本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及多肽、核酸、構(gòu)建體、改變細(xì)胞命運(yùn)的方法和獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

oct4/3，從1989首次發(fā)現(xiàn)它(scholer,1989)之后，至今已進(jìn)行了27年的研究。它由人類第六號(hào)染色體上pouf51基因編碼，是為維持細(xì)胞全能性中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它的表達(dá)變化調(diào)節(jié)著生命體的發(fā)育(2014)。oct4具有保守的pou結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域由pou-specific(pous)和pou-homeo(pouh)亞結(jié)構(gòu)域，中間由一段linker連接，分別結(jié)合atgc和(a/t)aat，同樣它們能一起結(jié)合在八聚體的保守dna序列(atgcaaat)上。oct4不僅可以和自己相互組合后結(jié)合在poremotif和moremotif上，也能同別的蛋白組成復(fù)合體，如與sox2。在重編程的四個(gè)因子oct4、sox2、klf4、c-myc中oct4不同于其它因子，它不能被同家族的成員完全替換完成同等效率的重編程。

體細(xì)胞重編程是誘導(dǎo)成熟的體細(xì)胞變成多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(ipsc)的過程。首次發(fā)現(xiàn)是體細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)基的環(huán)境下過表達(dá)四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子oct4、sox2、c-myc、klf4能逐漸變成多能誘導(dǎo)干細(xì)胞(ipsc)(kazutoshitakahashi,2006)，成功打破了細(xì)胞不能逆轉(zhuǎn)的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，也開辟了研究再生醫(yī)學(xué)的新途徑。但是這種方法并不能達(dá)到理想的效率，特別是在去掉c-myc之后會(huì)大大降低，為了解決這個(gè)問題有很多新方法誕生。一類是通過在培養(yǎng)基中加入化學(xué)小分子加速和提高重編程的效率，這種培養(yǎng)基非常昂貴比如icd1，有些類是通過融合重編程轉(zhuǎn)錄因子和強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，來實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞重編程的速度和效率的提高。如針對(duì)于將單純皰疹病毒vp16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域以不同的方式結(jié)合在oct4、sox2、nanog、將轉(zhuǎn)錄因子myod的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域部分區(qū)域與oct4的n端連接、將轉(zhuǎn)錄osnk用輔助因子yes相關(guān)蛋白(yap)的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域與重編程因子融合。然而，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)重編程過程機(jī)理的揭示進(jìn)展依舊緩慢。

如何改變細(xì)胞命運(yùn)尤其是促進(jìn)體細(xì)胞的重編程，仍有待進(jìn)一步研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種能夠有效改變細(xì)胞命運(yùn)尤其是促進(jìn)體細(xì)胞的重編程的方法。

需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語“細(xì)胞命運(yùn)”是指從一種細(xì)胞類型向另一種細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)變，包括體細(xì)胞的重編程、轉(zhuǎn)分化以及干細(xì)胞的分化。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽的氨基酸序列具有下列特征的至少之一：與seqidno：1相比，所述多肽的第152位氨基酸由t突變?yōu)閞(在申請(qǐng)中，該突變位點(diǎn)命名為t22r)；(2)與seqidno：1相比，所述多肽的第208位氨基酸由e突變?yōu)閜(在本申請(qǐng)中，該突變位點(diǎn)命名為e78p)；(3)與seqidno：1相比，所述多肽的第230～256位氨基酸被替換為seqidno：14所示的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，體細(xì)胞中過表達(dá)上述多肽，體細(xì)胞發(fā)生去分化、重編程的效率顯著提高。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkritlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnenlqeicksetlvqarkrkrtsienrvrwsletmflkcpkpslqqithianqlglekdvvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno:1)。

ievsvkgaleshflkcpkpsaqeitsl(seqidno:14)。

需要說明的是，本申請(qǐng)所述的多肽的氨基酸的數(shù)目不受特別限制，可以包括至少兩個(gè)由肽鍵連接的氨基酸殘基。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述多肽還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述多肽具有seqidno：2～7所示的氨基酸序列。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkrirlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnpnlqeicksetlvqarkrkrtsievsvkgaleshflkcpkpsaqeitsladslqlekevvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno:2)。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkrirlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnpnlqeicksetlvqarkrkrtsienrvrwsletmflkcpkpslqqithianqlglekdvvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno:3)。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkritlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnenlqeicksetlvqarkrkrtsievsvkgaleshflkcpkpsaqeitsladslqlekevvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno:4)。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkrirlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnenlqeicksetlvqarkrkrtsienrvrwsletmflkcpkpslqqithianqlglekdvvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno:5)。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkritlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnpnlqeicksetlvqarkrkrtsienrvrwsletmflkcpkpslqqithianqlglekdvvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno:6)。

maghlasdfafspppgggdgsaglepgwvdprtwlsfqgppggpgigpgsevlgispcppayefcggmaycgpqvglglvpqvgvetlqpegqagarvesnsegtssepcadrpnavklekveptpeesqdmkalqkeleqfakllkqkrirlgytqadvgltlgvlfgkvfsqtticrfealqlslknmcklrpllekwveeadnnenlqeicksetlvqarkrkrtsievsvkgaleshflkcpkpsaqeitsladslqlekevvrvwfcnrrqkgkrssieysqreeyeatgtpfpggavsfplppgphfgtpgygsphfttlysvpfpegeafpsvpvtalgspmhsn(seqidno：7)。

