本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種聯(lián)產(chǎn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的系統(tǒng)和方法。

背景技術(shù)：

產(chǎn)酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)是厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的主要菌種之一，但在發(fā)酵過程中，丙酸的不斷積累會對菌體細胞生長及丙酸自身代謝產(chǎn)生反饋抑制作用，進而降低了發(fā)酵效率。比如，當發(fā)酵液中丙酸濃度大于10g/L時，菌體的生長速度開始減慢，當丙酸濃度達到35g/L時，菌體的生長速度急劇下降。為了解除丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用，研究人員對生產(chǎn)菌株進行了基因改造(Biotechnology and Bioengineering,2009,104:766-773；Metabolic Engineering,2015,27:46-56)，研究了丙酸的反饋抑制機理(Journal of Biotechnology,2013,167:56-63)，并采取適當?shù)恼{(diào)控策略(Bioresource Technology,2012,105:128-133；Bioresource Technology,2013,135:504-512)來提高批次發(fā)酵過程中丙酸的產(chǎn)量。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中采用過程工程手段及時移除丙酸，可有效減緩或消除其對發(fā)酵的反饋調(diào)節(jié)作用，提高發(fā)酵效率。Goswami構(gòu)建了一種原位細胞截留反應(yīng)器，通過不銹鋼旋轉(zhuǎn)過濾器將菌體細胞截留，使含高濃度丙酸的發(fā)酵清液濾過，從而實現(xiàn)了菌體細胞與丙酸的分離(Applied Microbiology and Biotechnology,2001,56:676-680)。南京工業(yè)大學(xué)歐陽平凱院士構(gòu)建了一種多孔纖維床反應(yīng)器將發(fā)酵過程中產(chǎn)生的丙酸及時分離出來，提高了發(fā)酵產(chǎn)率(Journal of Biotechnology,2012,164:202-210)。浙江大學(xué)徐志南教授通過將菌體細胞固定化在纖維床反應(yīng)器上，采用流加葡萄糖的方式，提高了發(fā)酵效率(Bioresource Technology,2012,112:248-253)。中科院過程所王云山研究員將擴張床層析技術(shù)與發(fā)酵過程耦合起來，建立了一種以擴張床原位吸附為特征的新型發(fā)酵過程，提高了丙酸產(chǎn)量(Bioresource Technology,2012,104:652-659)。但是，在工業(yè)生產(chǎn)過程中，擴張床填充效率低，上述工藝普遍面臨著難以放大、成本高等問題。

此外，發(fā)酵液中除丙酸之外，還含有大量的丁二酸、乳酸、乙酸等，限制了丙酸的純度。CN103667373A公開了一種微生物發(fā)酵產(chǎn)丙酸及其鹽聯(lián)產(chǎn)丁二酸及其鹽的方法，利用碳酸鹽以中和丙酸，降低丙酸對細胞生長的抑制作用，產(chǎn)生的二氧化碳用于合成丁二酸，主要提高了丁二酸的產(chǎn)出，但該工藝沒有將發(fā)酵液中的丁二酸和丙酸有效分離開來，產(chǎn)品主要是丁二酸鈣和丙酸鈣的混合物。

因此，迫切需要開發(fā)一種能有效提高丙酸純度同時易于工業(yè)化的聯(lián)產(chǎn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，為實現(xiàn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的聯(lián)產(chǎn)，提高發(fā)酵效率和產(chǎn)物純度，以及降低工業(yè)化難度和成本，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種聯(lián)產(chǎn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括依次連接的發(fā)酵單元、膜分離單元、酸化單元、第一層析單元和第二層析單元；

所述膜分離單元與所述發(fā)酵單元之間設(shè)有第一回路；

所述第二層析單元與所述發(fā)酵單元之間設(shè)有第二回路。

菌體細胞在發(fā)酵單元中發(fā)酵，產(chǎn)生丙酸和丁二酸，含有菌體細胞、營養(yǎng)物質(zhì)和丙酸、丁二酸的發(fā)酵液通過膜分離單元，分離得到的菌體細胞通過第一回路回流至所述發(fā)酵單元，分離得到的發(fā)酵清液進入酸化單元進行酸化后得到的酸化發(fā)酵清液進入第一層析單元，第一層析單元吸附酸性較強的丁二酸，透過液進入第二層析單元，第二層析單元吸附丙酸，透過液中含有營養(yǎng)物質(zhì)，通過第二回路回流至發(fā)酵單元繼續(xù)進行發(fā)酵。

