本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮細(xì)胞中的主要細(xì)胞，它可以形成表皮細(xì)胞特有基本結(jié)構(gòu)，即基底層、棘層、顆粒層和角質(zhì)層，部分部位的表皮還會(huì)形成透明層。一般的二維的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)多選用無血清培養(yǎng)體系，通過給基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加各種外源性的因子，保證角質(zhì)形成細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定、延緩老化發(fā)生。但無血清培養(yǎng)液中的添加因子多數(shù)都比較昂貴，嚴(yán)重影響角質(zhì)形成細(xì)胞及拓展產(chǎn)品的規(guī)?；纳a(chǎn)。隨著生物技術(shù)和組織工程技術(shù)的日益發(fā)展，應(yīng)用角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建而成的組織工程皮膚的應(yīng)用也日益廣泛。角質(zhì)形成細(xì)胞在培養(yǎng)過程中極易發(fā)生老化及狀態(tài)不佳，尤其是在含高濃度血清的培養(yǎng)體系中幾乎無法維持形態(tài)，含高濃度血清培養(yǎng)體系不能滿足角質(zhì)形成細(xì)胞正常增殖和分化的要求，所以開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、有效的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)體系，滿足二維及三維組織工程皮膚構(gòu)建的需求意義重大。

滋養(yǎng)層細(xì)胞是干細(xì)胞篩選、培養(yǎng)及誘導(dǎo)型多功能干細(xì)胞（ipscs）培養(yǎng)常用的一種技術(shù)，原代或初期培養(yǎng)階段一般都需依賴于能分泌他們?cè)隗w外存活增殖所必需的生長因子的飼養(yǎng)層細(xì)胞。不同類型的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的生長因子略有不同，但都要求培養(yǎng)過程中的滋養(yǎng)層細(xì)胞不分裂不增殖而仍保持代謝活性。常見的可作為滋養(yǎng)層的細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、3t3細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等，常用的有絲分裂阻斷劑為絲裂霉素c（mitomycinc，mc），它與dna鏈形成交聯(lián)，抑制dna復(fù)制，對(duì)rna也有抑制作用，從而達(dá)到上述目的。

中國專利201410382321.2公開了一種建立和培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法中，通過用絲裂霉素c處理人成纖維細(xì)胞做滋養(yǎng)層，可極大提高誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的安全性和成功率。專利申請(qǐng)?zhí)枮?01310547699.9的發(fā)明中公開了一種運(yùn)用絲裂霉素c處理人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，能有效提高誘導(dǎo)成功率。目前尚未見在含血清體系中將滋養(yǎng)層細(xì)胞用于角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)及表皮組織構(gòu)建的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系。該培養(yǎng)體系用絲裂霉素c處理的成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，利用成纖維細(xì)胞分泌的各種因子和蛋白等供給角質(zhì)形成細(xì)胞生長需要，同時(shí)配合低濃度血清和cacl2，可以最大限度滿足角質(zhì)形成細(xì)胞生長的營養(yǎng)需求，降低角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)成本，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，但又不會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過度分化、老化，為角質(zhì)形成細(xì)胞的含血清培養(yǎng)提供了有力的支持，滿足了規(guī)?；a(chǎn)所需的經(jīng)濟(jì)、有效且不影響生產(chǎn)效率的要求。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，其特征在于，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液、α-mem培養(yǎng)液、f12培養(yǎng)液或df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%～15%，絲裂霉素c的濃度為10μg/ml～40μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液、α-mem培養(yǎng)液、f12培養(yǎng)液或df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，液下培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為1%～5%，氯化鈣的濃度為0.1mm～0.5mm。

上述的一種角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法為：將復(fù)蘇好的成纖維細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照3×104/cm2～6×104/cm2的密度將復(fù)蘇后的成纖維細(xì)胞接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h～24h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于co2培養(yǎng)箱中處理2h～6h后棄去培養(yǎng)液，用pbs緩沖溶液沖洗3～5次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層。

上述的一種角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，其特征在于，所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液、α-mem培養(yǎng)液、f12培養(yǎng)液或df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%～15%。

另外，本發(fā)明還提供了一種利用上述培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照1×105/cm2～5×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的培養(yǎng)體系中的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，其不增殖但保持代謝活性，僅需利用較少的營養(yǎng)便可達(dá)到減少外源添加因子的目的，它分泌出的成纖維生產(chǎn)因子（fgf），尤其是堿性成纖維生長因子（β-fgf）可促進(jìn)內(nèi)皮樣細(xì)胞增殖，同時(shí)對(duì)損傷的細(xì)胞有較好的修復(fù)作用；分泌出的轉(zhuǎn)化生長因子（tgf）對(duì)于細(xì)胞是一多功能蛋白質(zhì)，可以影響多種細(xì)胞的生長、分化、細(xì)胞凋亡及免疫調(diào)節(jié)等功能，其中的轉(zhuǎn)化生長因子-β（tgf-β）可以通過smad信號(hào)通路和/或daxx信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)功能，促進(jìn)細(xì)胞增殖。由于成纖維細(xì)胞會(huì)分泌天然的膠原，更有利于角質(zhì)形成細(xì)胞的貼附和生長。

2、本發(fā)明的含血清的培養(yǎng)液中的基礎(chǔ)成分可滿足角質(zhì)形成細(xì)胞基本生理需要，添加低濃度的血清可以部分替代角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)液中添加因子的作用，為角質(zhì)形成細(xì)胞提供營養(yǎng)，如部分替代牛腦垂體提取物，使角質(zhì)形成細(xì)胞不至于暴露在高濃度的血清中（常規(guī)血清濃度為10%）而發(fā)生老化。同時(shí)利用成纖維細(xì)胞分泌的其他種類的因子和蛋白共同保證角質(zhì)形成細(xì)胞正常生長需求。

