本發(fā)明涉及分子生態(tài)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，特指水體環(huán)境dna樣品的魚種濃度分析，具體指一種基于環(huán)境dna技術(shù)的魚類自然繁殖監(jiān)測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：由于水利工程建設(shè)、環(huán)境污染和變遷、過度捕撈等原因，長(zhǎng)江流域等自然水體中，魚類種群數(shù)量及多樣性逐年遞減，大壩的建設(shè)阻斷了洄游性魚類通道，比如中華鱘由于葛洲壩工程的建立無法上溯至原有產(chǎn)卵場(chǎng)繁殖，在葛洲壩下方形成新的產(chǎn)卵場(chǎng)。比如庫(kù)區(qū)的建立使原本流水型魚類占主體的魚類群落結(jié)構(gòu)慢慢演化成以靜水魚類居多的結(jié)構(gòu)組成。根據(jù)多年的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)三峽大壩建立后，四大家魚的數(shù)量銳減，為了避免大壩對(duì)家魚產(chǎn)生的不良影響，三峽集團(tuán)組織開展了針對(duì)四大家魚繁殖的生態(tài)調(diào)度，以卵苗資源量監(jiān)測(cè)方法為主，輔以繁殖群體數(shù)量監(jiān)測(cè)及水文監(jiān)測(cè)，評(píng)估三峽水庫(kù)針對(duì)家魚自然繁殖的試驗(yàn)性生態(tài)調(diào)度效果，試驗(yàn)給出了水溫、漲水持續(xù)天數(shù)、洪峰流量、初始流量、流量漲幅等因素與家魚產(chǎn)卵行為之間的關(guān)系。并通過對(duì)河流分段設(shè)置固定站位和流動(dòng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)結(jié)合觀測(cè)的的方式，根據(jù)捕撈不同發(fā)育期的魚卵和早期發(fā)育的魚苗，結(jié)合當(dāng)時(shí)的水溫條件，推算出魚卵(苗)發(fā)育所需的時(shí)間，然后在根據(jù)當(dāng)時(shí)江段平均流速推算出卵(苗)的漂流距離；有時(shí)也結(jié)合解剖親魚及食卵魚，了解親魚性腺發(fā)育情況和群眾生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)判定某個(gè)產(chǎn)卵場(chǎng)較為準(zhǔn)確的位置。上述方法雖然可以監(jiān)測(cè)家魚產(chǎn)卵行為及定位產(chǎn)卵場(chǎng)范圍，但由于不同河流流量差異、水文狀況不一，推算出來的產(chǎn)卵場(chǎng)江段存在較大的不確定性。且傳統(tǒng)方法勞動(dòng)強(qiáng)度大，操作難度高，所以，尋找一種能夠快速、方便監(jiān)測(cè)魚類自然繁殖行為的方法是十分必要的。環(huán)境dna(環(huán)境dna)是指從有機(jī)體脫落釋放進(jìn)入到大自然環(huán)境中(如空氣、水、土壤)的dna，包括細(xì)胞中的dna和細(xì)胞破碎后游離出細(xì)胞外的dna分子。環(huán)境dna技術(shù)就是直接從水、土壤、沉積物等環(huán)境樣本中提取dna片段，然后通過pcr和測(cè)序等分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)來定性或定量目標(biāo)產(chǎn)物，從而確定目標(biāo)生物在該環(huán)境中的分布及功能特征的研究方法。jessica等對(duì)美國(guó)斯塔林湖鯉魚分布情況及其環(huán)境dna做了研究。多年嚴(yán)密的監(jiān)測(cè)研究使其對(duì)該湖泊中鯉魚的分布及密度情況了如指掌，在湖泊22個(gè)地點(diǎn)采取表層水、次表面水及沉積物進(jìn)行鯉魚dna提取，結(jié)果顯示，水體樣品中鯉魚分布高密度區(qū)的環(huán)境dna含量高，反之亦然，而沉積物環(huán)境dna則無變化。另外，表層水和次表層水的dna含量并無顯著差異，即edna濃度的垂向分布成均勻狀態(tài)，而在距離目標(biāo)種十幾米到幾百米的較小空間范圍內(nèi)edna濃度發(fā)生從大到小的明顯變化，即edna濃度在水平方向上呈不規(guī)律分布狀態(tài)。