本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，檢測茄匍柄霉菌的成套試劑及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：匍柄屬真菌(stemphylium)能夠侵染全球范圍內(nèi)多種作物，可以引起多種蔬菜病害，主要危害蔬菜包括番茄、萵苣、辣椒、甘藍(lán)、菠菜、大蒜，其中尤以危害番茄最為嚴(yán)重。美國、以色列、新西蘭等地均報(bào)道過由匍柄霉引起的番茄葉斑病，給當(dāng)?shù)胤焉a(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，我國東北、華北、華東和華南等地50萬畝的番茄灰葉斑病發(fā)生尤為嚴(yán)重。其中尤以山東壽光、海南?？?、廣西田陽發(fā)病最為嚴(yán)重，總發(fā)病面積超過10萬畝，損失超過千萬元。番茄是茄果類蔬菜中非常重要的一種蔬菜，是我國蔬菜種植業(yè)中的主要栽培作物之一。目前，中國番茄的種植、加工和出口都處于持續(xù)增長態(tài)勢，經(jīng)過20多年的發(fā)展中國已成為全球最重要的番茄制品生產(chǎn)國和出口國，是繼美國、歐盟之后的第三大生產(chǎn)地區(qū)和第一大出口國。自2002年以來番茄匍柄霉葉斑病在國內(nèi)各大番茄主產(chǎn)區(qū)陸續(xù)發(fā)生，漸由次要病害上升為主要病害，對(duì)我國番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來嚴(yán)重的影響。2002年在山東魚臺(tái)縣種植的3萬個(gè)大棚中，病棚率為43％，2003年病棚率為90％，防治不及時(shí)，番茄減產(chǎn)20％左右，有的甚至減產(chǎn)80％，同時(shí)造成番茄果實(shí)質(zhì)量下降。在貴州高山地區(qū)種植的進(jìn)口番茄品種表現(xiàn)出了對(duì)番茄灰葉斑病的高感性，2005年在貴陽市白云區(qū)、息烽縣、修文縣等地大面積暴發(fā)，由于番茄灰葉斑病在以往種植的品種上極少發(fā)現(xiàn)，農(nóng)民缺乏防治經(jīng)驗(yàn)，因而防治不力，給生產(chǎn)帶來毀滅性打擊。李寶聚等在蔬菜病害調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，北京大興、遼寧海城、河北廊坊、保定以及山東壽光等地都有該病的發(fā)生，但當(dāng)時(shí)并未造成產(chǎn)量損失2009～2016年的蔬菜病害調(diào)查過程中我們發(fā)現(xiàn)，番茄匍柄霉葉斑病發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，在海南省?？谑形餍沔?zhèn)龍頭村、靈山鎮(zhèn)大昌村，山東壽光洛城鎮(zhèn)黃家堯水村，山東壽光田柳鎮(zhèn)陳馬村、邵家?guī)X村、毛家村、閆家莊子村，廣西資源縣資源鎮(zhèn)同禾村鴨子背屯、廣西資源縣車田鄉(xiāng)黃保村、廣西資源縣東田苗族鄉(xiāng)海棠村等地都發(fā)現(xiàn)了番茄匍柄霉葉斑病的嚴(yán)重危害。尤其是在山東壽光田柳鎮(zhèn)陳馬村，番茄自定植后不久即開始零星發(fā)生匍柄霉葉斑病，遇到連陰天濕度大，溫度忽高忽低時(shí)，病害快速擴(kuò)展，至第6穗果座果時(shí)，棚內(nèi)發(fā)病率達(dá)到90％以上，嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量，給農(nóng)民帶來了巨大的損失。經(jīng)過系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)，茄匍柄霉菌(stemphyliumsolani)是國內(nèi)侵染番茄的主要種。植物病原微生物檢測通常采用形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段，方法各有優(yōu)劣，多元化的檢測手段才能更好的為生產(chǎn)服務(wù)。2000年日本榮研化學(xué)的notomi博士在傳統(tǒng)pcr技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)明了lamp技術(shù)，具有簡便、準(zhǔn)確、快速等突出優(yōu)點(diǎn)。