本發(fā)明所述發(fā)酵單元優(yōu)選包括發(fā)酵罐。

優(yōu)選地，所述膜分離單元中過濾膜的材料包括聚醚砜。

優(yōu)選地，所述膜分離單元中過濾膜的孔徑為0.1～0.22μm，例如0.1μm或0.22μm等，優(yōu)選0.22μm。

優(yōu)選地，所述膜分離單元中過濾膜的單位面積通量為20～30L/(h·m²)，例如20L/(h·m²)、21L/(h·m²)、22L/(h·m²)、23L/(h·m²)、24L/(h·m²)、25L/(h·m²)、26L/(h·m²)、27L/(h·m²)、28L/(h·m²)、29L/(h·m²)或30L/(h·m²)等。

優(yōu)選地，所述膜分離單元中過濾膜的過濾面積大于等于0.12m²，例如0.12m²、0.2m²、0.5m²、1m²、2.5m²、5m²或10m²等，優(yōu)選0.12m²～0.50m²。

優(yōu)選地，所述酸化單元中填充有陽離子交換樹脂。

優(yōu)選地，所述酸化單元中填充有H型陽離子交換樹脂。

優(yōu)選地，所述酸化單元中所述陽離子交換樹脂的體積填充系數(shù)為0.7～0.8，例如0.7、0.71、0.73、0.75、0.78或0.8等。

優(yōu)選地，所述酸化單元與所述發(fā)酵單元的體積比為1:(2～4)，例如1:2、1:2.2、1:2.5、1:2.8、1:3、1:3.2、1:3.5、1:3.8或1:4等，優(yōu)選1:(3～4)。

優(yōu)選地，所述第一層析單元填充有陰離子交換樹脂，優(yōu)選ZGD630陰離子交換樹脂。

優(yōu)選地，所述第一層析單元中陰離子交換樹脂的體積填充系數(shù)為0.7～0.8，例如0.7、0.71、0.73、0.75、0.78或0.8等。

優(yōu)選地，所述第一層析單元與所述發(fā)酵單元的體積比為1:(6～10)，例如1:6、1:6.2、1:6.5、1:6.8、1:7、1:7.2、1:7.5、1:7.8或1:8等，優(yōu)選1:(8～10)。

優(yōu)選地，所述第二層析單元填充有陰離子交換樹脂，優(yōu)選ZGD630陰離子交換樹脂。

優(yōu)選地，所述第二層析單元中陰離子交換樹脂的體積填充系數(shù)為0.7～0.8，例如0.7、0.71、0.73、0.75、0.78或0.8等。

優(yōu)選地，所述第二層析單元與所述發(fā)酵單元的體積比為1:(6～10)，例如1:6、1:6.2、1:6.5、1:6.8、1:7、1:7.2、1:7.5、1:7.8或1:8等，優(yōu)選1:(8～10)。

第二方面，一種利用如目的之一所述的系統(tǒng)聯(lián)產(chǎn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的方法，包括如下步驟：

(1)菌種發(fā)酵：將產(chǎn)酸丙酸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)接在所述發(fā)酵罐中發(fā)酵；

(2)膜分離：將發(fā)酵液引入所述膜分離單元中，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟(1)所述發(fā)酵液；

(3)發(fā)酵液的酸化：將步驟(2)所得發(fā)酵清液在所述酸化單元中酸化至pH小于等于3.0，例如3.0、2.5、2.0、1.5或1.2等，得到酸化發(fā)酵清液；

(4)丁二酸的吸附：將步驟(3)所得酸化發(fā)酵清液上樣至所述第一層析單元，吸附丁二酸至飽和狀態(tài)，同時得到第一透過液；

(5)丙酸的吸附：步驟(4)所得第一透過液上樣至所述第二層析單元，吸附丙酸，得到第二透過液；所述第二透過液返回步驟(1)所述發(fā)酵液中；

(6)丙酸及其鹽、丁二酸及其鹽的收集：用堿液對所述第一層析單元進行洗脫得到丁二酸鹽，或，用酸液對所述第一層析單元進行洗脫得到丁二酸；

用堿液所述第二層析單元進行洗脫得到丙酸鹽，或，用酸液對所述第二層析單元進行洗脫得到丙酸。

本發(fā)明步驟(1)所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：葡萄糖50～60g/L，例如50g/L、52g/L、55g/L、58g/L或60g/L等，玉米漿41～51g/L，例如41g/L、43g/L、45g/L、48g/L或51g/L等，磷酸二氫鉀3.2～4.6g/L，例如3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、4g/L、4.3g/L或4.6g/L等。

優(yōu)選地，步驟(1)所述培養(yǎng)產(chǎn)酸丙酸桿菌的溫度為28～37℃，例如28℃、28.2℃、28.5℃、28.8℃、29℃、29.3℃、29.6℃、29.9℃、30℃、30.2℃、30.5℃、30.8℃、31℃、31.2℃、31.5℃、31.8℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等，優(yōu)選30～32℃。

優(yōu)選地，步驟(1)所述培養(yǎng)產(chǎn)酸丙酸桿菌的時間為36～54h，例如36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、52h或54h等，優(yōu)選44～50h。