其實(shí)，edna濃度是否能夠準(zhǔn)確反應(yīng)出采樣點(diǎn)的種群分布情況與edna的降解密切相關(guān)，不同采樣點(diǎn)，取樣位置受水質(zhì)、ph值、光照、腐殖質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)等多種因素的影響，其降解速率不同，檢測(cè)出的edna濃度分布情況也不一樣。如上述jessica研究結(jié)果顯示，魚類高密度區(qū)的edna濃度>低密度區(qū)的edna濃度>沉積物的edna濃度，而在pilliod的研究中，不同采樣位置檢測(cè)的edna濃度值并無明顯變化。近年來，環(huán)境dna技術(shù)被廣泛應(yīng)用于魚類物種鑒定、多樣性分析及定量分析中。相對(duì)于傳統(tǒng)的直接觀察法來講水環(huán)境dna的基因鑒定方法在推斷水生物種地理分布中更易獲得樣品，且由于小片段dna可在干燥、冷凍或無光條件下可存在很長(zhǎng)一段時(shí)間，即使在生物密度很低的情況下，環(huán)境dna技術(shù)仍有效，且無論水體狀態(tài)是固定還是流動(dòng)的情況，這也使得環(huán)境dna技術(shù)成為生態(tài)保護(hù)學(xué)研究中的一項(xiàng)非常有價(jià)值的工具。ddpcr指微滴數(shù)字pcr系統(tǒng)，是近期發(fā)展起來的一類新興pcr技術(shù)，其熒光信號(hào)的產(chǎn)生原理與qpcr相同，微滴發(fā)生器可將含有核酸分子的熒光pcr反應(yīng)體系“分割”成數(shù)萬個(gè)納米級(jí)的微滴，核酸分子在微滴中隨機(jī)分裝，每個(gè)微滴或不含待檢測(cè)核酸靶分子，或者含有至少一個(gè)待檢核酸靶分子，且每個(gè)微滴都是一個(gè)獨(dú)立的pcr反應(yīng)器。經(jīng)pcr擴(kuò)增后，分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，沒有熒光信號(hào)的判讀為“0”，從而將熒光模擬信號(hào)數(shù)字化，最終根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的比例，分析軟件可直接給出待檢靶分子的拷貝數(shù)濃度。所以，采用ddpcr方法進(jìn)行濃度檢測(cè)是不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的，大量實(shí)驗(yàn)證明，ddpcr相比于qpcr具有更好的準(zhǔn)確性，特別針對(duì)物種濃度較低情況下的定量分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服了上述傳統(tǒng)方法的不足，提供一種不依賴魚種本身，采用魚類線粒體基因通過ddpcr分析獲取目標(biāo)種dna濃度變化情況，從而判斷魚類自然繁殖行為的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種基于環(huán)境dna技術(shù)的魚類自然繁殖監(jiān)測(cè)方法，包括以下步驟：步驟1：根據(jù)研究水域大小，合理布置采樣點(diǎn)，采集水樣。步驟2：將上述水樣于4℃冷藏保存，并在24h內(nèi)，采用0.22μm孔徑的濾膜進(jìn)行抽濾，并將濾膜放置-20℃度保存至dna提取。步驟3：采用水樣dna提取試劑盒提取dna基因組。所述dna提取試劑盒廠家為waterdnakit(omega)。步驟4：利用qpcr對(duì)目的片段進(jìn)行引物、探針有效性檢測(cè)，在實(shí)驗(yàn)體系內(nèi)，加入相對(duì)應(yīng)體積的引物、探針、模板dna、rox參比熒光及mix后，與陰性對(duì)照、陽性對(duì)照一起進(jìn)行熒光定量pcr擴(kuò)增。驗(yàn)證引物、探針有效性后，進(jìn)行ddpcr。步驟5：通過同一采樣點(diǎn)監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)連續(xù)日的樣品采集、edna濃度大小分析，初步判斷目標(biāo)種是否發(fā)生產(chǎn)卵行為；通過不同采樣點(diǎn)同時(shí)間的edna濃度大小比較，推測(cè)產(chǎn)卵場(chǎng)位置。