但是目前尚未有很好的檢測茄匍柄霉菌(stemphyliumsolani)的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何檢測檢測茄匍柄霉菌(stemphyliumsolani)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了可以用于檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌或檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌所致病害的成套試劑，所述成套試劑包括名稱為stem14-fip的單鏈dna、名稱為stem14-bip的單鏈dna、名稱為stem14-f3的單鏈dna和名稱為stem14-b3的單鏈dna；所述stem14-fip為核苷酸序列是序列表中seqidno.1的單鏈dna；所述stem14-bip為核苷酸序列是序列表中seqidno.2的單鏈dna；所述stem14-f3為核苷酸序列是序列表中seqidno.3的單鏈dna；所述stem14-b3為核苷酸序列是序列表中seqidno.4的單鏈dna。上述成套試劑可由所述stem14-fip、所述stem14-bip、所述stem14-f3和所述stem14-b3組成。所述stem14-fip、所述stem14-bip、所述stem14-f3和所述stem14-b3的摩爾比可為8:8:1:1。所述stem14-fip、所述stem14-bip、所述stem14-f3和所述stem14-b3可獨(dú)立包裝，也可包裝在一起。上述成套試劑也可由所述stem14-fip、所述stem14-bip、所述stem14-f3、所述stem14-b3、名稱為stem14-lf25的單鏈dna和名稱為stem14-lb25的單鏈dna組成；所述stem14-lf25為核苷酸序列是序列表中seqidno.5的單鏈dna；所述stem14-lb25為核苷酸序列是序列表中seqidno.6的單鏈dna。所述stem14-fip、所述stem14-bip、所述stem14-f3、所述stem14-b3、所述stem14-lf25和所述stem14-lb25的摩爾比可為8:8:1:1:4:4。所述成套試劑的各單鏈dna可獨(dú)立包裝，也可包裝在一起。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了可以用于檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌或檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌所致病害的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)含有所述成套試劑和m；所述m為鏈置換型dna聚合酶和/或進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需要的其他試劑。所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需要的其他試劑可為反應(yīng)緩沖液和/或鈣黃綠素。所述反應(yīng)緩沖液具體可為榮研生物科技(中國)有限公司的2×反應(yīng)緩沖液(rm)。所述dna聚合酶具體可為bstdna聚合酶。所述bstdna聚合酶可為榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品。所述系統(tǒng)還可包括進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需要的儀器。所述儀器可為實(shí)時(shí)渾濁監(jiān)測儀la-300。具體來說，所述系統(tǒng)可由所述成套試劑和所述m組成，也可由所述成套試劑和所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需要的儀器組成，還可由所述成套試劑、所述m和所述進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需要的儀器組成。所述系統(tǒng)可為包括相關(guān)試劑的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述成套試劑的制備方法，所述方法包括將所述成套試劑的各單鏈dna分別單獨(dú)包裝。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述系統(tǒng)的制備方法，包括將所述成套試劑的各單鏈dna和/或進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增所需要的其它試劑分別單獨(dú)包裝。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述成套試劑的下述任一應(yīng)用：x1、在制備檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌產(chǎn)品中的應(yīng)用；x2、在制備檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌所致病害產(chǎn)品中的應(yīng)用。