本發(fā)明屬于生物醫(yī)學工程領域，具體涉及一種誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法。

背景技術：

骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymalstemcells，bmscs)是一種成體干細胞，能夠自我更新，具有多向分化潛能，在適當?shù)恼T導條件下可以定向分化成為軟骨、成骨、肌肉、脂肪、神經(jīng)等多種組織細胞。mscs成為基礎醫(yī)學和臨床學組織器官損傷修復以及再生領域研究的熱點，但是目前還存在一些技術問題，如分化效率低或非定向分化形成異質(zhì)細胞甚至異常分化成腫瘤細胞。在骨組織工程應用中，定向誘導mscs分化為成骨細胞是利用其構(gòu)建骨組織工程的一個關鍵步驟。

目前常用的誘導方法主要有：一、引入外源性誘導因子誘導干細胞分化。這種方法的問題為操作繁復，誘導效率低，價格昂貴，釋放難控，不利于大規(guī)模臨床推廣應用。二、將某些蛋白或生長因子的重組dna通過轉(zhuǎn)基因技術導入干細胞，誘導其定向分化。應用轉(zhuǎn)基因技術雖然提高了分化效率，降低了成本，但由于存在安全性、倫理性等問題，距臨床應用還有很大的距離。因此，建立一種簡便、經(jīng)濟、安全而又有效的誘導方法，是誘導干細胞向成骨方向分化及組織工程化骨構(gòu)建的關鍵所在。

mscs的微環(huán)境為啟動或維持干細胞分化提供了關鍵的生化和物理信號。研究表明：激素、生長因子、細胞因子等組成的化學信號轉(zhuǎn)導通路形成的復雜化學微環(huán)境能夠調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞的分化命運；同樣，適宜的物理微環(huán)境，如基體材料的力學性質(zhì)、表面形貌等在干細胞分化過程中也發(fā)揮著不可忽視的調(diào)控作用。

培養(yǎng)介質(zhì)作為細胞外化學微環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子已被公認為是目前體外誘導干細胞定向分化簡單、有效的方法之一，常見誘導介質(zhì)包括成骨、成軟骨、成脂和成神經(jīng)誘導介質(zhì)等等。目前利用誘導介質(zhì)調(diào)控干細胞定向分化已在各種組織修復中有大量研究報道。ponticiello等將人骨髓間充質(zhì)干細胞接種于明膠海綿中，在軟骨誘導介質(zhì)中培養(yǎng)3周，生成了軟骨組織[ponticielloms,schinaqlrm,kadiyalas,barryfp.gelatin-basedresorbablespongeasacarriermatrixforhumanmesenchymalstemcellsincartilageregenerationtherapy.jbiomedmaterres2000；52:246～255.]。在成心肌誘導介質(zhì)的作用下，間充質(zhì)干細胞可向心肌細胞分化，這對于臨床替代壞死或凋亡的心肌細胞，促進心功能恢復具有十分誘人的臨床應用前景。但由于誘導介質(zhì)主要用于體外培養(yǎng)，有較大的局限性，故而限制了誘導介質(zhì)在組織工程中的廣泛應用。另外，誘導介質(zhì)對干細胞分化進程的調(diào)控機制與人體自然過程相比，有著較大的差異。