所述步驟1的采集水樣，為不同深度分層采集水樣混合后得到的1-2l水體。所述步驟2的抽濾，在水樣量較大的情況下，可采用多張濾膜進(jìn)行抽濾，抽濾后將得到的濾膜周邊空余部分減去，以減少反應(yīng)液的使用量。所述步驟3的dna提取過程中，將每張剪邊濾膜沿中心線剪成4個(gè)面積相同的扇形后，加入裝有反應(yīng)液的離心管中，置于超聲波儀器中超聲處理，且整個(gè)超聲過程對(duì)離心管進(jìn)行間斷渦旋，以便最大限度的獲取濾膜上的dna，然后根據(jù)試劑盒步驟進(jìn)行dna提取。具體步驟為：將剪好的濾膜，放入50ml離心管中，加入反應(yīng)液，置于kq5200e型超聲波清洗儀器(超聲功率400w)中進(jìn)行超聲處理，超聲過程中根據(jù)具體粘附情況不定時(shí)的將附著物較多的濾膜離心管放在渦旋振蕩器上進(jìn)行渦旋，以便最大限度的獲取濾膜上的dna，超聲處理直至濾膜上的附著物全部進(jìn)入反應(yīng)液中，整個(gè)超聲處理過程不加熱。所述步驟4中，qpcr反應(yīng)體系為20μl，dna模板2μl，引物、探針、rox各0.4μl，taqpremix10μl，ddh206.4μl；pcr擴(kuò)增條件為：94℃3min預(yù)變性，94℃15s變性，60℃30s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。ddpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，其中dna模板2μl，引物1.8μl，探針0.5μl，taqpremix10μl，rnase/dnase-freewater3.9μl；將配置好的20μlpcr反應(yīng)液，轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡(dg8cartridge)sample孔中，再加入70μl微滴油至oil孔中，利用qx2000微滴式數(shù)字pcr儀的微滴生成器制備反應(yīng)微滴；將制備好的反應(yīng)微滴分別轉(zhuǎn)移至96孔pcr反應(yīng)板中對(duì)應(yīng)的反應(yīng)孔中，用鋁膜熱封(180℃，5sec)后，于普通pcr儀擴(kuò)增，其擴(kuò)增條件為：95℃5min預(yù)變性，95℃30s變性，60℃1min退火延伸，40個(gè)循環(huán)，98℃10minhold。本發(fā)明有益效果：本發(fā)明家魚在合適的水溫條件下，會(huì)首先聚集在產(chǎn)卵場(chǎng)范圍，然后待適宜漲水條件下發(fā)生產(chǎn)卵，這種自然的聚群、產(chǎn)卵行為會(huì)增加釋放到水體中的家魚dna，這種dna濃度的變化是本發(fā)明所采用技術(shù)用以反應(yīng)家魚產(chǎn)卵行為和定位產(chǎn)卵場(chǎng)的基礎(chǔ)。由于家魚集群產(chǎn)卵行為僅持續(xù)較短一段時(shí)間，且長(zhǎng)江干流水體流動(dòng)性較強(qiáng)，流場(chǎng)變化復(fù)雜，家魚edna分散速度較快被采集到的幾率降低，那么以多年傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)得到的家魚產(chǎn)卵時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)時(shí)采樣，不僅可以避免dna降解帶來的結(jié)果偏差，而且一旦樣品中可以檢測(cè)到dna，從理論上講也可較好的反應(yīng)距離采樣點(diǎn)較近的種群密度在采樣時(shí)間段的分布情況，即采樣時(shí)間段edna濃度高的位置，物種分布密度較大，反之亦然。1、該方法不依賴于魚種的捕獲，只需在目標(biāo)水體一定范圍、時(shí)間內(nèi)進(jìn)行水樣采集即可快速、簡(jiǎn)便的獲取目標(biāo)種信息。對(duì)于一些珍稀特有魚類及較難捕獲的魚種，該方法也較傳統(tǒng)捕撈調(diào)查更為有效。