其中，seqidno：2是epou的氨基酸序列，seqidno：3是oct4_t22r_e78p的氨基酸序列，seqidno：4是oct4hbrn2(100-126)的氨基酸序列，seqidno：5是oct4_t22r的氨基酸序列，seqidno：6是oct4_e78p的氨基酸序列，seqidno：7是pouhbrn2/t22r氨基酸序列(參考圖1d)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，體細(xì)胞中過表達(dá)上述多肽，體細(xì)胞發(fā)生去分化、重編程的效率進(jìn)一步顯著提高。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種獲得前面所述多肽的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：(1)選取oct4的pou結(jié)構(gòu)域的第7、21、18、22、78、151位的氨基酸，通過突變處理構(gòu)建6個(gè)飽和突變文庫多肽；(2)將oct1、oct6、brn2、oct4的pou結(jié)構(gòu)域的pouh、linker、pous進(jìn)行第一排列組合處理，構(gòu)建嵌合體突變文庫多肽；(3)保持c末端和n末端為oct4相應(yīng)序列；(4)將所述突變文庫多肽和所述嵌合體突變文庫多肽分別同sox2、c-myc、klf4一同誘導(dǎo)體細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，其中，所述多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率大于1倍的野生型oct4的誘導(dǎo)效率是待篩選目標(biāo)多肽的指標(biāo)；(5)將所述目標(biāo)多肽進(jìn)行第二排列組合處理，構(gòu)建待篩選文庫多肽；(6)將所述待篩選文庫多肽分別同sox2、c-myc、klf4一同誘導(dǎo)體細(xì)胞，觀察誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率，其中，所述多能干細(xì)胞的誘導(dǎo)效率大于2倍的野生型oct4的誘導(dǎo)效率是目的多肽的指標(biāo)。通過上述方法首次實(shí)現(xiàn)了通過定向進(jìn)化實(shí)現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行改造，所獲得的改造后的oct4(epou)與多能干細(xì)胞誘導(dǎo)因子聯(lián)合使用，加快了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的速率和提高了誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種分離的核酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述核酸具有seqidno：8～13所示的核苷酸序列。

atggctggacacctggcttcagacttcgccttctcacccccaccaggtgggggtgatgggtcagcagggctggagccgggctgggtggatcctcgaacctggctaagcttccaagggcctccaggtgggcctggaatcggaccaggctcagaggtattggggatctccccatgtccgcccgcatacgagttctgcggagggatggcatactgtggacctcaggttggactgggcctagtcccccaagttggcgtggagactttgcagcctgagggccaggcaggagcacgagtggaaagcaactcagagggaacctcctctgagccctgtgccgaccgccccaatgccgtgaagttggagaaggtggaaccaactcccgaggagtcccaggacatgaaagccctgcagaaggagctagaacagttcgctaagctgctgaagcagaagaggatcaggttggggtacacccaggccgacgtggggctcaccctgggcgttctctttggaaaggtgttcagccagaccaccatctgtcgcttcgaggccttgcagctcagccttaagaacatgtgtaagctgcggcccctgctggagaagtgggtggaggaagccgacaacaatccgaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtgcaggcccggaagagaaagcgaacgtccatcgaggtgagcgtcaagggggctctggagagccatttcctcaaatgccctaagccctcggcccaggagatcacctccctcgcggacagcttacagctggagaaggaggtggtgcgagtatggttctgtaacaggcgccagaagggcaaaagatcaagtattgagtattcccaacgagaagagtatgaggctacagggacacctttcccagggggggctgtatcctttcctctgcccccaggtccccactttggcaccccaggctatggaagcccccacttcaccacactctactcagtcccttttcctgagggcgaggcctttccctctgttcccgtcactgctctgggctctcccatgcattcaaactga(seqidno：8)。

atggctggacacctggcttcagacttcgccttctcacccccaccaggtgggggtgatgggtcagcagggctggagccgggctgggtggatcctcgaacctggctaagcttccaagggcctccaggtgggcctggaatcggaccaggctcagaggtattggggatctccccatgtccgcccgcatacgagttctgcggagggatggcatactgtggacctcaggttggactgggcctagtcccccaagttggcgtggagactttgcagcctgagggccaggcaggagcacgagtggaaagcaactcagagggaacctcctctgagccctgtgccgaccgccccaatgccgtgaagttggagaaggtggaaccaactcccgaggagtcccaggacatgaaagccctgcagaaggagctagaacagttcgctaagctgctgaagcagaagaggatcaggttggggtacacccaggccgacgtggggctcaccctgggcgttctctttggaaaggtgttcagccagaccaccatctgtcgcttcgaggccttgcagctcagccttaagaacatgtgtaagctgcggcccctgctggagaagtgggtggaggaagccgacaacaatccgaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtgcaggcccggaagagaaagcgaactagcattgagaaccgtgtgaggtggagtctggagaccatgtttctgaagtgcccgaagccctccctacagcagatcactcacatcgccaatcagcttgggctagagaaggatgtggttcgagtatggttctgtaaccggcgccagaagggcaaaagatcaagtattgagtattcccaacgagaagagtatgaggctacagggacacctttcccagggggggctgtatcctttcctctgcccccaggtccccactttggcaccccaggctatggaagcccccacttcaccacactctactcagtcccttttcctgagggcgaggcctttccctctgttcccgtcactgctctgggctctcccatgcattcaaactga(seqidno：9)。

atggctggacacctggcttcagacttcgccttctcacccccaccaggtgggggtgatgggtcagcagggctggagccgggctgggtggatcctcgaacctggctaagcttccaagggcctccaggtgggcctggaatcggaccaggctcagaggtattggggatctccccatgtccgcccgcatacgagttctgcggagggatggcatactgtggacctcaggttggactgggcctagtcccccaagttggcgtggagactttgcagcctgagggccaggcaggagcacgagtggaaagcaactcagagggaacctcctctgagccctgtgccgaccgccccaatgccgtgaagttggagaaggtggaaccaactcccgaggagtcccaggacatgaaagccctgcagaaggagctagaacagttcgctaagctgctgaagcagaagaggatcaccttggggtacacccaggccgacgtggggctcaccctgggcgttctctttggaaaggtgttcagccagaccaccatctgtcgcttcgaggccttgcagctcagccttaagaacatgtgtaagctgcggcccctgctggagaagtgggtggaggaagccgacaacaatccgaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtgcaggcccggaagagaaagcgaacgtccatcgaggtgagcgtcaagggggctctggagagccatttcctcaaatgccctaagccctcggcccaggagatcacctccctcgcggacagcttacagctggagaaggaggtggtgcgagtatggttctgtaacaggcgccagaagggcaaaagatcaagtattgagtattcccaacgagaagagtatgaggctacagggacacctttcccagggggggctgtatcctttcctctgcccccaggtccccactttggcaccccaggctatggaagcccccacttcaccacactctactcagtcccttttcctgagggcgaggcctttccctctgttcccgtcactgctctgggctctcccatgcattcaaactga(seqidno：10)。

