一種體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養(yǎng)液的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，涉及一種體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養(yǎng)液。
【背景技術】
[0002]體外皮膚模型是應用組織工程技術在體外通過對種子細胞的條件化培養(yǎng)而構建而成的一塊皮膚組織，該組織與人體皮膚在組織結構及部分生物學功能上有著高度的相似性，因此被廣泛應用于化妝品、藥品等產品及原料的功效性和安全性評價、檢測。目前常見的體外皮膚模型有:表皮模型，含真皮層、表皮層的全層皮膚模型，含有黑色素細胞的表皮模型等。
[0003]市售的體外皮膚模型在構建完成后，直接保存在構建培養(yǎng)液中，其宣傳的使用期限多以3天為主，但都推薦在模型構建完成后24小時內使用，因為皮膚模型為活細胞產品，會持續(xù)生長、分化，長時間的增殖分化必然會改變皮膚模型的結構及生物學功能，從而導致測試結果不準確；另外，根據某些測試目的的不同，需要延長模型的培養(yǎng)、處理時間，仍難以避免出現上述問題。構建培養(yǎng)液的培養(yǎng)體系僅能支持皮膚模型正常生發(fā)，但無法滿足構建完成后的皮膚模型維持結構及生物學特性，因此開發(fā)一種可以用于體外皮膚模型培養(yǎng)、保存用的培養(yǎng)液意義重大。
[0004]角質形成細胞是表皮中的主要細胞，具有干細胞特性，能在不同培養(yǎng)條件刺激下分化成表皮基底層細胞、棘層細胞、顆粒層細胞及角質層細胞，形成與正常表皮結構高度一致的四層結構。一般體外皮膚模型構建成功后的測試培養(yǎng)周期不超過3天就會出現活力下降及組織過度分化的現象。正常分離出來的角質形成細胞多采用K-SFM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，在體外擴增傳代不超過10代就會出現老化，甚至死亡的現象，尤其是在含血清的培養(yǎng)體系中，其老化死亡速度更快。
[0005]為延緩或重新恢復角質形成細胞的增殖、分化能力，保證體外皮膚模型結構及活力滿足測試要求，唯有通過表皮細胞的去分化技術。一類是通過轉基因技術給已分化細胞通過病毒轉染體系轉入oct4，sox2，C-Myc及klf4 4種基因，經過體外誘導使終末分化細胞重新具有干細胞特性，即誘導多功能干細胞(iPS Cell);另一類是通過非轉基因技術，通過核移植、體細胞克隆，過氧化氫處理及熱刺激等方法使細胞去分化。但上述方法僅限于理論研究，技術難度較大，會導致成本倍增，不利于產業(yè)化操作，而且處理方法會對構建的模型產生損傷，造成模型測試結果的不準確。
[0006]針對以上問題，學者們通過研究發(fā)現，改變表皮細胞所處的微環(huán)境，有可能使已分化細胞去分化而逆轉成表皮干細胞，例如，通過給培養(yǎng)液中添加表皮細胞生長因子(EGF)，堿性成纖維細胞生長因子(β-FGF)，轉化生長因子(TGF)等多種因子，可以使分化的表皮細胞重新呈現干細胞特性。添加干細胞及腫瘤細胞提取液也能起到相似的作用。
[0007]通過上述處理，雖然能夠使已經發(fā)生分化的細胞重新呈現分化前的狀態(tài)，同時對老化及損傷的細胞的也有一定的復壯作用，從而保證體外皮膚模型繼續(xù)保持一定的增殖分化能力，但是在正常的培養(yǎng)液中，模型也會保持正常的生長速度，甚至更快，所以單純添加上述因子或含有上述因子的混合物并不能實現延長模型培養(yǎng)期限的目的，無法平衡增殖與分化之間的速度。
[0008]研究表明甘醇酸有促進表皮細胞增殖，溶解角質層，抑止表皮細胞過度分化，逆轉早期腫瘤細胞惡性等作用。研究表明低劑量I X 10—7M維甲酸可以顯著降低如Kl，K10，K11等與表皮細胞分化有關的角蛋白的表達，能從一定程度上控制皮膚的過度分化，平衡增殖分化速度。
[0009]中國專利200810169475.8中提到通過改變熱刺激條件和生長因子干預的方法可使表皮細胞去分化轉變?yōu)楸砥じ杉毎Ｔ摲椒ㄐ鑼Ρ砥ぜ毎麩峒ぬ幚砗?，然后在生長因子的作用下，繼續(xù)孵育培養(yǎng)7?14天，首先前期處理時間過長，對于體外皮膚模型的生產周期及成本會顯著增加;其次干細胞構建后期數量會急劇減少而得不到補充，不能從根本解決構建后期模型活力降低及過度分化的問題。
[0010]中國專利200910078302.X及201010196382.1中均提及，體外皮膚模型培養(yǎng)液系統(tǒng)僅限于皮膚模型的構建培養(yǎng)，用此類培養(yǎng)基，可保證體外皮膚模型生發(fā)成正常的結構，對于保存期間及正常使用期間的結構變化不能有效控制，而在此期間發(fā)生的模型屏障功能及其他精細結構的變化對模型測試結果的準確性又有很大的影響;對于需要長期培養(yǎng)、處理的體外皮膚模型，應用上述培養(yǎng)體系將會因組織活力下降、組織結構嚴重變化而無法實現。
[0011]目前還未見有一種培養(yǎng)液能夠支持含有表皮細胞的體外皮膚模型長效培養(yǎng)，因此本發(fā)明對延長體外皮膚模型應用時間，拓寬體外皮膚模型應用領域，以及表皮細胞相關疾病研究等方面有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明目的在于，主要針對體外皮膚模型在體外長效培養(yǎng)過程中，會出現活力下降及過度分化而導致無法應用于測試的問題，本發(fā)明在體外皮膚模型基礎培養(yǎng)液的基礎上，通過胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物與甘醇酸的協同作用，提供一種可用于體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養(yǎng)的培養(yǎng)液。