2、利用ddpcr進(jìn)行定量分析，無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，簡(jiǎn)化定量實(shí)驗(yàn)操作步驟，且相比于傳統(tǒng)的qpcr，ddpcr具有更高的檢測(cè)靈敏度，對(duì)于一些珍稀特有魚類在濃度很低的情況下一樣可以進(jìn)行濃度檢測(cè)。3、通過qpcr驗(yàn)證引物、探針有效性后，采用ddpcr對(duì)水樣進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品不需重復(fù)測(cè)定。4、由于家魚在產(chǎn)卵期間釋放到水體中的dna高出平時(shí)聚群不發(fā)生產(chǎn)卵時(shí)很多，通過同一采樣點(diǎn)監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)連續(xù)多日的樣品采集、分析edna濃度大小可初步判斷家魚是否發(fā)生產(chǎn)卵行為。5、由于家魚在產(chǎn)卵前會(huì)在產(chǎn)卵場(chǎng)范圍發(fā)生聚群行為，那么產(chǎn)卵場(chǎng)范圍所采水樣的家魚edna濃度會(huì)高于其他采樣點(diǎn)。通過不同采樣點(diǎn)同時(shí)間的edna濃度大小比較，可推測(cè)產(chǎn)卵場(chǎng)位置。附圖說明圖1為本發(fā)明在廟嘴碼頭至后江沱約36公里范圍內(nèi)，三峽水庫(kù)2016年第一次調(diào)度期間家魚edna連續(xù)5天的的日均總濃度；圖2為本發(fā)明在廟嘴碼頭至后江沱約36公里范圍內(nèi)，三峽水庫(kù)2016年第一次調(diào)度期間連續(xù)5天每個(gè)斷面的家魚edna濃度；圖3為本發(fā)明在廟嘴碼頭至后江沱約36公里范圍內(nèi)，三峽水庫(kù)2016年第二次調(diào)度期間家魚edna連續(xù)4天的的日均總濃度；圖4為本發(fā)明在廟嘴碼頭至后江沱約36公里范圍內(nèi)，三峽水庫(kù)2016年第二次調(diào)度期間連續(xù)4天每個(gè)斷面的家魚edna濃度；圖5為本發(fā)明監(jiān)測(cè)期間第六個(gè)斷面(宜都)四大家魚魚卵密度變化過程；圖6紅花套站點(diǎn)分布；圖7紅花套(去除h1)11個(gè)站點(diǎn)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。實(shí)施例1三峽水庫(kù)2016年第一次調(diào)度時(shí)(2016年6月8日-12日)家魚的自然繁殖情況。1、樣品采集根據(jù)多年傳統(tǒng)調(diào)查結(jié)果，在宜昌廟嘴碼頭至后江沱約36公里范圍江段內(nèi)，設(shè)置6個(gè)斷面采集水樣，每個(gè)斷面設(shè)置左、中、右三個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)分別采取不同深度水層進(jìn)行混合的水樣2l，并與4℃培養(yǎng)箱中保存。采樣點(diǎn)具體地理位置見表1。2、dna提取將上述水樣在24h內(nèi)，通過孔徑0.22μm的脂溶性濾膜真空抽濾，根據(jù)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)比對(duì)，每升水體宜采用1張濾膜，故將過濾好的2張濾膜放入50ml離心管中-20℃保存?zhèn)溆?。采用專業(yè)的水樣dna提取試劑盒thewaterdnakit(omega)對(duì)上述濾膜進(jìn)行dna提取。提取前先將濾膜周邊空白部分剪掉，以使反應(yīng)液充分浸泡濾膜，將每張濾膜沿中心線剪成4個(gè)扇形，放入50ml離心管中，加入3mlslx反應(yīng)液和500mg微型玻璃珠，渦旋3分鐘或至反應(yīng)液均勻布滿濾膜，放入超聲儀進(jìn)行超聲波處理，期間間斷渦旋離心管，以使濾膜上粘有的dna充分溶解在反應(yīng)液中，之后根據(jù)試劑盒說明書的步驟進(jìn)行dna提取，將提取好的dna-20℃保存?zhèn)溆谩１?不同斷面采樣點(diǎn)的具體地址位置3、ddpcr擴(kuò)增首先將設(shè)計(jì)好的引物、探針在qpcr上用魚體或濃度較高的樣品進(jìn)行有效性驗(yàn)證后。