atggctggacacctggcttcagacttcgccttctcacccccaccaggtgggggtgatgggtcagcagggctggagccgggctgggtggatcctcgaacctggctaagcttccaagggcctccaggtgggcctggaatcggaccaggctcagaggtattggggatctccccatgtccgcccgcatacgagttctgcggagggatggcatactgtggacctcaggttggactgggcctagtcccccaagttggcgtggagactttgcagcctgagggccaggcaggagcacgagtggaaagcaactcagagggaacctcctctgagccctgtgccgaccgccccaatgccgtgaagttggagaaggtggaaccaactcccgaggagtcccaggacatgaaagccctgcagaaggagctagaacagttcgctaagctgctgaagcagaagaggatcaggttggggtacacccaggccgacgtggggctcaccctgggcgttctctttggaaaggtgttcagccagaccaccatctgtcgcttcgaggccttgcagctcagccttaagaacatgtgtaagctgcggcccctgctggagaagtgggtggaggaagccgacaacaatgagaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtgcaggcccggaagagaaagcgaactagcattgagaaccgtgtgaggtggagtctggagaccatgtttctgaagtgcccgaagccctccctacagcagatcactcacatcgccaatcagcttgggctagagaaggatgtggttcgagtatggttctgtaaccggcgccagaagggcaaaagatcaagtattgagtattcccaacgagaagagtatgaggctacagggacacctttcccagggggggctgtatcctttcctctgcccccaggtccccactttggcaccccaggctatggaagcccccacttcaccacactctactcagtcccttttcctgagggcgaggcctttccctctgttcccgtcactgctctgggctctcccatgcattcaaactga(seqidno：11)。

atggctggacacctggcttcagacttcgccttctcacccccaccaggtgggggtgatgggtcagcagggctggagccgggctgggtggatcctcgaacctggctaagcttccaagggcctccaggtgggcctggaatcggaccaggctcagaggtattggggatctccccatgtccgcccgcatacgagttctgcggagggatggcatactgtggacctcaggttggactgggcctagtcccccaagttggcgtggagactttgcagcctgagggccaggcaggagcacgagtggaaagcaactcagagggaacctcctctgagccctgtgccgaccgccccaatgccgtgaagttggagaaggtggaaccaactcccgaggagtcccaggacatgaaagccctgcagaaggagctagaacagttcgctaagctgctgaagcagaagaggatcaccttggggtacacccaggccgacgtggggctcaccctgggcgttctctttggaaaggtgttcagccagaccaccatctgtcgcttcgaggccttgcagctcagccttaagaacatgtgtaagctgcggcccctgctggagaagtgggtggaggaagccgacaacaatccgaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtgcaggcccggaagagaaagcgaactagcattgagaaccgtgtgaggtggagtctggagaccatgtttctgaagtgcccgaagccctccctacagcagatcactcacatcgccaatcagcttgggctagagaaggatgtggttcgagtatggttctgtaaccggcgccagaagggcaaaagatcaagtattgagtattcccaacgagaagagtatgaggctacagggacacctttcccagggggggctgtatcctttcctctgcccccaggtccccactttggcaccccaggctatggaagcccccacttcaccacactctactcagtcccttttcctgagggcgaggcctttccctctgttcccgtcactgctctgggctctcccatgcattcaaactga(seqidno：12)。

atggctggacacctggcttcagacttcgccttctcacccccaccaggtgggggtgatgggtcagcagggctggagccgggctgggtggatcctcgaacctggctaagcttccaagggcctccaggtgggcctggaatcggaccaggctcagaggtattggggatctccccatgtccgcccgcatacgagttctgcggagggatggcatactgtggacctcaggttggactgggcctagtcccccaagttggcgtggagactttgcagcctgagggccaggcaggagcacgagtggaaagcaactcagagggaacctcctctgagccctgtgccgaccgccccaatgccgtgaagttggagaaggtggaaccaactcccgaggagtcccaggacatgaaagccctgcagaaggagctagaacagttcgctaagctgctgaagcagaagaggatcaggttggggtacacccaggccgacgtggggctcaccctgggcgttctctttggaaaggtgttcagccagaccaccatctgtcgcttcgaggccttgcagctcagccttaagaacatgtgtaagctgcggcccctgctggagaagtgggtggaggaagccgacaacaatgagaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtgcaggcccggaagagaaagcgaacgtccatcgaggtgagcgtcaagggggctctggagagccatttcctcaaatgccctaagccctcggcccaggagatcacctccctcgcggacagcttacagctggagaaggaggtggtgcgagtatggttctgtaacaggcgccagaagggcaaaagatcaagtattgagtattcccaacgagaagagtatgaggctacagggacacctttcccagggggggctgtatcctttcctctgcccccaggtccccactttggcaccccaggctatggaagcccccacttcaccacactctactcagtcccttttcctgagggcgaggcctttccctctgttcccgtcactgctctgggctctcccatgcattcaaactga(seqidno：13)。