優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵液的填充系數(shù)為50～80％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％等，優(yōu)選65～75％，填充系數(shù)為50～80％使得發(fā)酵罐體積既可充分利用，又不至于在發(fā)酵過程中發(fā)生跑料的情況。

優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵液的溫度為28～37℃，例如28℃、28.2℃、28.5℃、28.8℃、29℃、29.3℃、29.6℃、29.9℃、30℃、30.2℃、30.5℃、30.8℃、31℃、31.2℃、31.5℃、31.8℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等，優(yōu)選30～32℃。

優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵的時間為78～96h，例如78h、79h、80h、81h、82h、82.5h、82.8h、83h、83.2h、83.5h、83.8h、84h、84.2h、84.5h、84.8h、85h、85.2h、85.5h、85.8h、86h、87h、88h、89h、90h、92h、94h或96h等，優(yōu)選82～86h。

優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵液的pH為6.8～7.2，例如6.8、6.9、7.0、7.1或7.2等，使菌體細胞在中性環(huán)境下保持良好的生長狀態(tài)。

優(yōu)選地，步驟(1)所述維持發(fā)酵液pH的方法包括：加入氨水、NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃中的任意一種或至少兩種的組合，其中典型但非限制性的組合為：氨水和NaOH的組合、Na₂CO₃和NaHCO₃的組合、氨水和Na₂CO₃的組合、NaOH和Na₂CO₃的組合。

優(yōu)選地，步驟(1)所述菌種發(fā)酵時，進行攪拌。

優(yōu)選地，所述攪拌的速率為50～200r/min，例如50r/min、55r/min、60r/min、65r/min、70r/min、75r/min、80r/min、85r/min、90r/min、95r/min、100r/min、110r/min、120r/min、150r/min、180r/min或200r/min等，優(yōu)選50～100r/min。

優(yōu)選地，步驟(1)所述發(fā)酵期間供給營養(yǎng)物質(zhì)。

優(yōu)選地，步驟(1)所述營養(yǎng)物質(zhì)包括葡萄糖、玉米漿、酵母浸膏或蛋白胨中的任意一種或至少兩種的組合，其中典型但非限制性的組合為：葡萄糖和玉米漿的組合、酵母浸膏和蛋白胨的組合、葡萄糖和蛋白胨的組合、葡萄糖和酵母浸膏的組合。

優(yōu)選地，所述供給葡萄糖的方式包括：加入20～50wt％的葡萄糖溶液，例如20wt％、21wt％、22wt％、25wt％、28wt％、30wt％、32wt％、35wt％、38wt％、40wt％、42wt％、45wt％、48wt％或50wt％的葡萄糖溶液等，優(yōu)選45～50wt％的葡萄糖溶液。

優(yōu)選地，步驟(1)所述營養(yǎng)物質(zhì)的供給方式包括流加。

優(yōu)選地，步驟(1)所述營養(yǎng)物質(zhì)的供給量為能夠保證所述發(fā)酵液中碳當量大于等于4g/L的供給量，例如，所述營養(yǎng)物質(zhì)的碳當量為4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、14g/L、15g/L、18g/L或20g/L等，所述碳當量優(yōu)選4～8g/L。碳當量小于4g/L或者大于8g/L都會影響菌體生長，進而影響發(fā)酵效率，前者會導(dǎo)致碳源缺乏，后者則會產(chǎn)生葡萄糖效應(yīng)。

本發(fā)明步驟(2)所述引入膜分離單元的發(fā)酵液中丙酸濃度大于等于35g/L，例如35g/L、35.5g/L、36g/L、36.5g/L、37g/L、38g/L、39g/L或40g/L等。

優(yōu)選地，步驟(2)之前還包括：將所述膜分離單元進行清洗。

優(yōu)選地，所述清洗包括：用0.5～1wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離單元中清洗40～60min，例如40min、42min、45min、48min、50min、52min、55min、58min或60min等。例如，亞硫酸氫鈉溶液的濃度為0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％或1wt％等。

優(yōu)選地，步驟(2)所述膜分離過程中的壓力為0～1.5MPa，例如0MPa、0.1MPa、0.2MPa、0.3MPa、0.4MPa、0.5MPa、0.6MPa、0.8MPa、1MPa、1.2MPa或1.5MPa等，優(yōu)選0～0.5MPa。

優(yōu)選地，步驟(2)所述膜分離過程中所述發(fā)酵液的流量為5～20L/min，例如5L/min、6L/min、7L/min、8L/min、9L/min、10L/min、12L/min、15L/min、18L/min或20L/min等，優(yōu)選5～10L/min。

隨著發(fā)酵清液不斷從膜分離單元中滲出，原有的發(fā)酵液逐步得到濃縮，實現(xiàn)了菌體細胞的在線分離，解除了丙酸對發(fā)酵的抑制作用，且發(fā)酵濾液可直接上樣至后續(xù)的酸化單元和層析分離單元。