引物序列為：sequencelisting1：both2-f(qpcr)5’-ggccggaacaggatgaacagtt-3’sequencelisting2：both2-r(qpcr)5’-taatagttgtggtgatgaagttaattg-3’探針序列為：sequencelisting3：probe25’-fam-cacgcaggagcatccgtagacct-bhq-3’qpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，其中dna模板2μl，引物、探針、rox各0.4μl，tappremix10μl，ddh206.4μl；擴(kuò)增條件為：94℃3min預(yù)變性，94℃15s變性，60℃30s退火延伸，40個(gè)循環(huán)。ddpcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為20μl，其中dna模板2μl，引物1.8μl，探針0.5μl，tappremix10μl,rnase/dnase-freewater3.9μl；擴(kuò)增條件為：95℃5min預(yù)變性，95℃30s變性，60℃1min退火延伸，40個(gè)循環(huán)，98℃10minhold。擴(kuò)增的目的片段序列為sequencelisting4：ggccggaacaggatgaacagtttacccgccactcgcgggtaatcttgctcacgcaggagcatccgtagacctaacaattttctccctccacttagcaggtgtatcatcaattttaggggcaattaacttcatcaccacaactatta4、濃度分析根據(jù)ddpcr的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得知每個(gè)樣品包含的目標(biāo)種拷貝數(shù)，見表2，其推算的家魚日均edna總濃度見圖1，每個(gè)斷面的家魚edna濃度見圖2。比較監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)6個(gè)斷面家魚edna日均總濃度變化情況，可知，第一次生態(tài)調(diào)度第五天時(shí)家魚環(huán)境dna含量發(fā)生大量增長(zhǎng)，與前幾日的edna濃度方差分析呈顯著性差異，判定此次調(diào)度期間家魚發(fā)生產(chǎn)卵行為，且未發(fā)生產(chǎn)卵前家魚的edna濃度基數(shù)較小。比較同一天每個(gè)斷面的家魚dna濃度值，可知最大濃度值發(fā)生在第五天第四個(gè)斷面。另外，每個(gè)斷面dna濃度值比較發(fā)現(xiàn)第四、五個(gè)斷面較其他斷面濃度值高，由于水體流動(dòng)方向?yàn)閿嗝嬉恢翑嗝媪耘卸〝嗝嫠母浇鼮楫a(chǎn)卵場(chǎng)位置。表2第一次調(diào)度期間檢測(cè)到的家魚dna拷貝數(shù)實(shí)施例2：三峽水庫(kù)2016年第二次調(diào)度時(shí)(2016年6月19日-22日)家魚的自然繁殖情況，方法步驟與實(shí)施例一相同，表3為6個(gè)斷面18個(gè)采樣點(diǎn)連續(xù)4天時(shí)間ddpcr定量分析得到的家魚dna拷貝數(shù)，其日均總濃度見圖3，每個(gè)斷面的濃度見圖4。表3.第二次調(diào)度期間檢測(cè)到的家魚dna拷貝數(shù)根據(jù)ddpcr的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得知每個(gè)樣品包含的目標(biāo)種拷貝數(shù)，比較監(jiān)測(cè)時(shí)間內(nèi)6個(gè)斷面家魚edna日均總dna濃度變化情況，可知，第二次生態(tài)調(diào)度第一天時(shí)家魚環(huán)境dna含量最大。比較同一天每個(gè)斷面的家魚dna濃度值，可知最大濃度值發(fā)生在監(jiān)測(cè)第一天第四個(gè)斷面。判定此次調(diào)度期間家魚發(fā)生產(chǎn)卵行為，且判定斷面四附近為產(chǎn)卵場(chǎng)位置為了驗(yàn)證環(huán)境dna方法是否可以準(zhǔn)確的判定魚類繁殖行為，監(jiān)測(cè)期間內(nèi)在第六個(gè)斷面同時(shí)設(shè)置了傳統(tǒng)卵苗捕撈點(diǎn)每日9:00，16:00放置一張表層弶網(wǎng)采取卵苗約1小時(shí)，將采集到的卵苗以大小、透明度、色澤進(jìn)行簡(jiǎn)單分類，將疑似家魚的卵苗帶回室內(nèi)培養(yǎng)至可分辨期，同時(shí)記錄當(dāng)日的流量、江水流速、斷面流速等指標(biāo)，用于卵苗密度及資源量統(tǒng)計(jì)。