本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種丙型肝炎病毒（HCV）檢測試劑盒，特別涉及一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

丙型肝炎病毒（(Hepatitis C Virus，HCV）屬于黃病毒科(flaviviridae)，其基因組為單股正鏈RNA病毒，易變異，目前可分為6個(gè)基因型及50多種不同亞型。HCV體呈球形，其直徑小于80nm（在肝細(xì)胞中為36～40nm，在血液中為36-62nm ）。

HCV感染可引起丙型病毒性肝炎，主要通過輸血傳播、性傳播、生活密切接觸傳播（如共用剃須刀、牙刷等）。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有1.8億人感染HCV，我國人口的平均感染率為3.2%，有約4千萬丙型肝炎病毒攜帶者。由于病毒生物學(xué)特點(diǎn)和宿主免疫功能等多方面因素，機(jī)體免疫往往難以有效清除病毒，HCV感染者有約50%~80%發(fā)展為慢性肝炎，其中20%~30%將發(fā)展成肝硬化，而肝硬化患者中每年有1%~4%發(fā)展成為肝細(xì)胞癌癥。丙型肝炎所造成的健康危害和經(jīng)濟(jì)損失十分巨大。因此，一種有效、快速、簡便的HCV的檢測試劑盒對(duì)臨床HCV輔助診斷均有十分重要的作用。

目前HCV檢測方法有ELISA、RIA、測序、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。其中，ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種試驗(yàn)技術(shù)，但其干擾因素較多，重復(fù)性不好；靈敏度不夠高；容易出現(xiàn)假陽性。RIA是基于競爭性結(jié)合反應(yīng)原理的放射免疫分析技術(shù)，但只能以免疫反應(yīng)測得具有免疫活性的物質(zhì)，對(duì)具有生物活性但失去免疫活性的物質(zhì)是檢測不出來的；使用了生物試劑，其穩(wěn)定性受多種因素影響，不夠穩(wěn)定；靈敏度不夠高；是競爭性的反應(yīng)，被測物和標(biāo)準(zhǔn)物都不能全部參與反應(yīng)，測得的值是相對(duì)量而非絕對(duì)量；存在放射線輻射和污染。測序是對(duì)基因的序列進(jìn)行判斷的一種方法，可以對(duì)HCV進(jìn)行分型檢測，但其操作復(fù)雜、耗時(shí)，且儀器設(shè)備昂貴；實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次PCR循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，其靈敏度高，但需要的儀器設(shè)備昂貴，不利于大規(guī)模推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒，主要解決現(xiàn)行技術(shù)靈敏度低、操作復(fù)雜、耗時(shí)、所需儀器設(shè)備昂貴等問題。本發(fā)明試劑盒不依賴于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，僅需在恒溫條件下即可進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒，包括PCR反應(yīng)液，PCR反應(yīng)啟動(dòng)液、PCR反應(yīng)酶系，HCV的特異性引物及探針，內(nèi)標(biāo)18S RNA的特異性引物及探針，陰陽性質(zhì)控品。其中，所述的HCV特異性引物及探針、內(nèi)標(biāo)18S RNA的特異性引物及探針序列如下：

檢測HCV的上游引物F1的序列為：

CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC；

檢測HCV的下游引物R1的序列為：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC；

檢測HCV的熒光探針P1序列為：FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ；

檢測內(nèi)標(biāo)18SRNA的上游引物F1序列為：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC；

檢測內(nèi)標(biāo)18SRNA的下游引物R1的序列為：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC；

檢測內(nèi)標(biāo)18SRNA的熒光探針P1序列為：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ。

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)液的具體組分如下：

品名 濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度）

Tris-緩沖液 50~100mmol/L

KCl 20~60mmol/L

二硫蘇糖醇 2~5mmol/L

甜菜堿 0.5~2mol/L

海藻糖 1%~4%

PEG 2%~5%

BSA 0.1~0.6mg/mL

優(yōu)選的，Tris-緩沖液可選自Tris-H₂SO₄、Tris-乙酸、Tris-HCl中的任意一種或多種，Tris-緩沖液的pH為7.0～9.0。

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)啟動(dòng)液的具體組分如下：

品名 摩爾濃度

Mg²⁺ 8mmol/L~30mmol/L

優(yōu)選的，Mg²⁺來自于硫酸鎂、乙酸鎂、氯化鎂中的任意一種或多種。

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)酶系的具體組分如下：

品名 濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）

dNTPs 180~250μmol/L

聚合酶BSU 120~160ng/μl

單鏈結(jié)合蛋白 200~700ng/μl

重組酶（E.coli RecT） 100~300ng/μl

逆轉(zhuǎn)錄酶 0.05~0.9U/μl

聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白、重組酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的用量可以根據(jù)需要調(diào)整其添加量，或通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定其用量。