[0013]本發(fā)明目的主要通過以下技術方案來實現:一種體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養(yǎng)用培養(yǎng)液，組分包括基礎培養(yǎng)液，添加了胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物和甘醇酸。
[0014]所述基礎培養(yǎng)液是K-SFM或M⑶Β153或體積比為I: 3的F12和DMEM混合培養(yǎng)液，其中添加了 5~50yg/ml 的BPE，5?50ng/ml的EGF，l~20yg/ml的膜島素，0.01?0.0.Smmol /ml 的CaCl2o
[0015]所述胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物的濃度為0.01?30mg/ml;
所述甘醇酸的濃度為I X 10—9?I X 10—5mol/L;
一種體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養(yǎng)液的配制方法如下:
在K-SFM、MCDB153、體積比為I: 3混合的F12和DMEM三種培養(yǎng)液中的任意一種中，依次添加終濃度為5?50yg/ml的BPE，5?50ng/ml 的EGF，I?20yg/ml的膜島素，0.01?0.05mmol/ml的CaCl2，制備完成基礎培養(yǎng);將胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物按照終濃度為0.01?30mg/ml添加到基礎培養(yǎng)液中，然后添加甘醇酸，終濃度I X 10—9?I X 10—5mol/L，混合均勻后用0.22μπι的濾膜過濾除菌后即可用于體外皮膚模型的長效培養(yǎng)或者角質形成細胞的培養(yǎng)。
[0016]體外皮膚模型及角質形成細胞長效培養(yǎng)液的使用方法: 將構建培養(yǎng)成功后的體外皮膚模型中的培養(yǎng)液棄去，加入長效培養(yǎng)液繼續(xù)進行氣液面培養(yǎng)，每24小時換液I次，可以連續(xù)培養(yǎng)7天。在此期間可隨時終止培養(yǎng)，根據檢測要求直接進行后續(xù)檢測操作。
[0017]將消化好的原代角質形成細胞或傳代的角質形成細胞，直接采用長效培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每24小時換液一次，擴增至第十二代，期間可根據檢測及研究需要直接使用。
[0018]本發(fā)明中的基礎培養(yǎng)液含有體外皮膚模型培養(yǎng)所需基本物質，可以保證體外皮膚模型正常生長。所使用的胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物中，含有各種細胞因子，且經過超濾濃縮處理后，有效因子及活性成分的含量得到了富集，這些因子及活性成分對于維持干細胞微環(huán)境，細胞損傷修復，以及促使分化細胞重新獲得分化能力上有極大的作用。其中干細胞生長因子(SCGF)對于激活和維持干細胞增殖、分化能力，堿性成纖維生長因子(β-FGF)可促進內皮樣細胞增殖，同時對損傷細胞有較好的修復作用。轉化生長因子(TGF)對于細胞是一多功能蛋白質，可以影響多種細胞的生長、分化、細胞凋亡及免疫調節(jié)等功能，轉化生長因子-1KTGF-β)是TGF家族的一員，可以通過SMAD信號通路和/或DAXX信號通路發(fā)揮其生物學功能。除上述因子外，干細胞培養(yǎng)液提取物中還含有其他各種細胞生長因子如表皮生長因子(EGF)，神經生長因子(NGF)，肝細胞生長因子(HGF)，腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)，血小板源性生長因子(PDGF)，血管內皮生長因子(VEGF)等，這些都是干細胞生長必不可少的因子，對于維持干細胞生長環(huán)境有重要的作用。通過上述因子的作用，激活與細胞增殖、分化調節(jié)有關的最主要的MAPK通路，延緩或逆轉細胞老化狀態(tài)，同時也可以修復細胞損傷，提高細胞增殖、分化活力。
[0019]研究表明，甘醇酸除了對表皮有去角質、抗增殖作用。其最基本的作用可能是在與組織蛋白質結合后轉移到細胞核內，調控基因的表達，從而調節(jié)角質生成細胞的分化過程。
[0020]本發(fā)明通過胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物及甘醇酸兩者的協同作用，保證了體外皮膚模型在體外長效培養(yǎng)過程中的組織活力及結構完整，從而保證正常的模型生物學功能。其中胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物中含有細胞生長及去分化的各種因子，如TGF、EGF、FGF、SCGF等，這些因子可以有效提高組織內細胞活性，修復損傷細胞，延緩或逆轉已分化細胞狀態(tài)，增加組織內活細胞及有增殖分化能力細胞的數量，從而為正常組織的培養(yǎng)時間的延長提供基礎；同時為了保證組織不會因為活力增強而隨培養(yǎng)時間增長出現過度增殖的現象，添加一定量的甘醇酸，通過其對表皮細胞增殖分化的抑制作用及對角質層的溶解作用，達到增殖與分化的完美平衡，從而實現延長體外皮膚模型的體外培養(yǎng)時間，為后期測試及相關研究提供可靠地條件支持。
[0021 ]目前還未見將胚胎干細胞培養(yǎng)液提取物及甘醇酸用于體外皮膚模型及角質細胞培養(yǎng)相關報道，因此，本專利組合應用以上兩種物質，開發(fā)一種新型長效培養(yǎng)液，該培養(yǎng)液能有效的平衡體外皮膚模型及角質形成細胞增殖及分化速度，能延長體外皮膚模型構建成功后的有效檢測時間，從常規(guī)3天有效檢測時間延長至7天，同時可提升常規(guī)3天有效期內模型質量，提高檢測結果的準確性，極大的滿足不同檢測條件的時間要求，拓展體外皮膚模型應用