同時(shí)，使用聲納探測(cè)設(shè)備在產(chǎn)卵場(chǎng)進(jìn)行走航式探測(cè)，通過對(duì)回聲信號(hào)的分析判斷四大家魚繁殖親魚數(shù)量及信號(hào)分布。早期資源結(jié)果顯示自2016年5月30日起開始采集到四大家魚魚卵，宜都斷面魚卵密度和徑流量日變化過程見圖5，可知在6月5日、12日及21日出現(xiàn)了3次產(chǎn)卵高峰期，產(chǎn)卵時(shí)間主要集中在5月下旬至6月份，7月份則基本無大的卵汛高峰。edna監(jiān)測(cè)期間采集的四大家魚魚卵密度與相同斷面edna濃度如表4所示，通過魚卵密度與edna濃度間的相關(guān)性分析，可知，第六個(gè)斷面采集的魚卵密度與該斷面檢測(cè)到的edna濃度呈極顯著相關(guān)(p＝0.0071<0.01),說明edna濃度可以很好的反應(yīng)出采樣點(diǎn)較近距離內(nèi)的家魚密度分布情況，高密度區(qū)的edna濃度較大，低密度區(qū)的edna濃度較小。聲納監(jiān)測(cè)站點(diǎn)布置如圖6所示，結(jié)果如圖7所示，在紅花套站點(diǎn)中h2、h5兩個(gè)站點(diǎn)在18-20日監(jiān)測(cè)到大量魚群，這與環(huán)境dna監(jiān)測(cè)顯示的較高dna濃度值發(fā)生的時(shí)間(6月19日)及地點(diǎn)(第四及第五斷面)相吻合。該方法根據(jù)ddpcr檢測(cè)的濃度結(jié)果，判定在兩次調(diào)度期間的6月12日、6月19日左右均發(fā)生了家魚產(chǎn)卵行為，且初步判斷產(chǎn)卵場(chǎng)位于第4個(gè)斷面附近。與此同時(shí)，從上述傳統(tǒng)的卵苗捕撈調(diào)查中，可以得知兩次調(diào)度期間6月12日、6月20及21日均出現(xiàn)了卵汛高峰；另外，聲納走航探測(cè)發(fā)現(xiàn)家魚親魚在調(diào)度期間較多的聚集在第四、第五個(gè)斷面附近，證明了該發(fā)明方法的有效性。所以，綜上所述，基于環(huán)境dna的魚種濃度監(jiān)測(cè)方法可以有效的反應(yīng)家魚的自然繁殖情況。表4edna監(jiān)測(cè)期間家魚卵苗密度與濃度值時(shí)間6-86-96-106-116-126-196-206-216-22卵苗密度(a/m3)5.191.531.639.1658.1800.6243.7419.1edna濃度(copies/μl)108.738.721.971.35735.7653394.3801.71677.3盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的實(shí)施例。。sequencelisting<110>中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)中華鱘研究所<120>基于環(huán)境dna技術(shù)的魚類自然繁殖監(jiān)測(cè)方法<130>2015<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>22<212>dna<213>asiancarps<400>1ggccggaacaggatgaacagtt22<210>2<211>27<212>dna<213>asiancarps<400>2taatagttgtggtgatgaagttaattg27<210>3<211>23<212>dna<213>asiancarps<400>3cacgcaggagcatccgtagacct23<210>4<211>146<212>dna<213>asiancarps<400>4ggccggaacaggatgaacagtttacccgccactcgcgggtaatcttgctcacgcaggagc60atccgtagacctaacaattttctccctccacttagcaggtgtatcatcaattttaggggc120aattaacttcatcaccacaactatta146當(dāng)前第1頁(yè)12