本發(fā)明步驟(3)所述酸化具體包括：將步驟(2)所得發(fā)酵清液上樣至酸化單元中進行陽離子交換。

優(yōu)選地，步驟(3)所述上樣速度為1～3BV/h，例如1BV/h、1.2BV/h、1.5BV/h、1.8BV/h、2BV/h、2.1BV/h、2.2BV/h、2.3BV/h、2.4BV/h、2.5BV/h、2.6BV/h、2.7BV/h、2.8BV/h、2.9BV/h或3BV/h等，優(yōu)選2～3BV/h。

優(yōu)選地，步驟(3)所述上樣體積小于等于3BV，例如1BV、1.2BV、1.5BV、1.8BV、2BV、2.1BV、2.2BV、2.3BV、2.4BV、2.5BV、2.6BV、2.7BV、2.8BV、2.9BV或3BV等，優(yōu)選2～3BV。

料液與樹脂之間的交換需要一定的時間，當上樣速度大于3BV/h時，會導(dǎo)致料液在層析單元中的停留時間太短，交換不完全；反之，當上樣速度低于2BV/h時，盡管交換完全，但會延長操作時間，因此，上樣速度優(yōu)選2～3BV/h。

同樣地，當上樣體積小于2BV時，樹脂的酸化能力不足以完全體現(xiàn)，當上樣體積大于3BV時，又達不到預(yù)期的酸化效果，因此，上樣體積為2～3BV。

本發(fā)明所述步驟(3)之后，優(yōu)選還包括：

步驟(3’)：對所述酸化單元經(jīng)再生處理后循環(huán)使用。

優(yōu)選地，步驟(3’)具體為：將酸液上樣至所述酸化單元，進行再生處理。

優(yōu)選地，步驟(3’)所述再生處理用的酸液包括HCl溶液，優(yōu)選濃度為1～3mol/L的HCl溶液，例如1mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L、1.8mol/L、2mol/L、2.5mol/L或3mol/L的HCl溶液，進一步優(yōu)選濃度為1～2mol/L的HCl溶液。

優(yōu)選地，步驟(3’)所述再生處理的上樣速率為1～3BV/h，例如1BV/h、1.2BV/h、1.5BV/h、1.8BV/h、2BV/h、2.1BV/h、2.2BV/h、2.3BV/h、2.4BV/h、2.5BV/h、2.6BV/h、2.7BV/h、2.8BV/h、2.9BV/h或3BV/h等，優(yōu)選2～3BV/h。

本發(fā)明步驟(4)所述上樣速度為1～3BV/h，例如1BV/h、1.2BV/h、1.5BV/h、1.8BV/h、2BV/h、2.1BV/h、2.2BV/h、2.3BV/h、2.4BV/h、2.5BV/h、2.6BV/h、2.7BV/h、2.8BV/h、2.9BV/h或3BV/h等，優(yōu)選2～3BV/h。

優(yōu)選地，步驟(4)所述上樣體積大于等于6.5BV，例如6.5BV、7BV、8BV、9BV、10BV、12BV或15BV等，優(yōu)選10～12BV。

當上樣速度大于3BV/h時，會導(dǎo)致料液與樹脂交換不完全；反之，當上樣速度低于2BV/h時，盡管交換完全，但會延長操作時間。第一層析單元的透過液可分為3種情況，當上樣體積小于6.5BV時，丁二酸不穿透且樹脂對丁二酸根的吸附達不到飽和，有丙酸被吸附；當上樣體積為6.5～10BV時，丁二酸部分穿透，但樹脂對丁二酸根的吸附還未達到飽和；當上樣體積為10BV～12BV時，樹脂對丁二酸的吸附達到飽和，此時第一穿透液中含有丁二酸的部分另行收集，在第一層析單元再生后重新上樣至第一層析單元，進行丁二酸的吸附后才能進入第二層析單元，當上樣體積大于12BV后，樹脂對丁二酸的吸附量不再增加，并且還會增加丁二酸重復(fù)吸收的繁瑣工序。

本發(fā)明步驟(5)所述上樣速度為1～3BV/h，例如1BV/h、1.2BV/h、1.5BV/h、1.8BV/h、2BV/h、2.1BV/h、2.2BV/h、2.3BV/h、2.4BV/h、2.5BV/h、2.6BV/h、2.7BV/h、2.8BV/h、2.9BV/h或3BV/h等，優(yōu)選2～3BV/h。

優(yōu)選地，步驟(5)所述上樣體積小于等于3BV，例如1BV、1.2BV、1.5BV、1.8BV、2BV、2.1BV、2.2BV、2.3BV、2.4BV、2.5BV、2.6BV、2.7BV、2.8BV、2.9BV或3BV等，優(yōu)選2～3BV。