x3、在檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌中的應(yīng)用；x4、在檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌所致病害中的應(yīng)用。所述產(chǎn)品可為試劑或試劑盒。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌的方法，所述方法，包括：以待測樣品的基因組dna為模板，用所述成套試劑進(jìn)行l(wèi)amp，根據(jù)lamp反應(yīng)體系中物質(zhì)的變化確定所述待測樣品是否含有茄匍柄霉菌或是否為茄匍柄霉菌。所述lamp反應(yīng)體系中物質(zhì)的變化可通過擴(kuò)增曲線確定：所述lamp反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線為s型擴(kuò)增曲線，所述待測樣品含有或候選含有茄匍柄霉菌或?yàn)榛蚝蜻x為茄匍柄霉菌；所述lamp反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線非s型擴(kuò)增曲線，所述待測樣品不含有或候選不含有茄匍柄霉菌或非或候選非茄匍柄霉菌。所述lamp反應(yīng)體系中物質(zhì)的變化也可通過反應(yīng)體系顏色的變化確定，該反應(yīng)體系含有鈣黃綠素：在自然光下，所述lamp反應(yīng)體系為綠色，所述待測樣品含有或候選含有茄匍柄霉菌或?yàn)榛蚝蜻x為茄匍柄霉菌；所述lamp反應(yīng)體系為橙色，所述待測樣品不含有或候選不含有茄匍柄霉菌或非或候選非茄匍柄霉菌。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了檢測或輔助檢測茄匍柄霉菌所致病害的方法，所述方法包括：以待測樣品的基因組dna為模板，用所述成套試劑進(jìn)行l(wèi)amp，根據(jù)lamp反應(yīng)體系中物質(zhì)的變化確定所述待測樣品的病害是否為茄匍柄霉菌所致病害。所述lamp反應(yīng)體系中物質(zhì)的變化可通過擴(kuò)增曲線確定：所述lamp反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線為s型擴(kuò)增曲線，所述待測樣品的病害為或候選為茄匍柄霉菌所致病害；所述lamp反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線非s型擴(kuò)增曲線，所述待測樣品的病害不為或候選不為茄匍柄霉菌所致病害。所述lamp反應(yīng)體系中物質(zhì)的變化也可通過反應(yīng)體系顏色的變化確定，該反應(yīng)體系含有鈣黃綠素：在自然光下，所述lamp反應(yīng)體系為綠色，所述待測樣品的病害為或候選為茄匍柄霉菌所致病害；所述lamp反應(yīng)體系為橙色，所述待測樣品的病害不為或候選不為茄匍柄霉菌所致病害。上文中，所述成套試劑在lamp的反應(yīng)體系中的濃度均可為：所述stem14-fip40μm，所述stem14-bip40μm，所述stem14-f35μm，所述stem14-b35μm，所述stem14-lf2520μm，所述stem14-lb2520μm。lamp的反應(yīng)溫度均可為60-67℃，如65℃。lamp的反應(yīng)時(shí)間均可為20-60分鐘，如27-40分鐘。本發(fā)明的成套試劑具有以下特征優(yōu)點(diǎn)：1、實(shí)用性好：本發(fā)明的檢測茄匍柄霉菌的成套試劑實(shí)用性強(qiáng)，通過恒溫水浴鍋就可以完成全部反應(yīng)，而且添加鈣黃綠素后可以通過顯色反應(yīng)直觀的判斷反應(yīng)結(jié)果，省去了凝膠電泳檢測的步驟，降低了檢測成本，提高了檢測的安全性，增加了檢測技術(shù)的實(shí)用性。2、準(zhǔn)確度高：本發(fā)明的檢測茄匍柄霉菌的成套試劑可以特異檢測茄匍柄霉菌，其檢測茄匍柄霉菌的靈敏度可達(dá)2.4×100pg基因組dna/μl。3、檢測速度快：普通pcr反應(yīng)的檢測周期需要2小時(shí)以上，利用本發(fā)明的檢測茄匍柄霉菌的成套試劑全程僅需要60分鐘左右，檢測速度快，明顯優(yōu)于普通pcr檢測。附圖說明圖1為成套試劑1的特異性檢測結(jié)果。其中，1-17分別為17株茄匍柄霉菌，18-30分別為1株茄病鐮刀菌、1株灰葡萄孢菌、3株茄鏈格孢菌、2株多主棒孢、4株鏈格孢菌和1株蕓薹鏈格孢菌以及陰性對(duì)照。圖2為成套試劑1與成套試劑2的反應(yīng)時(shí)間的比較。圖3為成套試劑的可視化反應(yīng)。圖4為成套試劑1的靈敏度檢測。圖5為lamp檢測茄匍柄霉菌接種后番茄葉片后動(dòng)態(tài)變化。