本發(fā)明涉及一種新型動(dòng)物來源活性多肽及其制備方法，具體涉及一種通過陽離子交換hplc以及兩步反相hplc分離獲得新型生物活性多肽的方法。

背景技術(shù)：

生物毒素是一種重要的生命現(xiàn)象，是生物界在億萬年進(jìn)化過程中為了生存而形成的，是一個(gè)巨大的潛在發(fā)現(xiàn)新的生物活性分子的重要資源。目前國際上已經(jīng)成功篩選到一些生物毒素分子用于治療某些相關(guān)疾病或作為新型藥物的設(shè)計(jì)參考。蜘蛛產(chǎn)生各種作用于神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)毒素，其神經(jīng)毒素根據(jù)它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為蛋白多肽類神經(jīng)毒素和多胺類神經(jīng)毒素。其中蜘蛛多肽神經(jīng)毒素最重要，蜘蛛多肽類神經(jīng)毒素根據(jù)它們的功能和分子特征可分為兩種類型:第一種是低分子量多肽類，它們能與興奮性細(xì)胞膜上的陽離子通道相互作用；第二種是高分子量多肽類，它們與突觸前膜的受體組分及增強(qiáng)神經(jīng)介質(zhì)的分泌作用密切相關(guān)。蜘蛛毒液已成為神經(jīng)毒素的一個(gè)重要新來源，而且蜘蛛毒液中特異性藥物和毒素分子也是我們尋找農(nóng)業(yè)殺蟲劑的較好模式分子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在于提供一種從廣西捕鳥蛛粗毒中制備新型生物活性多肽的方法，所述的生物活性多肽為蜘蛛抑鈣肽-v（spgp-v），其氨基酸序列為：

nh2-glucysargtrptyrleuglyglycysserglnaspglyaspcyscyslys

hisleuglncyshisserasntyrglutrpcysvaltrpaspglythrpheser-oh。

所述的蜘蛛抑鈣肽-v的n端第2位半胱氨酸和第16位半胱氨酸之間，n端第9位半胱氨酸和第21位半胱氨酸之間，n端第15位半胱氨酸和第28位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

所述方法包括：（1）將廣西捕鳥蛛粗毒干粉用雙蒸水溶解配成5mg/ml的毒素溶液，12000rpm離心5min,置于4℃保存。粗毒上樣陽離子交換hplc進(jìn)行第一步分離。采用waters650型hplc、美國pharmacia公司的hiprep^tm16/10cmff預(yù)裝柱進(jìn)行分離。486檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長為215nm。流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流速為3ml/min。洗脫液分別為a相0.1m磷酸二氫鈉,b相0.1m磷酸氫二鈉,c相1m氯化鈉,d相雙蒸水（ddh2o）。其中a液和b液用來調(diào)節(jié)洗脫液的ph值，采用氯化鈉梯度洗脫。上述經(jīng)陽離子交換hplc分離后收集的各洗脫峰分別上樣反相hplc進(jìn)行進(jìn)一步純化。（2）反相高效液相色譜分離脫鹽純化：在pharmacia公司的akta蛋白純化系統(tǒng)上完成，采用大連依利特公司的c18反相制備柱。（3）第三步采用分析型vydacc18rp-hplc反相柱(218tp54,4.6×250mm)于分析型waters2690高效液相色譜儀上進(jìn)行梯度洗脫，996檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長為280nm，流動(dòng)相為含0.1%tfa的水（a）和乙腈（b），洗脫速度為1ml/min，柱溫為40℃。

（2）通過上述陽離子交換hplc以及兩步反相hplc共三步分離獲得的spgp-v，運(yùn)用質(zhì)譜鑒定純度達(dá)到98%以上，其分子量約為4111.7da，經(jīng)序列測(cè)定，該多肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)由35個(gè)氨基酸殘基組成，其中含6個(gè)半胱氨酸并形成三對(duì)二硫鍵，c-端未酰胺化。多肽spgp-v純化凍干粉的理化性狀為白色或類白色疏松體，無氣味，極易溶解于水，水溶液近于無色透明。