優(yōu)選地，步驟(5)中，當所述第二透過液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附。此時，發(fā)酵單元中丙酸對發(fā)酵的反饋抑制作用明顯減弱，即解除了丙酸對發(fā)酵的抑制作用。

當上樣速度大于3BV/h時，會導(dǎo)致料液與樹脂交換不完全；反之，當上樣速度低于2BV/h時，盡管交換完全，但會延長操作時間。當上樣體積大于3BV時，丙酸開始穿柱，為提高丙酸的收率，上樣體積優(yōu)選2～3BV。

本發(fā)明步驟(6)所述堿液包括NaOH溶液，優(yōu)選濃度為1～4mol/L的NaOH溶液，例如濃度為1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L或4mol/L的NaOH溶液，等進一步優(yōu)選濃度為2.5～3mol/L的NaOH溶液。

優(yōu)選地，步驟(6)所述堿液洗脫的速率為0.3～0.6BV/h，例如0.3BV/h、0.35BV/h、0.4BV/h、0.45BV/h、0.5BV/h、0.55BV/h或0.6BV/h等，優(yōu)選0.4～0.5BV/h。

優(yōu)選地，步驟(6)所述酸液包括H₂SO₄溶液，優(yōu)選濃度為1～4mol/L的H₂SO₄溶液，例如濃度為1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、3.6mol/L、3.7mol/L、3.8mol/L、3.9mol/L或4mol/L的H₂SO₄溶液，進一步優(yōu)選濃度為3.5～4mol/L的H₂SO₄溶液。

優(yōu)選地，步驟(6)所述酸液洗脫的速率為0.3～0.8BV/h，例如0.3BV/h、0.4BV/h、0.5BV/h、0.55BV/h、0.6BV/h、0.65BV/h、0.70BV/h、0.75BV/h或0.8BV/h等，優(yōu)選0.5～0.8BV/h。

優(yōu)選地，所述步驟(6)之后還包括：

步驟(6’)：對所述第一層析單元和/或所述第二層析單元經(jīng)再生處理后循環(huán)使用。

優(yōu)選地，步驟(6’)具體包括：將堿液上樣至所述第一層析單元和/或第二層析單元，進行再生處理。

優(yōu)選地，步驟(6’)所述再生處理用的堿液包括NaOH溶液，優(yōu)選濃度為1～4mol/L的NaOH溶液，例如濃度為1mol/L、1.5mol/L、2mol/L、2.5mol/L、3mol/L、3.5mol/L、3.6mol/L、3.7mol/L、3.8mol/L、3.9mol/L或4mol/L的NaOH溶液，進一步優(yōu)選濃度為1～2mol/L的NaOH溶液。

優(yōu)選地，步驟(6’)所述再生處理的上樣速率為1～3BV/h，例如1BV/h、1.2BV/h、1.5BV/h、1.8BV/h、2BV/h、2.1BV/h、2.2BV/h、2.3BV/h、2.4BV/h、2.5BV/h、2.6BV/h、2.7BV/h、2.8BV/h、2.9BV/h或3BV/h等，優(yōu)選2～3BV/h。

作為本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案，一種聯(lián)產(chǎn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的方法，包括如下步驟：

(1)菌種發(fā)酵：將產(chǎn)酸丙酸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中28～37℃培養(yǎng)36～54h，所述培養(yǎng)基包括：葡萄糖50～60g/L，玉米漿41～51g/L，磷酸二氫鉀3.2～4.6g/L；之后轉(zhuǎn)接在所述發(fā)酵罐中，于28～37℃下以50～200r/min的速率攪拌發(fā)酵78～96h，發(fā)酵期間流加碳當量大于等于4g/L的營養(yǎng)物質(zhì)并加入氨水、NaOH、Na₂CO₃或NaHCO₃中的任意一種或至少兩種的組合維持發(fā)酵液的pH在6.8～7.2之間。

(2)膜分離：用0.5～1wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離單元中清洗40～60min以清洗膜分離單元，當步驟(1)所述發(fā)酵液中的丙酸濃度大于等于35g/L時，將發(fā)酵液按照流量為5～20L/min引入膜分離單元中，壓力為0～1.5Mpa，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟(1)所述發(fā)酵液；

(3)發(fā)酵液的酸化：將步驟(2)所得發(fā)酵清液按照速度為1～3BV/h上樣至酸化單元中進行陽離子交換，上樣體積小于等于3BV，至pH小于等于3.0，得到酸化發(fā)酵清液；

(3’)將酸液上樣至所述酸化單元，進行再生處理；

(4)丁二酸的吸附：將步驟(3)所得酸化發(fā)酵清液按照速度為1～3BV/h上樣至第一層析單元，上樣體積大于等于6.5BV，吸附丁二酸至飽和狀態(tài)，同時得到第一透過液；