其中，n為對(duì)照，1-7分別為接種后6h、12h、24h、48h、72h、96h、108h番茄葉片dna。圖6為茄匍柄霉菌接種后番茄葉片后lamp反應(yīng)產(chǎn)物的電泳檢測結(jié)果。其中，n為對(duì)照，m為dna分子量標(biāo)準(zhǔn)，1-7分別為接種后6h、12h、24h、48h、72h、96h、108h番茄葉片dna。圖7為不同lamp引物的比較。其中，3表示lamp引物3，6表示lamp引物6，14表示實(shí)施例1的成套試劑1。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例1、檢測茄匍柄霉菌的成套試劑的制備本發(fā)明所提供的檢測茄匍柄霉菌的成套試劑為lamp引物，為成套試劑1和成套試劑2，成套試劑1由名稱分別為stem14-fip、stem14-bip、stem14-f3和stem14-b3的單鏈dna組成，成套試劑2由stem14-fip、stem14-bip、stem14-f3和stem14-b3以及名稱分別為stem14-lf25和stem14-lb25的單鏈dna組成，各單鏈dna信息如表1所示。其中，stem14-fip為核苷酸序列是序列表中seqidno.1的單鏈dna；stem14-bip為核苷酸序列是序列表中seqidno.2的單鏈dna；stem14-f3為核苷酸序列是序列表中seqidno.3的單鏈dna；stem14-b3為核苷酸序列是序列表中seqidno.4的單鏈dna。stem14-lf25為核苷酸序列是序列表中seqidno.5的單鏈dna；stem14-lb25為核苷酸序列是序列表中seqidno.6的單鏈dna。成套試劑1和成套試劑2中各單鏈dna均獨(dú)立包裝。成套試劑1中，stem14-fip、stem14-bip、stem14-f3和stem14-b3的摩爾比為8:8:1:1；成套試劑2中，stem14-fip、stem14-bip、stem14-f3、stem14-b3、stem14-lf25和stem14-lb25的摩爾比為8:8:1:1:4:4。表1、檢測茄匍柄霉菌的成套試劑引物名稱序列長度stem14-f3acgccgtaagtatccccg(序列表中序列3)18ntstem14-b3ggatggtcttgccgttgac(序列表中序列4)19ntstem14-fipagcaacaaatggcgcccaaccttcccgaaaatccgctgc(序列表中序列1)39ntstem14-bipcaggctaacgtccatgtaggcacgaccttgatctcacccttg(序列表中序列2)42ntstem14-lf25ccgcgatcaaatggaacgc(序列表中序列5)19ntstem14-lb25ctcaagtatgacagcacacacgg(序列表中序列6)23nt實(shí)施例2、檢測茄匍柄霉菌的成套試劑的特異性1、供試菌株選用供試菌株為：17株茄匍柄霉菌株、1株茄病鐮刀菌、1株灰葡萄孢菌、3株茄鏈格孢菌、2株多主棒孢、4株鏈格孢菌和1株蕓薹鏈格孢菌(表2)，供試菌株保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所蔬菜病害綜合防治課題組。表2、供試菌株信息表2中，編號(hào)為yqz11020901的茄匍柄霉菌(stemphyliumsolani)記載在文獻(xiàn)(xieetal.,firstreportofstemphyliumsolanicausingleafspotonwildeggplantinchina,can.j.plantpathol.,2016,vol.38,no.4,517–521)中；編號(hào)為hg09021201的灰霉病菌(botrytiscinerea)記載在文獻(xiàn)(唐明等，啶酰菌胺對(duì)黃瓜灰霉病防治效果的綜合評(píng)價(jià)，中國蔬菜，2016(2)：51-55)中；編號(hào)為qz08092301的茄鏈格孢菌(alternariasolani)、編號(hào)為hg0903150102的茄病鐮刀菌(fusariumsolani)和編號(hào)為sd21的多主棒孢菌(corynesporacassiicola)均記載在文獻(xiàn)(高葦?shù)?，黃瓜棒孢葉斑病的dot-elisa檢測技術(shù)研究，植物保護(hù)，2013,39(6)：69-73)中。編號(hào)為fq13072821和fq13080306的茄鏈格孢菌(alternariasolani)、編號(hào)為fq13080401和fq13072817的鏈格孢菌(alternariaalternata)記載在文獻(xiàn)(柴阿麗等，加工番茄早疫病病原菌鑒定，華北農(nóng)學(xué)報(bào)·2015，30(增刊):316-320)中。2、特異性檢測提取各供試菌株的基因組dna，對(duì)于每個(gè)菌株的基因組dna利用lamp反應(yīng)體系檢測實(shí)施例1的成套試劑1的特異性，利用去離子水替換基因組dna作為陰性對(duì)照。