附圖說明

圖1是廣西捕鳥蛛粗毒陽離子交換hplc圖譜。箭頭表示目的峰，縱坐標(biāo)表示洗脫峰在280nm的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間。

圖2是廣西捕鳥蛛粗毒目的陽離子交換峰反相hplc圖譜?！?”表示目的峰，縱坐標(biāo)表示各個(gè)洗脫峰在280nm下的吸收值，橫坐標(biāo)表示洗脫時(shí)間。

圖3是spgp-v的反相hplc圖譜。

圖4是spgp-v的maldi-tof質(zhì)譜圖譜。

具體實(shí)施方式

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1粗毒的獲取

廣西捕鳥蛛采集于廣西省境內(nèi)的山區(qū)，粗毒毒液采于雌性蛛種。簡述如下：使蜘蛛張開螯爪伸入塑料杯中，然后用5～10v的脈沖電流刺激兩螯肢基部外側(cè)3～5s。蜘蛛感受電刺激后，即用觸肢緊緊抱住杯壁，同時(shí)將螯爪有力刺向杯內(nèi)壁并射出毒液。毒液收集后，放入-40℃冷凍干燥機(jī)中經(jīng)真空冷凍干燥成淺黃色或白色粉末即為粗毒。

1.2粗毒的分級(jí)分離及質(zhì)譜鑒定

spgp-v的分離純化分為三步。（1）、陽離子交換柱層析。在waters650e色譜系統(tǒng)上進(jìn)行，層析柱子采用watersp-1型陽離子交換柱（10mm×100mm）。稱取10mg粗毒，溶于1ml雙蒸水，并于臺(tái)式高速離心機(jī)（國產(chǎn)）上離心10min（轉(zhuǎn)速為10,000rpm），沉淀不溶物。取上清液進(jìn)樣,在配備有486紫外檢測(cè)器的waters650e高級(jí)蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)上，采用waterscm(300nm)填料，使用常壓自裝柱（10mm×100mm）進(jìn)行陽離子交換層析。采用四元梯度洗脫：(a)0.1mol/l磷酸二氫鈉；(b)0.1mol/l磷酸氫二鈉；(c)1.0mol/l氯化鈉；(d)雙蒸水（ddh2o）。其中a液和b液用來調(diào)節(jié)洗脫液的ph值，采用氯化鈉梯度洗脫。在280nm波長室溫檢測(cè)并收集所有被洗脫峰，找出目的峰后再進(jìn)一步進(jìn)行反相脫鹽處理。找出目的峰后再進(jìn)一步進(jìn)行反相脫鹽處理。脫鹽純化在waters515pump＆empower高效液相色譜工作站,2487檢測(cè)器）上進(jìn)行。采用分離柱為phenomenexc18柱（4.6mm×250mm）。一次進(jìn)樣200～300ml。先用100%ddh2o（含0.1%tfa）沖洗20min，將混在樣品中的鹽分洗滌干凈（紫外檢測(cè)吸收值為零）之后，用乙腈（含0.1%tfa）溶液進(jìn)行梯度洗脫。流速為3.0ml/min，檢測(cè)波長為280/215nm，柱溫為室溫。收集每個(gè)洗脫峰，用質(zhì)譜鑒定它們所含成分的分子量，找出含有spgp-v的洗脫峰并進(jìn)行冷凍干燥。最后，目的樣品再在waters515pump＆empower高效液相色譜工作站,2487檢測(cè)器），或者反相hplc純化系統(tǒng)（waters公司，alliance2690hplc＆millennium32高效液相色譜工作站，996pda檢測(cè)器上進(jìn)行純化。分離柱：為phenomenexc18柱（4.6mm×250mm）；洗脫液分別為：a液（0.1％tfa/h2o）、b液（0.1％tfa/can）,流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長為280/215nm，柱溫箱溫度為40℃。收集洗脫峰，并用maldi-tof質(zhì)譜儀鑒定樣品的純度，目的樣品的凍干粉末置于-20℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