除了誘導介質(zhì)中的外源性化學信號外，組織工程中必不可少的基質(zhì)材料作為干細胞微環(huán)境的重要組成部分，對干細胞的分化命運同時起著重要的調(diào)控作用。當干細胞與基質(zhì)材料相互作用時，基質(zhì)材料直接影響干細胞的黏附和凝集，而凝集的干細胞之間通過交互應答的協(xié)同作用刺激周圍細胞分泌特定細胞因子或分子信號，導致信號級聯(lián)放大，從而影響干細胞的分化途徑及命運。材料的生物活性基團同樣可以影響干細胞的分化，尤其當采用細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ecm)作為基質(zhì)材料時，對干細胞的基本行為更是起著決定性的影響。麻省理工的richardo.hynes教授在science的一篇綜述文章詳述了細胞外基質(zhì)通過生物化學信號影響干細胞行為及分化進程的潛在機制：細胞外基質(zhì)通過錨定整合蛋白，介導由內(nèi)向外生化信號傳遞(inside-outsignaling)和由外向內(nèi)生化信號傳遞(outside-insignaling)，從而影響相關基因的表達，調(diào)控細胞分化[hynesro.theextracellularmatrix:notjustprettyfibrils.science2009；326:1216～1219]。除了生物化學信號外，細胞內(nèi)外的力學微環(huán)境以及細胞機械力產(chǎn)生的機械信號也可直接影響干細胞的自我更新和分化。力學刺激可以激活干細胞表面受體和黏著斑，進而觸發(fā)細胞內(nèi)信號級聯(lián)放大轉(zhuǎn)化為生物學信號，引起一系列的生物學反應，最終影響干細胞的分化命運，msc對材料表面的彈性尤為敏感。2006年cell的一篇經(jīng)典文章就曾報道基底彈性模量對干細胞分化命運起決定性作用：engler等人研究發(fā)現(xiàn)在不存在化學誘導因子的條件下，將干細胞培養(yǎng)在25～40kpa(模擬類骨質(zhì)硬度)的基質(zhì)上，干細胞呈現(xiàn)與成骨細胞相似的多角形，并且成骨細胞標志分子runx2表達水平上調(diào)[engleraj,sens,sweeneyhl,discherde.matrixelasticitydirectsstemcelllineagespecification.cell2006；126:677～689.]。

mscs的分化與其生長的微環(huán)境密切相關，但目前還沒有一種簡便、經(jīng)濟、安全而又精準有效的誘導方法能將其定向誘導為成骨細胞。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題為：現(xiàn)有技術中缺乏一種簡便、經(jīng)濟、安全、有效的誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的方法。

本發(fā)明提供一種誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法，包括以下步驟：

a、構(gòu)建多孔磷酸鈣支架；

b、在步驟a的支架上復合膠原，形成磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡；

c、將骨髓間充質(zhì)干細胞接種于步驟b中所述的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡中預培養(yǎng)4～48小時后，加入成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到成骨細胞。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟a中所述磷酸鈣為磷酸二氫鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、磷酸四鈣或雙相磷酸鈣中的至少一種。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟a中所述的磷酸鈣支架為磷酸鈣陶瓷支架或磷酸鈣涂層支架中的一種。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟a中所述磷酸鈣支架的力學強度要求≥50kpa；孔隙率10～90％，優(yōu)選30～60％；孔徑10～500μm，優(yōu)選50～200μm。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的膠原為i型膠原，膠原濃度為1～15mg/ml，膠原的ph值為4～6.5。

優(yōu)選的，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的膠原濃度為7～9mg/ml，ph值為5～6.5。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的復合膠原的操作為：采用物理吸附的方法將膠原直接復合在磷酸鈣支架表面，在室溫下風干12～36小時。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡中纖維直徑為50～600nm，優(yōu)選為100～300nm。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟c中所述的預培養(yǎng)時間優(yōu)選為4～24小時。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟c中所述的成骨誘導培養(yǎng)基組成主要為：地塞米松10^-5～10^-2mmol/l，β-甘油磷酸鈉5～20mmol/l，抗壞血酸0.02～0.05mmol/l；優(yōu)選為地塞米松10^-4mmol/l，β-甘油磷酸鈉10mmol/l，抗壞血酸0.05mmol/l。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供了一種誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法，通過構(gòu)建磷酸鈣-膠原支架，為干細胞成骨分化提供了一個適宜的微環(huán)境。采用具有特定力學強度、孔隙率和孔徑的磷酸鈣支架作為基體，為干細胞成骨分化提供適宜的力學微環(huán)境，引發(fā)細胞骨架重排，驅(qū)動細胞運動，觸發(fā)分化信號的激活。再采用膠原復合在磷酸鈣支架上，自組裝形成特定直徑大小的纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，促使間充質(zhì)干細胞在材料表面有效的錨定，加速了細胞與細胞及細胞與基體之間的交互作用，介導細胞間信號的級聯(lián)放大。將骨髓間充質(zhì)干細胞接種后，置于成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成骨誘導培養(yǎng)基作為外源性誘導因子，強化成骨相關轉(zhuǎn)錄因子的表達，與磷酸鈣-膠原協(xié)同作用，二者有效的啟動并維持骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。本發(fā)明方法操作簡單、經(jīng)濟、安全，精準有效的調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化，在骨疾病治療、骨移植技術中有重要的臨床應用價值。