lamp反應(yīng)體系如下：其中，2×反應(yīng)緩沖液(rm)與bstdna聚合酶均為榮研生物科技(中國)有限公司產(chǎn)品。將各lamp反應(yīng)體系于實(shí)時(shí)渾濁監(jiān)測儀la-300中65℃反應(yīng)60min。結(jié)果顯示，17株茄匍柄霉菌株的反應(yīng)體系(圖1中1-17)中均有陽性擴(kuò)增，另外的1株茄病鐮刀菌、1株灰葡萄孢菌、3株茄鏈格孢菌、2株多主棒孢、4株鏈格孢菌和1株蕓薹鏈格孢菌以及陰性對(duì)照的反應(yīng)體系(圖1中18-30)中均沒有擴(kuò)增，結(jié)果表明，實(shí)施例1的成套試劑1能夠特異檢測茄匍柄霉菌。實(shí)施例3、成套試劑2中的stem14-lf25和stem14-lb25可以提高lamp反應(yīng)效率選取實(shí)施例2的菌株編號(hào)為fq11112407的茄匍柄霉菌的基因組dna檢測實(shí)施例1的成套試劑1和成套試劑2的lamp反應(yīng)效率。其中，成套試劑1的lamp反應(yīng)體系見實(shí)施例2，成套試劑2的反應(yīng)體系如下：將各lamp反應(yīng)體系于實(shí)時(shí)渾濁監(jiān)測儀la-300中65℃反應(yīng)60min。結(jié)果顯示，成套試劑1的反應(yīng)體系的反應(yīng)時(shí)間為40min左右；加入環(huán)引物stem14-lf25和stem14-lb25之后，成套試劑2的反應(yīng)體系中反應(yīng)時(shí)間能夠加速至27min左右(如圖2)，結(jié)果表明，加入環(huán)引物stem14-lf25和stem14-lb25后，能加速反應(yīng)時(shí)間13min左右，說明該環(huán)引物能切實(shí)有效加速lamp反應(yīng)。圖2中，1為成套試劑1的反應(yīng)體系，2為成套試劑2的反應(yīng)體系。實(shí)施例4、實(shí)施例1的成套試劑1的可視化反應(yīng)由于lamp反應(yīng)后能產(chǎn)產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，焦磷酸鎂能和橙色鈣黃綠素反應(yīng)，使反應(yīng)液變在自然條天下即可識(shí)別的綠色。因此向?qū)嵤├?的成套試劑2的反應(yīng)體系中添加fd(鈣黃綠素)，可通過反應(yīng)液顏色的變化確定是否發(fā)生lamp反應(yīng)。按照下述反應(yīng)體系用實(shí)施例1的成套試劑2檢測多主棒孢菌、鏈格孢菌、茄病鐮刀菌和茄匍柄霉菌，用去離子水替換菌株基因組dna作為陰性對(duì)照，反應(yīng)條件同實(shí)施例3：結(jié)果(圖3)顯示，只有茄匍柄霉菌的反應(yīng)體系中發(fā)生了顏色變化(自然光下反應(yīng)體系顏色由橙色變?yōu)榫G色)，其他菌株與陰性對(duì)照的反應(yīng)體系均未發(fā)生顏色變化(自然光下反應(yīng)體系保持為橙色)。圖3中，n為陰性對(duì)照，p為未添加反應(yīng)體系的空管，1為多主棒孢菌(sd21)，2為多主棒孢菌(hg15081901)，3為鏈格孢菌(fq13072817)，4為鏈格孢菌(xhl1506102)，5為茄病鐮刀菌(hg0903150102)，6為茄匍柄霉菌(yqz11020901)。實(shí)施例5、實(shí)施例1的成套試劑的靈敏度選取實(shí)施例2的菌株編號(hào)為yqz11020901的茄匍柄霉菌的基因組dna(初始濃度為2.4×105pg/μl)，進(jìn)行10倍梯度稀釋，檢測實(shí)施例1的成套試劑1的進(jìn)行靈敏性檢測，所用茄匍柄霉菌的基因組dna濃度分別為2.4×105pg/μl(6.26×109拷貝/μl)、2.4×104pg/μl(6.26×108拷貝/μl)、2.4×103pg/μl(6.26×107拷貝/μl)、2.4×102pg/μl(6.26×106拷貝/μl)、2.4×101pg/μl(6.26×105拷貝/μl)、2.4×100pg/μl(6.26×104拷貝/μl)、2.4×10-1pg/μl(6.26×103拷貝/μl)、2.4×10-2pg/μl(6.26×102拷貝/μl)、2.4×10-3pg/μl(62.6拷貝/μl)和2.4×10-4pg/μl(6.26拷貝/μl)，以去離子水替換基因組dna作為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見實(shí)施例2。