其中，seqidno：8是編碼epou多肽的核酸的核苷酸序列，seqidno：9是編碼oct4_t22r_e78p多肽的核酸的核苷酸序列，seqidno：10是編碼oct4hbrn2(100-126)多肽的核酸的核苷酸序列，seqidno：11是編碼oct4_t22r多肽的核酸的核苷酸序列，seqidno：12是編碼oct4_e78p多肽的核酸的核苷酸序列，seqidno：13是編碼pouhbrn2/t22r多肽的核酸的核苷酸序列(參考圖1d)。上述分離的核酸編碼上述分離的多肽，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述分離的核酸在體細(xì)胞中表達(dá)，體細(xì)胞發(fā)生去分化、重編程的效率顯著提高。

對(duì)于本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中所提及的核酸，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)際包括互補(bǔ)雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權(quán)利要求書中，雖然多數(shù)情況下只給出了一條鏈，但實(shí)際上也公開了與之互補(bǔ)的另一條鏈。例如，提及seqidno：8～13，實(shí)際包括其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。

本申請(qǐng)中的基因序列包括dna形式或rna形式，公開其中一種，意味著另一種也被公開。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述構(gòu)建體攜帶前面所述的核酸。將本發(fā)明實(shí)施例的構(gòu)建體通過合適的方式導(dǎo)入受體細(xì)胞如體細(xì)胞中，進(jìn)而上述多肽在受體細(xì)胞中表達(dá)，則細(xì)胞發(fā)生去分化的效率和速率相比于現(xiàn)有技術(shù)顯著提高。

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“構(gòu)建體”是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序列，并且能夠?qū)⒛康暮怂嵝蛄修D(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，以獲得重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建體的形式不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其可以為質(zhì)粒、噬菌體、人工染色體、粘粒(cosmid)、病毒的至少一種，優(yōu)選質(zhì)粒。質(zhì)粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片段的性質(zhì)，便于操作和處理。質(zhì)粒的形式也不受特別限制，既可以是環(huán)形質(zhì)粒，也可以是線性質(zhì)粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要進(jìn)行選擇。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的dna、rna，其長度不受任何特別限制。對(duì)于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的構(gòu)建體，優(yōu)選所述核酸為dna，因?yàn)閐na相對(duì)于rna而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種改變細(xì)胞命運(yùn)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，包括：所述細(xì)胞過表達(dá)前面所述的多肽。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，細(xì)胞命運(yùn)發(fā)生改變的效率和速率相比于現(xiàn)有技術(shù)顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞是體細(xì)胞。體細(xì)胞中過表達(dá)上述多肽，其發(fā)生去分化的效率和速率進(jìn)一步提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括將所述體細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或添加有vitaminc的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的再一具體實(shí)施例，所述培養(yǎng)的時(shí)間為至少3天。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，至少培養(yǎng)3天，上述多肽在體細(xì)胞的過表達(dá)效率高，體細(xì)胞重編程和去分化的效率顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox、klf4和c-myc。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)sox、klf4、c-myc以及上述多肽，其誘導(dǎo)ipsc效率是現(xiàn)有未突變的oct4與轉(zhuǎn)錄因子sox、klf4、c-myc共同誘導(dǎo)ipsc效率的15倍。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox、klf4，發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)sox、klf4以及上述多肽，其誘導(dǎo)ipsc效率是現(xiàn)有未突變的oct4與轉(zhuǎn)錄因子sox、klf4共同誘導(dǎo)ipsc效率的15倍。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox17ek、klf4和c-myc。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)epou于sox17ek相結(jié)合后，其誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的速度和誘導(dǎo)效率得到進(jìn)一步提升，epou、sox17ek、klf4和c-myc誘導(dǎo)效率能達(dá)到7％，ipsc在總細(xì)胞中大約占48％。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox11、klf4和c-myc。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽聯(lián)合sox11、klf4和c-myc，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4聯(lián)合sox11、klf4和c-myc不能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox2ke、klf4和c-myc。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽聯(lián)合sox2ke、klf4和c-myc，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4聯(lián)合sox2ke、klf4和c-myc不能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)klf4、c-myc。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽聯(lián)合klf4、c-myc，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4聯(lián)合klf4、c-myc不能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox2。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽單獨(dú)聯(lián)合sox2，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4單獨(dú)聯(lián)sox2不能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox17ek。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽單獨(dú)聯(lián)合sox17ek，可實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4單獨(dú)聯(lián)sox17ek不能實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞的重編程。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：所述細(xì)胞過表達(dá)前面所述的多肽。利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，多能干細(xì)胞的獲得效率相比于現(xiàn)有技術(shù)顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法還可以進(jìn)一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞是體細(xì)胞，體細(xì)胞中過表達(dá)上述多肽，其發(fā)生去分化進(jìn)而獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率進(jìn)一步提高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)一步包括將所述體細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基或添加有vitaminc的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

根據(jù)本發(fā)明的再一具體實(shí)施例，所述培養(yǎng)的時(shí)間為至少3天。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，至少培養(yǎng)3天，上述多肽在體細(xì)胞的過表達(dá)效率高，體細(xì)胞重編程和去分化的效率顯著提高，進(jìn)而可進(jìn)一步有效獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox、klf4和c-myc。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)sox、klf4、c-myc以及上述多肽，其誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)的獲得效率是現(xiàn)有未突變的oct4與轉(zhuǎn)錄因子sox、klf4、c-myc共同誘導(dǎo)獲得ipsc效率的15倍。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox、klf4，發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞中同時(shí)過表達(dá)sox、klf4以及上述多肽，其獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的效率是現(xiàn)有未突變的oct4與轉(zhuǎn)錄因子sox、klf4共同誘導(dǎo)獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞效率的15倍。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox17ek、klf4和c-myc。發(fā)明人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)epou于sox17ek相結(jié)合后，其誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的速度和誘導(dǎo)效率得到進(jìn)一步提升，epou、sox17ek、klf4和c-myc誘導(dǎo)效率能達(dá)到7％，ipsc在總細(xì)胞中大約占48％。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox11、klf4和c-myc。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽聯(lián)合sox11、klf4和c-myc，可獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4聯(lián)合sox11、klf4和c-myc不能獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox2ke、klf4和c-myc。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽聯(lián)合sox2ke、klf4和c-myc，可獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4聯(lián)合sox2ke、klf4和c-myc不能獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)klf4、c-myc。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽聯(lián)合klf4、c-myc，可獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4聯(lián)合klf4、c-myc不能獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox2。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽單獨(dú)聯(lián)合sox2，可獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4單獨(dú)聯(lián)合sox2不能獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述細(xì)胞同時(shí)過表達(dá)sox17ek。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，上述多肽單獨(dú)聯(lián)合sox17ek，可獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)中，野生型oct4單獨(dú)聯(lián)sox17ek不能獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的得到epou的過程和驗(yàn)證結(jié)果，