附圖說明

圖1多孔羥基磷灰石涂層掃描電鏡照片；

圖2a、b分別為不同視野下膠原自組裝的纖維結(jié)構(gòu)圖；

圖3elisa法對在成骨誘導條件下，bmsc在磷酸鈣-膠原支架表面生長過程中的分化早期堿性磷酸酶(alp)，和分化晚期骨鈣素(ocn)的檢測結(jié)果，單位ng/ml；圖中分別表示2天、4天、6天、14天結(jié)果的柱狀圖從左至右依次為磷酸鈣-膠原復合涂層+普通培養(yǎng)基，磷酸鈣-膠原復合涂層+成骨誘導培養(yǎng)基；

圖4elisa法對在成骨誘導條件下，bmsc在磷酸鈣-膠原支架表面生長過程中的成骨分化早期轉(zhuǎn)錄因子的檢測結(jié)果，單位ng/ml。a.dlx5；b.osterix.圖中分別表示2天、4天、6天、14天

結(jié)果的柱狀圖，從左至右依次為磷酸鈣-膠原復合涂層+普通培養(yǎng)基，磷酸鈣-膠原復合涂層+成骨誘導培養(yǎng)基；

圖5骨髓間充質(zhì)干細胞在磷酸鈣-膠原復合涂層+普通培養(yǎng)基，磷酸-膠原復合涂層+成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后的堿性磷酸酶染色的照片；從左至右依次為磷酸鈣-膠原復合涂層+普通培養(yǎng)基(a)，磷酸鈣-膠原復合涂層+成骨誘導培養(yǎng)基(b)；

圖6磷酸鈣-膠原體內(nèi)異位成骨；

圖7在致密羥基磷灰石涂層(a)和50％多孔羥基磷灰石圖(b)表面膠原自組裝形成的膠原纖維形貌圖；

圖8骨髓間充質(zhì)干細胞在致密羥基磷灰石涂層-膠原和50％多孔羥基磷灰石涂層-膠原培養(yǎng)2，4，6，14天的堿性磷酸酶的檢測結(jié)果，單位ng/ml；

圖9骨髓間充質(zhì)干細胞在磷酸鈣-膠原+普通培養(yǎng)基和磷酸鈣-膠原+成骨誘導介質(zhì)培養(yǎng)2，4，6，14天的骨鈣素的檢測結(jié)果，單位ng/ml。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法，包括以下步驟：

a、構(gòu)建多孔磷酸鈣支架，所述多孔磷酸鈣支架為磷酸鈣陶瓷或磷酸鈣涂層中的一種；

b、在步驟a的支架上復合膠原，形成磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡；

c、將骨髓間充質(zhì)干細胞接種于步驟b中所述的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡中預培養(yǎng)4～48小時后，加入成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到成骨細胞。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟a中所述磷酸鈣為磷酸二氫鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、磷酸四鈣或雙相磷酸鈣中的至少一種。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟a中所述磷酸鈣支架的力學強度要求≥50kpa；孔隙率10～90％，優(yōu)選30～60％；孔徑10～500μm，優(yōu)選50～200μm。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的膠原為i型膠原，膠原濃度為1～15mg/ml，膠原的ph值為4～6.5。

優(yōu)選的，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的膠原濃度為7～9mg/ml，ph值為5～6.5。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟b中所述的復合膠原的操作為：采用物理吸附的方法將膠原直接復合在磷酸鈣支架表面，在室溫下風干12～36小時。

為了更好的誘導干細胞向成骨細胞分化，本發(fā)明步驟b中所述的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡中纖維直徑為50～600nm，優(yōu)選為100～300nm。

為了使干細胞更好的黏附在基體上，需要將骨髓間充質(zhì)干細胞接種于纖維網(wǎng)絡中進行預培養(yǎng)，優(yōu)選的預培養(yǎng)時間為4～24小時。

其中，上述誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞的方法中，步驟c中所述的成骨誘導培養(yǎng)基組成主要為：地塞米松10^-5～10^-2mmol/l，β-甘油磷酸鈉5～20mmol/l，抗壞血酸0.02～0.05mmol/l；優(yōu)選為地塞米松10^-4mmol/l，β-甘油磷酸鈉10mmol/l，抗壞血酸0.05mmol/l。