優(yōu)選的，一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)液的具體組分如下：

品名 濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度）

Tris-HCl（pH=9.0） 80mmol/L

KCl 40mmol/L

二硫蘇糖醇 3.2mmol/L

甜菜堿 1mol/L

海藻糖 3%

PEG 4%

BSA 0.3mg/mL

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR啟動(dòng)液的具體組分如下：

品名 摩爾濃度

氯化鎂 20mmol/L

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)酶系的具體組分如下：

品名 濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）

dNTPs 220μmol/L

聚合酶BSU 140ng/μl

單鏈結(jié)合蛋白 700ng/μl

重組酶（E.coli RecT） 200ng/μl

逆轉(zhuǎn)錄酶 0.1U/μl

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的特異性引物及探針序列如下：

HCV-F1：CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC

HCV-R1：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC

HCV-P1：

FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ

18S-F1：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC

18S-R1：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC

18S-P1：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ 。

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的陰陽性質(zhì)控品如下：

品名 成分

陽性質(zhì)控品 含有18SRNA、HCV假病毒

陰性質(zhì)控品 DEPC水 。

優(yōu)選的，一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒，其HCV探針連接的熒光基團(tuán)不同于內(nèi)標(biāo)18SRNA探針連接的熒光基團(tuán)。

優(yōu)選的，一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒采用的重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ噬菌體β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exo∥蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

優(yōu)選的，恒溫?cái)U(kuò)增的溫度為35～42℃，優(yōu)選擴(kuò)增溫度為37℃。

本發(fā)明的有益效果：

①本發(fā)明的丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒不依賴于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，主要利用重組酶的活性，僅在恒溫條件下即可進(jìn)行核酸的擴(kuò)增。在多重工具酶匹配進(jìn)行有效擴(kuò)增，擴(kuò)增效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)熒光PCR技術(shù)，且所用時(shí)間更短，30min內(nèi)即可完成。

②本發(fā)明的恒溫?cái)U(kuò)增體系使用熒光實(shí)時(shí)定量技術(shù)，應(yīng)用范圍更廣，適用于市面上大多數(shù)熒光定量擴(kuò)增儀（如ABI7500、ABI7300、LC480）。

③本發(fā)明還可跟試紙條組合，在未來可走進(jìn)普通家庭，為實(shí)現(xiàn)個(gè)人自我診斷提供不可缺的幫助，擁有巨大的潛在市場，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益不可估量。

附圖說明

圖1至圖5依次分別為實(shí)施例1至實(shí)施例5的目的基因的熒光結(jié)果圖，圖中熒光曲線的標(biāo)號(hào)對(duì)應(yīng)實(shí)施例中反應(yīng)管的標(biāo)號(hào)。

具體實(shí)施方式

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒，采用了一種不依賴于高能量分子的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。試劑盒成分包括PCR反應(yīng)液，PCR啟動(dòng)液，PCR反應(yīng)酶系，HCV特異性引物及探針,內(nèi)標(biāo)18S RNA的特異性引物及探針，各成分的具體組分如下：

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)液的具體組分如下：

品名 濃度（摩爾濃度/質(zhì)量分?jǐn)?shù)/質(zhì)量濃度）

Tris-HCl（pH=9.0） 80mmol/L

KCl 40mmol/L

二硫蘇糖醇 3.2mmol/L

甜菜堿 1mol/L

海藻糖 3%

PEG 4%

BSA 0.3mg/mL

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR啟動(dòng)液的具體組分如下：

品名 摩爾濃度

氯化鎂 20mmol/L

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的PCR反應(yīng)酶系的具體組分如下：

品名 濃度（摩爾濃度/酶濃度/質(zhì)量濃度）

dNTPs 220μmol/L

聚合酶BSU 140ng/μl

單鏈結(jié)合蛋白 700ng/μl

重組酶（E.coli RecT） 200ng/μl

逆轉(zhuǎn)錄酶 0.1U/μl

作為上述反應(yīng)試劑的進(jìn)一步改進(jìn)，所使用的Tris-HCL的pH為9.0。

聚合酶為恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中常用的聚合酶，優(yōu)選為Bsu或klenow；逆轉(zhuǎn)錄酶為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中常用的逆轉(zhuǎn)錄酶，優(yōu)選為常溫條件下反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV或者M(jìn)MLV。重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ噬菌體β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exo∥蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的特異性引物及探針序列如下：

HCV-F1：CCTACTACCGCGGTCTTGACGTGTCTGTCATC

HCV-R1：CAGTCTATCACCGAGTCGAAATCGCCGGTAAAGCC

HCV-P1：

FAM-CGGCCAGTG(dSpacer)CGATGTTGTCGTAGTGGCAAC-BHQ

18S-F1：CCGATCGCACGCCCCCCGTGGCGGCGACGACC

18S-R1：CCCGTCACCCGTGGTCACCATGGTAGGCAC

18S-P1：

HEX-CGAACGTCT(dSpacer)CCCTATCAACTTTCGATGGTAGTC-BHQ 。

一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的陰陽性質(zhì)控品如下：

品名 成分

陽性質(zhì)控品 含有18SRNA、HCV假病毒

陰性質(zhì)控品 DEPC水 。

下面結(jié)合具體的實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒的優(yōu)勢，但并非限制本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)樣本來源：