結(jié)果如圖4所示，圖4中，1-10分別為2.4×105pg/μl、2.4×104pg/μl、2.4×103pg/μl、2.4×102pg/μl、2.4×101pg/μl、2.4×100pg/μl、2.4×10-1pg/μl、2.4×10-2pg/μl、2.4×10-3pg/μl和2.4×10-4pg/μl的茄匍柄霉菌的基因組dna，11為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，茄匍柄霉菌的基因組dna濃度在2.4×100pg/μl及其以上時(shí)均可有擴(kuò)增曲線，在茄匍柄霉菌的基因組dna濃度低于2.4×100pg/μl時(shí)及陰性對(duì)照均沒有擴(kuò)增曲線，表明，實(shí)施例1的成套試劑1的檢測茄匍柄霉菌的靈敏度是2.4×100pg基因組dna/μl。實(shí)施例6、茄匍柄霉接種后番茄葉片后動(dòng)態(tài)變化將低溫4℃保存菌株編號(hào)為yqz11020901的茄匍柄霉菌菌株采用pda平板活化，轉(zhuǎn)接至pd液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7d后，用豆?jié){機(jī)打碎菌絲后，用噴菌懸液法接種番茄葉片接種3-4葉期的番茄植株，保溫保濕，接種后每隔6h、12h、24h、48h、72h、96h、108h觀察記錄其癥狀，并分別收集和提取葉片總dna，利用實(shí)施例1的成套試劑1進(jìn)行qrt-pcr檢測，利用未接種茄匍柄霉菌的健康番茄葉片作為對(duì)照。利用實(shí)施例2的lamp反應(yīng)體系和反應(yīng)條件檢測接種后病原菌含量在活體植株體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果(圖5)顯示，茄匍柄霉菌菌株接種12h至108h的反應(yīng)液均變?yōu)榫G色(圖5中2-7)，茄匍柄霉菌菌株接種6h的反應(yīng)液(圖5中1)以及對(duì)照(圖5中n)的反應(yīng)液均為橙色，其中接種12h的反應(yīng)液綠色相對(duì)較淺，而后面相對(duì)較深。利用2％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)物的檢測，結(jié)果顯示茄匍柄霉菌菌株接種6h沒有條帶，而茄匍柄霉菌菌株接種12h至108h的反應(yīng)液均為梯形條帶，且條帶的亮度梯次加深(圖6)。結(jié)果表明，試驗(yàn)條件下，利用實(shí)施例1的成套試劑可最快檢測茄匍柄霉菌侵染12h的番茄葉片，且茄匍柄霉菌菌量隨侵染時(shí)間推移，菌量逐漸增多，108h時(shí)菌量致病番茄葉片達(dá)9級(jí)，病斑覆蓋整個(gè)番茄葉片。對(duì)比例1、不同lamp引物檢測茄匍柄霉菌的比較利用實(shí)施例1的成套試劑1以及l(fā)amp引物3與lamp引物6分別對(duì)菌株編號(hào)為yqz11020901的茄匍柄霉菌的基因組dna進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均同實(shí)施例2。lamp引物3與lamp引物6的各引物見表3。表3、lamp引物信息表結(jié)果如圖7所示，結(jié)果顯示，實(shí)施例1的成套試劑1的反應(yīng)體系中在40min左右開始大量擴(kuò)增，而lamp引物3在60min左右開始大量擴(kuò)增，lamp引物6在90min內(nèi)均無擴(kuò)增。結(jié)果表明，實(shí)施例1的成套試劑1進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)檢測茄匍柄霉菌的效果最好。<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所<120>檢測茄匍柄霉菌的成套試劑及應(yīng)用<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>39<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1agcaacaaatggcgcccaaccttcccgaaaatccgctgc39<210>2<211>42<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2caggctaacgtccatgtaggcacgaccttgatctcacccttg42<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3acgccgtaagtatccccg18<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4ggatggtcttgccgttgac19<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5ccgcgatcaaatggaacgc19<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6ctcaagtatgacagcacacacgg23當(dāng)前第1頁12