本發(fā)明所述的多孔磷酸鈣支架的強度對干細胞向成骨分化具有重要的影響，力學強度低于40kpa時，會促進干細胞向其他方向分化，不利于干細胞向成骨分化，為了實現(xiàn)定向調(diào)控干細胞向成骨細胞分化，本發(fā)明的多孔磷酸鈣支架力學強度要求≥50kpa。

同樣的，多孔磷酸鈣支架的孔隙率也對干細胞向成骨分化具有重要的影響?？紫堵蔬^大時，力學強度難以達到要求，孔隙率過小時，不利于膠原纖維網(wǎng)絡的形成，本發(fā)明要求孔隙率為10～90％，優(yōu)選30～60％；孔徑10～500μm，優(yōu)選50～200μm。

只要滿足上述要求的多孔磷酸鈣支架，都可以用來和本發(fā)明的膠原進行復合，制備成多孔磷酸鈣-膠原復合材料，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞定向分化為成骨細胞。該多孔磷酸鈣支架可以夠買得到，也可以自備得到。

現(xiàn)提供一種制備本發(fā)明多孔磷酸鈣支架的方法，但并不表示將制備方法局限于此。

制備多孔磷酸鈣支架，步驟如下：

a、磷酸鈣粉體制備

磷酸鈣粉體為磷酸二氫鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、磷酸四鈣或雙相磷酸鈣的至少一種；在不斷攪拌下將1.2～3.6mol/l的磷酸氫二銨水溶液滴加到1～3mol/l的硝酸鈣水溶液中，保持反應液30～90℃，以質(zhì)量百分比濃度10％～30％的氨水控制其ph保持在9～12，靜置5～15分鐘，再陳化24～48小時；經(jīng)過過濾、洗滌、干燥、煅燒得到磷酸鈣粉體；

或市購磷酸鈣粉體成品；

b、磷酸鈣支架制備

將步驟a所得的磷酸鈣粉體壓片，成型后置于真空燒結(jié)爐中燒結(jié)，得到磷酸鈣陶瓷；或

采用等離子噴涂的方式，將步驟a所得的磷酸鈣粉體噴涂于基底材料表面，形成多孔磷酸鈣涂層。

其中，所述的基底材料為生物醫(yī)用金屬材料、生物醫(yī)用陶瓷材料、含金屬的生物醫(yī)用復合材料或含陶瓷的生物醫(yī)用復合材料中的一種。

下面通過實施例對本發(fā)明的具體實施方式做進一步的解釋說明，但不表示將本發(fā)明的保護范圍限制在實施例所述范圍內(nèi)。

實施例中，所述的普通培養(yǎng)基組成為：每100ml普通培養(yǎng)基中含有89ml的α-mem培養(yǎng)基，10ml的胎牛血清和1ml的雙抗。

所述的成骨誘導培養(yǎng)基組成為：每100ml的成骨誘導培養(yǎng)基中含有的87.4mlα-mem培養(yǎng)基，10ml的胎牛血清和1ml的雙抗，500ul維生素c(50umol/l)，1ml的甘油磷酸鈉(100mmol/l)，10ul地塞米松(100nmol/l)。

實施例1采用本發(fā)明方法誘導骨髓間充質(zhì)干細胞

按ca10(po4)6(oh)2的鈣磷摩爾比(1.67)，在不斷攪拌下將2.8mol/l的磷酸氫二銨水溶液滴加到2.4mol/l的硝酸鈣水溶液中，保持反應液70℃，以質(zhì)量百分比濃度25％的氨水控制其ph保持在10.5，反應后靜置10分鐘，再陳化24小時，即得固含量為34％的羥基磷灰石懸浮液。然后將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀釋成固含量為17％的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴，使用液相等離子噴涂方法，在生物醫(yī)用金屬基底ti-6al-4v上形成厚度為120微米，孔隙率為50％，孔徑在50～200微米的涂層。涂層表面形貌采用掃描電鏡進行觀察。掃描電鏡照片見圖1。將膠原溶解于醋酸溶液，濃度為7mg/ml，ph值為6，再將膠原溶液0.2ml滴加在涂層上，之后在超凈臺內(nèi)風干12小時。再次將0.2ml的膠原溶液滴加在涂層上。之后在超凈臺內(nèi)風干12小時。膠原在磷酸鈣涂層表面形成直徑為100～300nm纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，形成磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡。磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡采用掃描電鏡進行觀察。掃描電鏡圖片見圖2(a、b)。將骨髓間充質(zhì)干細胞接種在磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡表面后，加入普通培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后，考察其向成骨分化的情況。