其中，a是篩選和驗(yàn)證結(jié)果圖；

b是將多個(gè)最有潛力的突變點(diǎn)組合和驗(yàn)證圖；

c是突變點(diǎn)與pouhbrn2組合并驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的氨基酸序列圖，

其中，a是epou的氨基酸序列和dna序列；

b是epou與oct4的pou結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)；

圖3a.是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的epou/s/k/m、o/s/k/m、epou/sox17ek/k/m在培養(yǎng)13天中的ipsc陽性克隆數(shù)的增長圖，b.是13天后epou/s/k/m和o/s/k/m的效率在12孔板整孔掃描gfp的結(jié)果圖；其中，k表示klf4；s表示sox2；

圖4是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的在有無維生素c的mes培養(yǎng)基中，epou/s/k/m組合，epou/s/k組合誘導(dǎo)ipsc，與o/s/k/m和o/s/k相比的結(jié)果圖，

其中，k表示klf4；s表示sox2，m表示c-myc，o表示oct4；

圖5是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的epou與sox17/k/m，sox11/k/m，k/m分別組合誘導(dǎo)ipsc的情況的結(jié)果圖；

圖6是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的在熒光顯微鏡下檢測epou與sox17/k/m，sox11/k/m，k/m產(chǎn)生的克隆的情況結(jié)果圖；

圖7是epou/sox17ek、epou/sox2、epou/soxek/k/m、epou/sox17ek/k、epou/sox2/k、epou/sox2/k/m、oct4/sox2/k/m、oct4/sox2/k的誘導(dǎo)組合在誘導(dǎo)13天后，通過流式細(xì)胞分析得到gfp陽性細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)中的百分比；

圖8是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的epou/sox17ek,epou/sox17ek/k,epou/sox17ek/k/m,o/s/k/m,o/s/k,o/s，從誘導(dǎo)第1天到13天產(chǎn)生gfp陽性克隆數(shù)的變化圖；以及

圖9是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的epou/sox17ek,epou/sox17ek/k,epou/sox17ek/k/m,o/s/k/m,o/s/k,o/s在培養(yǎng)的不同天數(shù)中在熒光顯微鏡下光測的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自illumina公司。

本文中所述的“細(xì)胞”為任何可以獲得的細(xì)胞，在以下的實(shí)施例中，選擇小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryofibroblastcell，mef細(xì)胞)。

可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段轉(zhuǎn)染或感染細(xì)胞。

一、實(shí)驗(yàn)方法：

細(xì)胞培養(yǎng)

plat-e細(xì)胞培養(yǎng)基：10％fbs，1xdmem；

mef培養(yǎng)基：10％fbs，1xdmem，1xglutamax，1xneaa；

mes誘導(dǎo)培養(yǎng)基：15％fbs，1xdmem，1xglutamax，1xneaa，1mmsodiumpyruvate，0.055mmβ-mercaptoethanol，0.5xpenicillin/streptomycin，1,000u/mlleukemiainhibitoryfactor；

點(diǎn)突變文庫構(gòu)建

因?yàn)槊艽a子具有簡并性，通常的飽和突變文庫構(gòu)建會(huì)使用nnn或者nnk，它們不僅包含了終止密碼子，不同的氨基酸所占的比例也有所不同，這樣對(duì)文庫的篩選帶來了嚴(yán)重的困難，特別是將文庫導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過高通量測序得到所有篩選細(xì)胞中文庫基因的整合情況。所以采用正向ndc/vmg/atg/tgg，反向hnc/kbc/cat/cca來包含20個(gè)氨基酸，并且每個(gè)氨基酸突變出現(xiàn)的概率相等，分別對(duì)k7、q18、i21、t22、e78、s151分別設(shè)計(jì)了不同的四對(duì)引物。

分別將帶有突變基因的引物正向引物f1到f4，反向引物r1到r4以12:6:1:1混合，以pmx-moct4為模板，配置pcr反應(yīng)體系，所用高保真酶，在20μl反應(yīng)體系中，使用提供的hfbuffer，0.2mmdntp，0.5μl引物，5ng模板，0.02u/μl的dna聚合酶。98℃1分鐘，之后進(jìn)行18次循環(huán)，98℃30秒，58℃30秒，72℃大約3.5分鐘(2kb/min)退出循環(huán)，72℃持續(xù)延伸5分鐘，保溫16℃。取10μl的pcr產(chǎn)物，加入0.5μl的dpni酶，37℃孵育3-5小時(shí)，4℃保存，用于轉(zhuǎn)化，保存時(shí)間不宜太長最好孵育之后直接轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化使用所購買的top10感受態(tài)細(xì)胞，在30μl感受態(tài)細(xì)胞中加入3μldpni消化后的產(chǎn)物，在冰上放置半小時(shí)，42℃熱擊1分鐘，迅速放入冰上2分鐘，加入1ml新鮮lb培養(yǎng)基在搖床中37℃培養(yǎng)45分鐘，離心去掉800μl上清液，將菌全部涂在具有氨芐抗性的lb固體培養(yǎng)基上，在細(xì)菌培養(yǎng)箱中倒置37℃培養(yǎng)8-12個(gè)小時(shí)，挑取單克隆，送sanger測序(bgi)，所用測序引物是pmx載體的通用引物由公司提供。