maldi-tof質(zhì)譜分析在美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的voyager-de^tmstr型的maldi-tofmass(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flight)質(zhì)譜儀上進(jìn)行。用0.1℅tfa、50℅乙腈、50℅水混合液制備cca(α-cyano-4-hydroxyc-innamicacid)基質(zhì)（5mg/ml），然后分別取1ul樣品與3ulcca基質(zhì)液混合，再取0.5ul混合液在質(zhì)譜儀的樣品盤上分別點(diǎn)樣,室溫下自然風(fēng)干后測(cè)定各樣品的分子量。采用反射模式，離子源加速電壓為20kv，n2激光波長337nm，脈沖寬度3ns，離子延遲提取150ns，真空度4*10^-7torr。質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加100次，正離子測(cè)定模式，質(zhì)譜使用外標(biāo)（混合標(biāo)準(zhǔn)樣品）校正。

1.3氨基酸序列測(cè)定

氨基酸序列分析是應(yīng)用edman降解原理，在perkinelmerprocise491a型氣相測(cè)序儀（美國appliedbiosystem公司產(chǎn)品）上進(jìn)行的。一般不直接使用天然毒素進(jìn)行測(cè)序，而選用經(jīng)碘乙酰胺烷基化修飾后的毒素肽作為測(cè)序樣品，因?yàn)闆]有經(jīng)碘乙酰胺修飾的半胱氨酸（cysteine）在214nm波長檢測(cè)下沒有吸收值，觀察不到信號(hào)，不便于準(zhǔn)確定位半胱氨酸在多肽中的位置，而經(jīng)修飾的半胱氨酸的pth-cm-cys出峰信號(hào)明顯，在線hplc檢測(cè)能夠確證多肽序列中半胱氨酸的位置。根據(jù)毒素分子量推測(cè)其含有氨基酸殘基的數(shù)目，然后設(shè)定實(shí)際測(cè)序循環(huán)數(shù)，即1個(gè)空白循環(huán)+1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)+氨基酸殘基數(shù)目。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1spgp-v的分離純化及質(zhì)譜鑒定

由于廣西捕鳥蛛成分非常復(fù)雜，通常采用二維色譜的方法分離純化毒素多肽：即首先經(jīng)過陽離子交換分離粗毒后，洗脫成分進(jìn)一步采用反相hplc分離純化。圖1是虎紋捕鳥蛛粗毒的陽離子交換hplc圖譜，在280nm波長下檢測(cè)，可觀察到8個(gè)非常明顯的洗脫峰，其中第1個(gè)峰是目的峰。經(jīng)maldi-tof質(zhì)譜鑒定該峰內(nèi)含有多種組分，分子量為4111.73da的組分所含豐度較低（圖1）。收集此峰后，在waters515pump＆empower高效液相色譜工作站上進(jìn)行脫鹽處理和反相hplc分離純化，所得圖譜見圖2,出現(xiàn)4個(gè)主峰。其中保留時(shí)間為57.2的峰含有目的組分。收集目的峰并冷凍干燥后，在alliance系統(tǒng)上進(jìn)行再次反相hplc（見圖3）。圖中顯示含spgp-v洗脫峰為單一峰，在c18反相制備柱中，保留時(shí)間為15.2min，通過質(zhì)譜鑒定純度達(dá)到98%以上。

2.2質(zhì)譜分析

將圖4所示洗脫峰用maldi-tof質(zhì)譜分析表明所含組分單一。，經(jīng)鑒定spgp-v的分子量分別為4111.7da。從圖上看，樣品很純，說明目的肽的分離純化是很成功的。

2.3氨基酸序列分析

spgp-v的序列測(cè)定在491-a測(cè)序儀上進(jìn)行。測(cè)序之前對(duì)spgp-v進(jìn)行碘乙酰胺烷基化修飾，結(jié)果表明，spgp-v是單鏈多肽分子，由35個(gè)氨基酸殘基組成，其中包括6個(gè)cys。將該多肽經(jīng)碘乙酰胺修飾后測(cè)定分子質(zhì)量，修飾后的分子量比天然肽的分子量都增加了348da。由于每修飾一個(gè)半胱氨酸，則天然毒素的分子量增加58da，由此推斷：spgp-v含有6個(gè)半胱氨酸，形成三對(duì)二硫鍵。

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<110>長沙沁才生物科技有限公司

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