實施例2采用本發(fā)明方法誘導骨髓間充質(zhì)干細胞

按ca10(po4)6(oh)2的鈣磷摩爾比(1.67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為2.8mol/l的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為2.4mol/l的硝酸鈣水溶液中，保持反應液70℃，以質(zhì)量百分比濃度25％的氨水控制其ph保持在10.5，反應后靜置10分鐘，再陳化24小時，即得固含量為34％的羥基磷灰石懸浮液。將造孔劑去離子水添加到羥基磷灰石懸浮液中，將其稀釋成固含量為17％的羥基磷灰石懸浮液備用。利用等離子噴涂設備，噴嘴采用霧化噴嘴，使用液相等離子噴涂方法，最后在生物醫(yī)用金屬基底ti-6al-4v上形成厚度為120微米，孔隙率為50％，孔徑在50～200微米的涂層。將膠原溶解于醋酸溶液，濃度為7mg/ml，ph6，再將膠原溶液0.2ml滴加在涂層上，之后在超凈臺內(nèi)風干12小時。再次將0.2ml的膠原溶液滴加在涂層上。之后在超凈臺內(nèi)風干12小時。之后在超凈臺內(nèi)風干12小時，形成膠原纖維直徑為100～300nm的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡(見圖7b)。將骨髓間充質(zhì)干細胞接種在磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡表面預培養(yǎng)24小時后，加入成骨誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后，考察其向成骨分化的情況。

實施例3采用本發(fā)明方法誘導骨髓間充質(zhì)干細胞

按ca10(po4)6(oh)2的鈣磷摩爾比(1.67)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為2.8mol/l的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為2.4mol/l的硝酸鈣水溶液中，保持反應液70℃，以質(zhì)量百分比濃度25％的氨水控制其ph保持在10.5，反應后靜置10分鐘，再陳化24小時，即得固含量為34％的羥基磷灰石懸浮液。將羥基磷灰石懸浮液在70～100℃干燥24h。采用大氣等離子噴涂的方法，最后在生物醫(yī)用金屬基底ti-6al-4v上形成厚度為120微米，致密的羥基磷灰石涂層。將膠原溶解于醋酸溶液，濃度為7mg/ml，ph6，再將膠原溶液0.2ml滴加在涂層上，之后在超凈臺內(nèi)風干12小時。再次將0.2ml的膠原溶液滴加在涂層上。之后在超凈臺內(nèi)風干12小時，形成膠原纖維直徑為40～80nm的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡(見圖7a)。將骨髓間充質(zhì)干細胞接種在磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡表面預培養(yǎng)24小時后，加入成骨誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后，考察磷酸鈣支架孔隙率及膠原纖維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)對干細胞向成骨分化的影響，結(jié)果見圖8。

實施例4采用本發(fā)明方法誘導骨髓間充質(zhì)干細胞

按ca3(po4)2的鈣磷摩爾比(1.5)，在不斷攪拌下將摩爾濃度為2mol/l的磷酸氫二銨水溶液滴加到摩爾濃度為1.7mol/l的硝酸鈣水溶液中，保持反應液75℃，以質(zhì)量百分比濃度20％的氨水控制其ph保持在10.5，反應后靜置15分鐘，再陳化40小時，即得固含量為25％的磷酸三鈣懸浮液備用。將磷酸三鈣懸浮液抽濾、洗滌、干燥、煅燒得到磷酸鈣粉體。添加造孔劑，取10g磷酸三鈣粉體用壓片機壓制成型后，置于真空燒結(jié)爐中，以3℃/分鐘升溫至300℃保溫20min，然后以5℃/分鐘的速度升溫至1000℃/分鐘保溫3小時，繼后隨爐冷卻至室溫即得到磷酸三鈣陶瓷支架。磷酸鈣支架的孔隙率為75％，孔徑100～200微米，抗壓強度71±18kpa，將膠原溶解于醋酸溶液，配置成濃度為8mg/ml，ph5.5的膠原溶液，將磷酸鈣支架浸泡在溶液中12小時，之后在超凈臺內(nèi)風干14小時，形成膠原纖維直徑為100～300nm的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡。將骨髓間充質(zhì)干細胞接種在磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡表面后預培養(yǎng)4小時后，加入成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，其成骨效果見圖9。