(5)丙酸的吸附：步驟(4)所得第一透過液按照速度為1～3BV/h上樣至第二層析單元，上樣體積小于等于3BV，吸附丙酸，當所述第二透過液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附，得到第二透過液；所述第二透過液返回步驟(1)所述發(fā)酵液中；

(6)丙酸(鹽)和丁二酸(鹽)的收集：用堿液對所述第一層析單元按照速率為0.3～0.6BV/h進行洗脫得到丁二酸鹽，或，用酸液對所述第一層析單元按照速率為0.3～0.6BV/h進行洗脫得到丁二酸；

用堿液所述第二層析單元按照速率為0.3～0.6BV/h進行洗脫得到丙酸鹽，或，用酸液對所述第二層析單元按照速率為0.3～0.6BV/h進行洗脫得到丙酸。

(6’)將堿液上樣至所述第一層析單元和/或第二層析單元，進行再生處理。

與現(xiàn)有技術(shù)方案相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明通過發(fā)酵技術(shù)、膜分離技術(shù)和層析技術(shù)集成，實現(xiàn)了丙酸和丁二酸的聯(lián)產(chǎn)，提高了發(fā)酵效率和底物轉(zhuǎn)化率，其中丙酸的產(chǎn)率在70.34g/L以上，生產(chǎn)效率在0.440g/(L·h)以上；丁二酸的產(chǎn)率在23.5g/L以上，生產(chǎn)效率在0.147g/(L·h)以上；

(2)本發(fā)明的工藝屬于半連續(xù)發(fā)酵工藝，與傳統(tǒng)批次發(fā)酵工藝相比，本發(fā)明的工藝實現(xiàn)了發(fā)酵產(chǎn)物和菌體的在線分離，不僅有效解決了丙酸對發(fā)酵的反饋作用，還克服了擴張床填充效率低、難以放大生產(chǎn)的缺陷；

(3)本發(fā)明的工藝方法實現(xiàn)了發(fā)酵廢液的二次利用，有效較少了發(fā)酵廢水的排放。

附圖說明

圖1是實施例所用生產(chǎn)裝置的正視圖；

附圖標記說明

11：發(fā)酵罐；12：營養(yǎng)物質(zhì)入口；13：攪拌器；21：膜分離器；31：酸化柱；41：第一層析柱；51：第二層析柱。

具體實施方式

為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實施例如下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

實施例1

一種聯(lián)產(chǎn)丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的系統(tǒng)，如圖1所示，包括依次連接的發(fā)酵罐11、膜分離器21、酸化柱31、第一層析柱41以及第二層析柱51，其中發(fā)酵罐11設(shè)置有營養(yǎng)物質(zhì)入口12和攪拌器13。

一種采用如圖1所示系統(tǒng)聯(lián)產(chǎn)丙酸鈉和丁二酸鈉的方法，包括如下幾步：

1)菌種發(fā)酵：將甘油管或斜面保存的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中28℃下培養(yǎng)36h，培養(yǎng)基包括：葡萄糖60g/L，玉米漿41g/L，磷酸二氫鉀4.6g/L；然后轉(zhuǎn)接于5L發(fā)酵罐11中，于28℃下以50r/min的速率攪拌發(fā)酵96h，發(fā)酵液的填充系數(shù)為50％，發(fā)酵期間流加碳當量等于10g/L的玉米漿并加入氨水維持發(fā)酵液的pH在6.8～7.2之間，定期取樣測定菌體的OD600值和發(fā)酵液中丁二酸、丙酸濃度；

2)膜分離：用0.5wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離器21中循環(huán)40min將膜分離器21各管道清洗干凈，裝入孔徑為0.1μm、過濾面積等于0.12m²的卷式膜膜芯。當步驟1)發(fā)酵液中的丙酸濃度達35g/L時，將發(fā)酵罐11與膜分離21連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為0Mpa，流量為5L/min，發(fā)酵液進入膜分離器21中進行循環(huán)，此時，膜芯的單位面積通量為20L/(h·m²)，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟1)所述發(fā)酵液；

3)發(fā)酵液的酸化：將H型陽離子交換樹脂1.5L裝填于酸化柱31內(nèi)，將步驟2)所得發(fā)酵清液按照速度為1BV/h上樣至酸化柱31進行陽離子交換，上樣體積為3BV，至pH小于等于3.0，收集穿柱液，為酸化發(fā)酵清液；

3’)將濃度為1mol/L的HCl溶液按照速率為1BV/h上樣至酸化柱31，進行再生處理；

4)丁二酸的吸附：將0.6L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第一層析柱41內(nèi)，將步驟3)所得酸化發(fā)酵清液按照速度為1BV/h上樣至第一層析柱41，上樣體積等于6.5BV，吸附丁二酸，同時得到第一透過液；

