǎn)生的熒光曲線具有顯著差別，證明該端粒酶活性檢測方法的可靠性。根據(jù)圖6可知，熒光強度曲線poi值與相應(yīng)的細胞個數(shù)的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，線性方程poi＝177.18-26.16lgacell，線性相關(guān)系數(shù)r＝0.9954，該方法可以檢測低至80個hela細胞中端粒酶的活性。

表5樣品編號及樣品詳情

最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>國家體育總局體育科學(xué)研究所

<120>-一種用于檢測端粒酶的lamp引物組、試劑盒和檢測方法

<130>2017.5.5

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>200

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

acaacgtcgtgactgggaaaaccctttttgtgcgggcctcttcgctattaccgattaagt60

tgtttcgccagggttttcccagtcacgacgttgtaagcttgcatgcctgcaggtcgactc120

tagaggatccccgggtacgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaa180

caaatccgtcgagcagagtt200

<210>2

<211>52

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

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<210>3

<211>51

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

acaacgtcgtgactgggaaaaccctttttgtgcgggcctcttcgctattac51

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

ctaaccctaaccctaaccc19