嵌合突變文庫構(gòu)建

利用userec的方法構(gòu)建嵌合體突變文庫，是通過找到蛋白之間的同源區(qū)域中的a(n)4-8t設(shè)計(jì)特殊引物擴(kuò)增出含有脫氧尿嘧啶的片段，因?yàn)槊艽a子具有簡并性，相同的氨基酸對(duì)應(yīng)著不同的密碼子，所以先用pcr擴(kuò)增方法改變目的片段的末端序列，使相同的結(jié)構(gòu)域的末端同源序列的核酸序列相同。pcr反應(yīng)使用taqmastermix(thermo)，20μl的反應(yīng)體系中，1xmastermix，0.3μm的引物，模板5ng分別為pmx-moct4、pmx-moct6、pentr-mbrn2、pentr-moct1,反應(yīng)25個(gè)循環(huán)。含有脫氧尿嘧啶引物片段再擴(kuò)增為了下一步利用user酶進(jìn)行酶切，需要對(duì)獲取的不同結(jié)構(gòu)域的片段的兩段引入a(n)4-8u，在上一步的pcr反應(yīng)后已得到a(n)4-8t并且，在上一步后同種結(jié)構(gòu)域末端大約14bp的片段已相同，所以對(duì)不同蛋白的pous、linker、pouh可用相同的一段含有u的短引物做進(jìn)一步擴(kuò)增，引物如表2.5。這一步使用一種特殊的dna聚合酶phusionuhotstardnapolymerase(thermofisher)進(jìn)行擴(kuò)增，20μi的反應(yīng)體系中，1xhfbuffer(酶自帶)，0.3μm的引物，模板500pg。反應(yīng)程序是，98℃3分鐘，進(jìn)入25次循環(huán)，95℃30秒，40℃30秒，72℃30秒，退出循環(huán)，72℃5分鐘，最終穩(wěn)定在16℃直到取走產(chǎn)物。moct4的pou結(jié)構(gòu)域外n端和c端的序列用帶有bglii限制性酶切位點(diǎn)的正向引物和帶有noti限制性酶切位點(diǎn)的反向引物，和帶有脫氧尿嘧啶的引物擴(kuò)增。在50μluser酶反應(yīng)體系，1xt4dnaligasebuffer(neb)，5μluserenzyme，100μg混合的dna片段。在37℃20分鐘，25℃10分鐘，加入5μlt4連接酶(neb2000u)，25℃15分鐘。取1μl的反應(yīng)產(chǎn)物作為pcr模板，用p1bglii和p2noti進(jìn)行擴(kuò)增，利用瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測是否成功并切膠回收純化。對(duì)空載體pmx-flag各使用5μl限制性內(nèi)切酶bamhi和noti消化質(zhì)粒100ug，37℃1小時(shí)，凝膠純化并濃度測定后保存。對(duì)目的片段使用限制性內(nèi)切酶bglii和noti進(jìn)行消化，同樣的方法純化和回收。

在20μlsolutioni反應(yīng)體系中，10μlmix反應(yīng)液，酶切并純化后的載體骨架和插入片段按比例1:5加入，16℃連接過夜。取5μl加入50μltop10感受態(tài)細(xì)胞中，用熱激法轉(zhuǎn)化，具體方法可參考上一節(jié)內(nèi)容，在有amp固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，挑取部分克隆送到測序公司進(jìn)行sanger測序，檢測文庫質(zhì)量。

逆轉(zhuǎn)錄病毒的制備

胰酶消化培養(yǎng)中的plat-e細(xì)胞，計(jì)數(shù)之后按培養(yǎng)8x10^8個(gè)細(xì)胞plat-e于10cm皿中，培養(yǎng)大約24hr之后，細(xì)胞密度大約在70～90％時(shí)，在轉(zhuǎn)染前前1小時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為opti-mem或者更新為新鮮plat-e細(xì)胞培養(yǎng)基；加入1ml的opti-mem于1.5mlep管中，加入10μg的質(zhì)粒，再加入40μl的pei，震蕩10s后室溫放置15分鐘；將dna與pei的混合液緩慢加入到plat-e細(xì)胞培養(yǎng)皿中；過了12hr更換新鮮plat-e培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染48hr時(shí)觀測，轉(zhuǎn)入gfp的plat-e細(xì)胞的狀態(tài)并拍照，用0.4μm的濾器過濾并收集病毒液，過24hr之后再次收集病毒液，用做第二次感染；1)將og2mef復(fù)蘇并按5:3:1培養(yǎng)在6cm皿中，這代mef記為p0；

ipsc的誘導(dǎo)

og2mef復(fù)蘇后12hr換液，之后24hr換一次液；將mef用0.5％的胰酶消化之后，接種1.5x10^4個(gè)細(xì)胞到12孔板中培養(yǎng)5-12hr，吸掉培養(yǎng)基，向已收集好的病毒液中加入polybrene，終濃度為8μg/ml，混勻之后加入到細(xì)胞中，不同培養(yǎng)皿中病毒液不同，24孔板中加入0.25ml，12孔板中加入0.5ml，6孔板中加入1ml，10cm皿中加入3ml，本實(shí)驗(yàn)均用12孔板，所以sox2、klf4、c-myc、oct4(或者突變文庫或者epou)均加入0.5ml到mef細(xì)胞中；加入病毒液之后，培養(yǎng)24hr，在加入已混有polybrene的第二次收集的病毒液做第二次感染；24hr之后將培養(yǎng)基換做ips誘導(dǎo)培養(yǎng)基，記為第0天，之后每24hr換一次液，進(jìn)行觀察，在24hr后觀測其gfp的表達(dá)情況可以判斷這次的感染狀況；之后每天的觀察中會(huì)看到mef變圓成met細(xì)胞，之后長出克隆，最后出現(xiàn)有g(shù)fp的克隆，其為ipsc，選擇所需的實(shí)驗(yàn)天數(shù)對(duì)產(chǎn)生的gfp陽性克隆基數(shù)；

ips細(xì)胞的培養(yǎng)

ips細(xì)胞克隆挑取后用胰酶消化，在0.1％gelatin的2i培養(yǎng)基中培養(yǎng)