5)丙酸的吸附：將0.8L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第二層析柱51內(nèi)，步驟4)所得第一透過液按照速度為1BV/h上樣至第二層析柱51，上樣體積等于3BV，吸附丙酸，當?shù)诙高^液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附，得到第二透過液；第二透過液返回步驟1)發(fā)酵液中；

6)丙酸鈉和丁二酸鈉的收集：用1mol/L的NaOH溶液分別對第一層析柱41和第二層析柱51按照速率為0.3BV/h進行洗脫分別得到丁二酸鈉和丙酸鈉。

實施例2

一種聯(lián)產(chǎn)丙酸(鹽)和丁二酸(鹽)的方法，包括如下幾步：

1)菌種發(fā)酵：將甘油管或斜面保存的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)54h，培養(yǎng)基包括：葡萄糖60g/L，玉米漿41g/L，磷酸二氫鉀4.6g/L；然后轉(zhuǎn)接于20L發(fā)酵罐中，于37℃下以200r/min的速率攪拌發(fā)酵78h，發(fā)酵液的填充系數(shù)為80％，發(fā)酵期間流加碳當量等于3.5g/L的蛋白胨并加入碳酸鈉維持發(fā)酵液的pH在6.8～7.2之間，定期取樣測定菌體的OD600值和發(fā)酵液中丁二酸、丙酸濃度；

2)膜分離：用1wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離器中循環(huán)60min將膜分離器各管道清洗干凈，裝入孔徑為0.22μm、過濾面積等于0.12m²的卷式膜膜芯。當步驟1)發(fā)酵液中的丙酸濃度達35g/L時，將發(fā)酵罐與膜分離連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為1.5Mpa，流量為20L/min，發(fā)酵液進入膜分離器中進行循環(huán)，此時，膜芯的單位面積通量為30L/(h·m²)，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟1)所述發(fā)酵液；

3)發(fā)酵液的酸化：將H型陽離子交換樹脂2L裝填于酸化柱內(nèi)，將步驟2)所得發(fā)酵清液按照速度為3BV/h上樣至酸化柱進行陽離子交換，上樣體積為1.0BV，至pH小于等于3.0，收集穿柱液，為酸化發(fā)酵清液；

3’)將濃度為1mol/L的HCl溶液按照速率為3BV/h上樣至酸化柱，進行再生處理；

4)丁二酸的吸附：將0.8L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第一層析柱內(nèi)，將步驟3)所得酸化發(fā)酵清液按照速度為3BV/h上樣至第一層析柱，上樣體積等于8BV，吸附丁二酸至飽和狀態(tài)，同時得到第一透過液；

5)丙酸的吸附：將1.0L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第二層析柱內(nèi)，步驟4)所得第一透過液按照速度為3BV/h上樣至第二層析柱，上樣體積等于1.5BV，吸附丙酸，當?shù)诙高^液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附，得到第二透過液；第二透過液返回步驟1)發(fā)酵液中；

6)丙酸鈉和丁二酸鈉的收集：用4mol/L的NaOH溶液分別對第一層析柱和第二層析柱按照速率為0.8BV/h進行洗脫分別得到丁二酸鈉和丙酸鈉；

6’)將1mol/L的NaOH溶液按照速率為3BV/h上樣至第一層析柱和第二層析柱進行再生處理。

實施例3

一種聯(lián)產(chǎn)丙酸和丁二酸鈉的方法，包括如下幾步：

1)菌種發(fā)酵：將甘油管或斜面保存的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)44h，培養(yǎng)基包括：葡萄糖60g/L，玉米漿41g/L，磷酸二氫鉀4.6g/L；然后轉(zhuǎn)接于7L發(fā)酵罐中，于30℃下以50r/min的速率攪拌發(fā)酵86h，發(fā)酵液的填充系數(shù)為70％，發(fā)酵期間流加碳當量等于4g/L的20wt％葡萄糖溶液并加入NaHCO₃維持發(fā)酵液的pH在6.8～7.2之間，定期取樣測定菌體的OD600值和發(fā)酵液中丁二酸、丙酸濃度；

2)膜分離：用0.8wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離器中循環(huán)55min將膜分離器各管道清洗干凈，裝入孔徑為0.22μm、過濾面積等于0.12m²的卷式膜膜芯。當步驟1)發(fā)酵液中的丙酸濃度達35g/L時，將發(fā)酵罐與膜分離連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為0.5Mpa，流量為10L/min，發(fā)酵液進入膜分離器中進行循環(huán)，此時，膜芯的單位面積通量為28L/(h·m²)，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟1)所述發(fā)酵液；

3)發(fā)酵液的酸化：將H型陽離子交換樹脂1.6L裝填于酸化柱內(nèi)，將步驟2)所得發(fā)酵清液按照速度為2BV/h上樣至酸化柱進行陽離子交換，上樣體積為2BV，至pH小于等于3.0，收集穿柱液，為酸化發(fā)酵清液；