3、本發(fā)明的含血清的培養(yǎng)液中cacl2的濃度為0.1mm～0.5mm，低濃度的ca2+（0.1mm～0.5mm）可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，而高濃度的ca2+則可以促進(jìn)其分化，在含血清的培養(yǎng)液中添加0.1mm～0.5mm的cacl2可以有效保證角質(zhì)形成細(xì)胞生長狀態(tài)，抑制其過度分化老化。

4、本發(fā)明用絲裂霉素c處理的成纖維細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，利用成纖維細(xì)胞分泌的各種因子和蛋白如fgf、mmp及tgf等供給角質(zhì)形成細(xì)胞生長需要，同時(shí)配合低濃度血清，可以最大限度滿足角質(zhì)形成細(xì)胞的生長的營養(yǎng)需求，降低角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)成本。培養(yǎng)液中加入低濃度的cacl2，可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，但是又不會(huì)導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞過度分化、老化，為角質(zhì)形成細(xì)胞的含血清培養(yǎng)提供了有力的支持，滿足了規(guī)?；a(chǎn)所需的經(jīng)濟(jì)、有效且不影響生產(chǎn)效率的要求。

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖2為對(duì)比例培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例3培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例4培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例5培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例6培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例7培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例8培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例9培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例10培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例11培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例12培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞的200倍放大圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%，絲裂霉素c的濃度為40μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，氯化鈣的濃度為0.5mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照6×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理2h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞3次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照5×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖1。

對(duì)比例

按照實(shí)施例1的方法制備成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層并接種角質(zhì)形成細(xì)胞，然后加入無血清培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖2；所述無血清培養(yǎng)液以k-sfm培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加無菌因子bpe，無血清培養(yǎng)液中無菌因子bpe的濃度為25μg/ml。

對(duì)比圖1和圖2可以看出，實(shí)施例1和對(duì)比例培養(yǎng)的細(xì)胞在細(xì)胞狀態(tài)上無明顯差異，均未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象，說明采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理得到的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層配合含血清的培養(yǎng)液能夠支持角質(zhì)形成細(xì)胞正常生長。而且同樣條件下，實(shí)施例1的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)48h后的融合度要高于對(duì)比例（60%vs40%），說明本發(fā)明的培養(yǎng)體系能更好的促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖活性。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，絲裂霉素c的濃度為20μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為1%，氯化鈣的濃度為0.1mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理3h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞5次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照1×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖3，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%，絲裂霉素c的濃度為10μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為3%，氯化鈣的濃度為0.2mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照5×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理6h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞4次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照3×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖4，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例4

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%，絲裂霉素c的濃度為30μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為4%，氯化鈣的濃度為0.3mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理5h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞5次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照5×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖5，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例5

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，絲裂霉素c的濃度為10μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，氯化鈣的濃度為0.1mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照6×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理2h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞5次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照3×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖6，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例6

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%，絲裂霉素c的濃度為40μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，氯化鈣的濃度為0.5mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照6×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理2h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞3次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照5×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖7，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例7

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，絲裂霉素c的濃度為40μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為1%，氯化鈣的濃度為0.1mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理3h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞5次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照1×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖8，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例8

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%，絲裂霉素c的濃度為10μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，氯化鈣的濃度為0.5mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照5×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理6h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞4次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以f12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照3×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖9，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例9

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%，絲裂霉素c的濃度為10μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為4%，氯化鈣的濃度為0.3mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理3h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞3次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為10%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照5×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖10，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例10

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%，絲裂霉素c的濃度為20μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為3%，氯化鈣的濃度為0.2mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照5×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理6h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞4次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為5%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照3×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖11，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例11

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%，絲裂霉素c的濃度為30μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以df12培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為1%，氯化鈣的濃度為0.1mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照6×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理2h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞3次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以低糖型dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照5×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖12，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

實(shí)施例12

本實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞含血清培養(yǎng)體系，包括用于培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層和含血清的培養(yǎng)液；所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層為采用含絲裂霉素c的培養(yǎng)液處理的成纖維細(xì)胞，所述含絲裂霉素c的培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和絲裂霉素c，含絲裂霉素c的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%，絲裂霉素c的濃度為40μg/ml；所述含血清的培養(yǎng)液以dmem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清和氯化鈣，含血清的培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為1%，氯化鈣的濃度為0.5mm。

本實(shí)施例中，所述成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層的制備方法具體為：復(fù)蘇p2代人成纖維細(xì)胞，對(duì)復(fù)蘇的成纖維細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到85%左右進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照3×104/cm2的密度接種于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后棄去培養(yǎng)液，然后加入含絲裂霉素c的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中處理3h后棄去培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱的pbs緩沖溶液輕柔沖洗細(xì)胞5次，得到成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層；所述成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液以α-mem培養(yǎng)液為基礎(chǔ)液，添加胎牛血清，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中胎牛血清的體積百分含量為15%。

利用本實(shí)施例的培養(yǎng)體系培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞的方法具體為：將復(fù)蘇好的角質(zhì)形成細(xì)胞消化后重懸計(jì)數(shù)，按照接種密度計(jì)算所需細(xì)胞量，然后按照1×105/cm2的密度將重懸后的角質(zhì)形成細(xì)胞接種至成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層表面，再加入含血清的培養(yǎng)液，于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天換液一次，培養(yǎng)48h后拍照觀察，結(jié)果見圖13，從圖中可以看出，本實(shí)施例培養(yǎng)的細(xì)胞狀態(tài)良好，未出現(xiàn)老化分化現(xiàn)象。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明做任何限制，凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效結(jié)構(gòu)變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。