2i培養(yǎng)基：neurobasal：dmem-f12＝1：1，1xglutamax，1xneaa，1mmsodiumpyruvate，0.055mmβ-mercaptoethanol，0.5xpenicillin/streptomycin，1,000u/mlleukemiainhibitoryfactor，1xn-2,，1xb-27，3umchir99021，1umpd0325901；

核型分析

在6cm皿中ips細(xì)胞培養(yǎng)到長滿整個(gè)皿后，加入秋水仙素0.2％到中，37℃孵育1小時(shí)，使用胰酶消化后懸浮在0.075m的kcl中20分鐘，對(duì)在低滲緩沖液中的細(xì)胞浸入甲醇：甲酸＝3:1的環(huán)境中放置于室溫30分鐘，把細(xì)胞放在干凈的載破片上然后用giemsa染色，在顯微鏡下觀察處于細(xì)胞中期的。

小鼠嵌合體和種系實(shí)驗(yàn)

從icr雌鼠中獲取胚胎細(xì)胞，早ksom培養(yǎng)基中培養(yǎng)到囊胚期，將ips細(xì)胞注射到囊胚細(xì)胞中繼續(xù)在ksom培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到移植，將15到20個(gè)注射之后的囊胚細(xì)胞注射到假孕的雌鼠子宮內(nèi)，在移植后的11天，在第13.5天取出胚胎的性腺觀察oct4-gfp的情況，其他13個(gè)在19.5天觀察毛色，在他們發(fā)育成熟進(jìn)行種系實(shí)驗(yàn)。

四倍體補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)

將從icr雌鼠中獲取胚胎兩個(gè)胚胎細(xì)胞通過電擊融合得到四倍體胚胎細(xì)胞在ksom培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4到10個(gè)ips細(xì)胞注射到四倍體胚囊腔中，繼續(xù)在ksom培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到移植，15到20個(gè)注射后的四配體囊胚移植到假孕雌鼠子宮中，在第13.5天切開檢查四配體胚胎的狀態(tài)。

人多能誘導(dǎo)干細(xì)胞的誘導(dǎo)

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體同pax2、vsv-g通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法一同轉(zhuǎn)入293t細(xì)胞中，12小時(shí)候換入新鮮培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染第48小時(shí)后通過0.45um的濾膜過濾并收集病毒液。病毒液中加入4μg/mlpolybrene(sigma)感染人包皮纖維細(xì)胞(hff)，向感染后的hff加入doxycycline(sigma)到1μg/μl，在meffeeder細(xì)胞上培養(yǎng)誘導(dǎo)hes樣細(xì)胞的產(chǎn)生。

免疫熒光分析

細(xì)胞通過4％的甲醛處理30分鐘，然后使用h0.2％tritonx-100處理45分鐘隨后加入2％bsa，細(xì)胞在一抗中4℃處理過夜，二抗中室溫處理1小時(shí)，針對(duì)不同的蛋白使用不同的熒光ssea1(santacruz),ssea4(r&d),nanog(chemicon),oct4(santacruz),sox2(r&d),tra-1-60(chemicon),tra-1-81(chemicon),foxa2(abcam),sox17(santacruz),sma(abbomax),brachyury(abcam),gfap(dako),β-tubulin(covance).

二、結(jié)果：

1、在篩選和嚴(yán)重中得到了大量誘導(dǎo)ipsc效率提高的突變體

6定點(diǎn)突變文庫分別同s/k/m一同誘導(dǎo)ipsc，通過二代測序的方法在誘導(dǎo)產(chǎn)生的ipsc中得到了大量的具有潛力的突變體，通過鑒定在每個(gè)位點(diǎn)得到了其最強(qiáng)的突變體k7a,q18a,i21v,t22r,e78a,e78p和s151n(結(jié)果參見圖1)。在嵌合體突變文庫中，通過篩選和鑒定得到了最高效的突變體pouhbrn2。將得到的突變位點(diǎn)組合起來，得到了三突變體t22r/e78p/s151n，在只有點(diǎn)突變引入中誘導(dǎo)效率最高。將它們同pouhbrn2組合得到了誘導(dǎo)效率最高的突變體epou。k：klf4；s：sox2，m：c-myc2、epou相比于oct4具有非常強(qiáng)的誘導(dǎo)效率。

根據(jù)序列比對(duì)，epou與oct4相比有16個(gè)突變點(diǎn)，結(jié)果參見圖2，其中有14個(gè)突變的引入是由一部分brn2的linker區(qū)和一部分的pouh替換，其他兩個(gè)突變點(diǎn)為t22r和e78p。同s/k/m、s/k，并且在有無維生素c加入的情況下，誘導(dǎo)效率是oct4的15倍，結(jié)果參見圖3和圖4。k：klf4；s：sox2，m：c-myc。

2、epou具有特別的重編程功能

重編程因子組合o/s/k/m中，sox2可以被sox1替換，但是如果sox17、sox11、sox2ke替換后這些因子的組合能誘導(dǎo)重編程的進(jìn)行，o/k/m也不具有重編程能力。但是epou替代oct4后能與sox17/k/m、sox11/k/m、k/m組合成功誘導(dǎo)細(xì)胞重編程，結(jié)果參見圖5和圖6。正常情況下，o/s組合并不能誘導(dǎo)重編程過程除非在昂貴的icd1培養(yǎng)基中，但是epou和sox2能在正常的mes培養(yǎng)基中完成重編程，如果sox2被sox17ek替換，誘導(dǎo)效率能得到非常理想的提升，結(jié)果參見圖8。k：klf4；s：sox2，m：c-myc，o：oct4