效果驗證試驗

細胞分化

將實施例1和實施例2制備的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡置于24孔培養(yǎng)板中。取第三代生長旺盛的sd大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞制得2*10⁴的細胞懸液，按1ml/孔的量接種于纖維網(wǎng)絡表面，實施例1在普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)，實施例2在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)2天，4天，6天和14天后取出，每孔加10ul裂解液(tritonx-100)，反復吹打，并放置于37℃孵育箱中過夜，鏡下觀察有無完整細胞，按elisa試劑盒(藍基，中國)說明操作，在450nm下測量其吸光度，根據(jù)標準曲線計算dlx5、osterix、alp和ocn值。結(jié)果見圖3、4。

圖3考察的是骨髓間充質(zhì)干細胞在磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡表面的堿性磷酸酶和骨鈣素的表達情況。由圖3可看出：實施例2中加入成骨誘導介質(zhì)，能促進堿性磷酸酶和骨鈣素的表達，表明成骨誘導介質(zhì)的加入能夠與磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡協(xié)同作用，進一步加強磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡的成骨誘導能力。

圖4考察的是不同培養(yǎng)方法對早期成骨相關轉(zhuǎn)錄因子dlx5和osterix的影響。由圖4可知，實施例2加入的成骨誘導介質(zhì)能顯著促進dlx5和osterix的表達，進一步證明磷酸鈣和成骨誘導介質(zhì)對干細胞成骨分化具有協(xié)同促進作用。

將實施例3制備的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡置于24孔培養(yǎng)板中。取第三代生長旺盛的sd大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞制得2*10⁴的細胞懸液，按1ml/孔的量接種于材料表面，在成骨誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)2天，4天，6天和14天后取出，每孔加10ul裂解液(tritonx-100)，反復吹打，并放置于37℃孵育箱中過夜，鏡下觀察有無完整細胞，按elisa試劑盒(藍基，中國)說明操作，在450nm下測量其吸光度，根據(jù)標準曲線計算alp，將其與實施例2所得結(jié)果進行對比，如圖8所示。

由圖8可看出：實施例2中采用孔隙率為50％的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡誘導骨髓間充質(zhì)干細胞相比實施例3中采用致密磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡誘導骨髓間充質(zhì)干細胞，alp值更高，尤其是當誘導14天后，alp值達到顯著差異，說明磷酸鈣支架的孔隙率對干細胞的成骨分化息息相關，多孔的磷酸鈣支架更能促進干細胞的成骨分化。

堿性磷酸酶染色

將實施例1和實施例2制備的磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡置于24孔培養(yǎng)板中。取第三代生長旺盛的sd大鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞制得2*10⁴的細胞懸液，按1ml/孔的量接種于網(wǎng)絡表面，分別在普通培養(yǎng)基(實施例1)和成骨誘導培養(yǎng)基(實施例2)中14天培養(yǎng)。之后材料表面的細胞進行堿性磷酸酶活性染色，所有過程均嚴格按照南京建成堿性磷酸酶染色試劑盒說明書指定操作流程進行，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果見圖5。

由圖5可知：磷酸鈣-膠原表面骨髓間充質(zhì)干細胞的堿性磷酸酶成陽性，成骨誘導介質(zhì)的加入，堿性磷酸酶的活性增強(b)，表明磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡及成骨誘導介質(zhì)構(gòu)建的細胞微環(huán)境能有效的促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨分化。

體內(nèi)成骨實驗

取成年新西蘭大白兔5只，體重2.0～2.5kg，雌雄不限，清潔級。實驗過程對動物的處置符合動物倫理學標準。將實施例1中裝載磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡植入兔的背部肌肉以觀察材料的骨誘導性。在術后4周處死動物，取材后，立即將標本置于10％甲醛中固定24h，制成石蠟標本。標本垂直向切片，切片厚度5μm，he染色，光鏡下觀察。圖6為在光境下能觀察到大量的骨細胞，表明磷酸鈣-膠原纖維網(wǎng)絡在體內(nèi)具有良好的骨誘導性。