以感染HCV血漿經(jīng)提取得到的核酸溶液作為樣本；

以含有內(nèi)標(biāo)、HCV假病毒溶液作為陽性質(zhì)控品；

以DEPC水作為陰性質(zhì)控品。

實(shí)施例1（HCV的檢測）：

取3個(gè)200μl反應(yīng)管，分別標(biāo)記為反應(yīng)管1~3。在反應(yīng)管1~3中分別加入35μl的PCR反應(yīng)液、3μl的PCR反應(yīng)酶系；2μl引物混合液（HCV-F1、HCV-R1、18S-F1、18S-R1引物濃度分別為0.2μmol/L），2μl探針混合液（HCV-P1、18S-P1探針濃度分別為0.06μmol/L）。在反應(yīng)管1加入HCV核酸5μl ；在反應(yīng)管2中加入陽性質(zhì)控品5μl；在反應(yīng)管3中加入陰性質(zhì)控品5μl。最后，在反應(yīng)管1~3中加入3μl的PCR啟動(dòng)液（各管的終體積為50μl）。

選擇熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：37℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光。結(jié)果如圖1。

實(shí)施例2（非最優(yōu)擴(kuò)增溫度條件的檢測）：

同實(shí)施例1，不同處在于上機(jī)條件改為：34℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都收集熒光。結(jié)果如圖2。

實(shí)施例3（非最優(yōu)擴(kuò)增溫度條件的檢測）：

同實(shí)施例1，不同處在于上機(jī)條件改為：40℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都收集熒光。結(jié)果如圖3。

實(shí)施例4（特異性實(shí)驗(yàn)）：

取6個(gè)200μl反應(yīng)管，分別標(biāo)記為反應(yīng)管1~6。在反應(yīng)管1~6中分別加入35μl的PCR反應(yīng)液、3μl的PCR反應(yīng)酶系；2μl引物混合液（HCV-F1、HCV-R1、18S-F1、18S-R1引物濃度分別為0.2μmol/L），2μl探針混合液（HCV-P1、18S-P1探針濃度分別為0.06μmol/L）。在反應(yīng)管1~2中加入HCV核酸5μl ；在反應(yīng)管3中加入HBV核酸5μl；在反應(yīng)管4中加入HIV核酸5μl；在反應(yīng)管5中加入加入陽性質(zhì)控品5μl；在反應(yīng)管6中加入陰性質(zhì)控品5μl。最后，在各管再分別加入3μl啟動(dòng)液（各管的終體積為50μl）。

選擇熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：37℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光。結(jié)果如圖4。

實(shí)施例5（HCV重復(fù)性實(shí)驗(yàn)）：

按實(shí)施例1配制體系10管，分別標(biāo)記反應(yīng)管1~10。在反應(yīng)管1~8加入HCV核酸5μl，在反應(yīng)管7~8中加入陽性質(zhì)控品5μl，在反應(yīng)管9~10中加入陰性質(zhì)控品5μl。最后，在各管再分別加入5μl啟動(dòng)液（各管的終體積為50μl）。

選擇熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增及收集熒光，具體上機(jī)條件為：37℃，30s，30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)都搜集熒光，結(jié)果如圖5。

結(jié)論：

1.從圖1的結(jié)果可以看出，對(duì)應(yīng)的病原體樣本擴(kuò)增結(jié)果都有“S”型擴(kuò)增曲線，說明本發(fā)明試劑盒的恒溫?cái)U(kuò)增效果好。

2.從圖2、3的結(jié)果可以看出，即使不是在最適溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，仍然得到穩(wěn)定的陽性結(jié)果，說明本發(fā)明試劑盒的容錯(cuò)率高、穩(wěn)定性強(qiáng)。

3.從圖4的結(jié)果可以看出，用本發(fā)明試劑盒檢測HCV核酸特異性好，具有很強(qiáng)的專一性，檢測結(jié)果無誤，說明本試劑盒的特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)。

4.從圖5的結(jié)果可以看出，用本發(fā)明試劑盒特異性高，只有HCV核酸的樣本是“S”型擴(kuò)增曲線。

綜上，本發(fā)明試劑盒的擴(kuò)增效果好，特異性強(qiáng)，容錯(cuò)率高，穩(wěn)定性強(qiáng)、用時(shí)短。

以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效試劑變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司

<120> 一種丙型肝炎病毒（HCV）恒溫檢測試劑盒

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cctactaccg cggtcttgac gtgtctgtca tc 32

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagtctatca ccgagtcgaa atcgccggta aagcc 35

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggccagtgc gatgttgtcg tagtggcaac 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgatcgcac gccccccgtg gcggcgacga cc 32

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cccgtcaccc gtggtcacca tggtaggcac 30

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgaacgtctg ccctatcaac tttcgatggt agtc 34