3、新的誘導(dǎo)因子的組合能加快重編程速度和提升重編程效率

epou/sox17ek/k/m能實(shí)驗(yàn)7％的重編程效率，并且在誘導(dǎo)得到的細(xì)胞中有48％是gfp陽性細(xì)胞，結(jié)果參見圖7和圖9，首個(gè)gfp陽性細(xì)胞產(chǎn)生在第三天(感染時(shí)為第0天)，epou/sox17ek也能得到gfp細(xì)胞，使用這個(gè)方法可以實(shí)現(xiàn)無致癌基因的引入，產(chǎn)生理想的再生醫(yī)學(xué)藥物。k：klf4；m：c-myc

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。

sequencelisting

<110>中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院

<120>pou結(jié)構(gòu)域改造蛋白對(duì)多能干細(xì)胞的高效誘導(dǎo)

<130>pidc3170387

<160>14

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>352

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>野生型oct4的序列

<400>1

metalaglyhisleualaseraspphealapheserproproprogly

151015

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202530

thrtrpleuserpheglnglyproproglyglyproglyileglypro

354045

glysergluvalleuglyileserprocysproproalatyrgluphe

505560

cysglyglymetalatyrcysglyproglnvalglyleuglyleuval

65707580

proglnvalglyvalgluthrleuglnprogluglyglnalaglyala

859095

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100105110

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leuleulysglnlysargilethrleuglytyrthrglnalaaspval

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glyleuthrleuglyvalleupheglylysvalpheserglnthrthr

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ilecysargpheglualaleuglnleuserleulysasnmetcyslys

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leuargproleuleuglulystrpvalgluglualaaspasnasnglu

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210215220

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metpheleulyscysprolysproserleuglnglnilethrhisile

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260265270

asnargargglnlysglylysargserserileglutyrserglnarg

275280285

gluglutyrglualathrglythrpropheproglyglyalavalser

290295300

pheproleuproproglyprohispheglythrproglytyrglyser

305310315320

prohisphethrthrleutyrservalpropheprogluglygluala

325330335

pheproservalprovalthralaleuglyserpromethisserasn

340345350

<210>2

<211>352

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>epou的氨基酸序列

<400>2

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glysergluvalleuglyileserprocysproproalatyrgluphe

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100105110

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130135140

leuleulysglnlysargileargleuglytyrthrglnalaaspval

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glyleuthrleuglyvalleupheglylysvalpheserglnthrthr

165170175

ilecysargpheglualaleuglnleuserleulysasnmetcyslys

180185190

leuargproleuleuglulystrpvalgluglualaaspasnasnpro

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asnleuglngluilecyslyssergluthrleuvalglnalaarglys

210215220

arglysargthrserilegluvalservallysglyalaleugluser

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hispheleulyscysprolysproseralaglngluilethrserleu

245250255

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275280285

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290295300

pheproleuproproglyprohispheglythrproglytyrglyser

305310315320

prohisphethrthrleutyrservalpropheprogluglygluala

325330335

pheproservalprovalthralaleuglyserpromethisserasn

340345350

<210>3

<211>352

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>oct4_t22r_e78p的氨基酸序列

<400>3

metalaglyhisleualaseraspphealapheserproproprogly

151015

glyglyaspglyseralaglyleugluproglytrpvalaspproarg

202530

thrtrpleuserpheglnglyproproglyglyproglyileglypro

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glysergluvalleuglyileserprocysproproalatyrgluphe

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cysglyglymetalatyrcysglyproglnvalglyleuglyleuval

65707580

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859095

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ilecysargpheglualaleuglnleuserleulysasnmetcyslys

180185190

leuargproleuleuglulystrpvalgluglualaaspasnasnpro

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asnleuglngluilecyslyssergluthrleuvalglnalaarglys

210215220

arglysargthrserilegluasnargvalargtrpserleugluthr

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gluglutyrglualathrglythrpropheproglyglyalavalser

290295300

pheproleuproproglyprohispheglythrproglytyrglyser

305310315320

prohisphethrthrleutyrservalpropheprogluglygluala

325330335

pheproservalprovalthralaleuglyserpromethisserasn

340345350

<210>4

<211>352

<212>prt

<213>artificial

<220>

<223>oct4hbrn2(100-126)的氨基酸序列

<400>4

metalaglyhisleualaseraspphealapheserproproprogly

151015

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proglnvalglyvalgluthrleuglnprogluglyglnalaglyala

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<223>oct4_e78p的氨基酸序列

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<213>artificial

<220>

<223>pouhbrn2/t22r氨基酸序列

<400>7

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210215220

arglysargthrserilegluvalservallysglyalaleugluser

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hispheleulyscysprolysproseralaglngluilethrserleu

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alaaspserleuglnleuglulysgluvalvalargvaltrpphecys

260265270

asnargargglnlysglylysargserserileglutyrserglnarg

275280285

gluglutyrglualathrglythrpropheproglyglyalavalser

290295300

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<213>artificial

<220>

<223>編碼epou多肽的核酸的核苷酸序列

<400>8

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<223>編碼oct4_t22r多肽的核酸的核苷酸序列

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<223>編碼oct4_e78p多肽的核酸的核苷酸序列

<400>12

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<210>13

<211>1059

<212>dna

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<220>

<223>編碼pouhbrn2/t22r多肽的核酸的核苷酸序列

<400>13

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gtggaggaagccgacaacaatgagaaccttcaggagatatgcaaatcggagaccctggtg660

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<210>14

<211>27

<212>prt

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<220>

<223>brn2(100-126)的氨基酸序列

<400>14

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151015

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2025