3’)將濃度為1mol/L的HCl溶液按照速率為3BV/h上樣至酸化柱，進行再生處理；

4)丁二酸的吸附：將0.7L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第一層析柱內(nèi)，將步驟3)所得酸化發(fā)酵清液按照速度為2BV/h上樣至第一層析柱，上樣體積等于10BV，吸附丁二酸至飽和狀態(tài)，同時得到第一透過液；

5)丙酸的吸附：將0.9L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第二層析柱內(nèi)，步驟4)所得第一透過液按照速度為2BV/h上樣至第二層析柱，上樣體積等于2BV，吸附丙酸，當?shù)诙高^液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附，得到第二透過液；第二透過液返回步驟1)發(fā)酵液中；

6)丙酸和丁二酸鈉的收集：用2.5mol/L的NaOH溶液對第一層析柱按照速率為0.4BV/h進行洗脫得到丁二酸鈉；用3.5mol/L的H₂SO₄溶液對第二層析柱進行洗脫得丙酸；

6’)將1mol/L的NaOH溶液按照速率為2BV/h上樣至第一層析柱和第二層析柱進行再生處理。

實施例4

一種聯(lián)產(chǎn)丙酸和丁二酸鈉的方法，包括如下幾步：

1)菌種發(fā)酵：將甘油管或斜面保存的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中32℃下培養(yǎng)50h，培養(yǎng)基包括：葡萄糖60g/L，玉米漿41g/L，磷酸二氫鉀4.6g/L；然后轉(zhuǎn)接于10L發(fā)酵罐中，于32℃下以100r/min的速率攪拌發(fā)酵82h，發(fā)酵液的填充系數(shù)為60％，發(fā)酵期間流加碳當量等于8g/L的50wt％葡萄糖溶液并加入氨水維持發(fā)酵液的pH在6.8～7.2之間，定期取樣測定菌體的OD600值和發(fā)酵液中丁二酸、丙酸濃度；

2)膜分離：用0.6wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離器中循環(huán)45min將膜分離器各管道清洗干凈，裝入孔徑為0.22μm、過濾面積等于0.12m²的卷式膜膜芯。當步驟1)發(fā)酵液中的丙酸濃度達35g/L時，將發(fā)酵罐與膜分離連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為0.5Mpa，流量為10L/min，發(fā)酵液進入膜分離器中進行循環(huán)，此時，膜芯的單位面積通量為22L/(h·m²)，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟1)所述發(fā)酵液；

3)發(fā)酵液的酸化：將H型陽離子交換樹脂1.8L裝填于酸化柱內(nèi)，將步驟2)所得發(fā)酵清液按照速度為3BV/h上樣至酸化柱進行陽離子交換，上樣體積為3BV，至pH小于等于3.0，收集穿柱液，為酸化發(fā)酵清液；

3’)將濃度為2mol/L的HCl溶液按照速率為1BV/h上樣至酸化柱，進行再生處理；

4)丁二酸的吸附：將0.75L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第一層析柱內(nèi)，將步驟3)所得酸化發(fā)酵清液按照速度為3BV/h上樣至第一層析柱，上樣體積等于10BV，吸附丁二酸至飽和狀態(tài)，同時得到第一透過液；

5)丙酸的吸附：將1L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第二層析柱內(nèi)，步驟4)所得第一透過液按照速度為3BV/h上樣至第二層析柱，上樣體積等于3BV，吸附丙酸，當?shù)诙高^液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附，得到第二透過液；第二透過液返回步驟1)發(fā)酵液中；

6)丙酸和丁二酸鈉的收集：用3mol/L的NaOH溶液對第一層析柱按照速率為0.5BV/h進行洗脫得到丁二酸鈉；用4mol/L的H₂SO₄溶液對第二層析柱進行洗脫得丙酸；

6’)將2mol/L的NaOH溶液按照速率為3BV/h上樣至第一層析柱和第二層析柱進行再生處理。

實施例5

一種聯(lián)產(chǎn)丙酸和丁二酸鈉的方法，包括如下幾步：

1)菌種發(fā)酵：將甘油管或斜面保存的產(chǎn)酸丙酸桿菌接種在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃下培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基包括：葡萄糖60g/L，玉米漿41g/L，磷酸二氫鉀4.6g/L；然后轉(zhuǎn)接于7L發(fā)酵罐中，于30℃下以80r/min的速率攪拌發(fā)酵84h，發(fā)酵液的填充系數(shù)為65％，發(fā)酵期間流加碳當量等于6g/L的50wt％葡萄糖溶液并加入氨水維持發(fā)酵液的pH在6.8～7.2之間，定期取樣測定菌體的OD600值和發(fā)酵液中丁二酸、丙酸濃度；

2)膜分離：用0.7wt％的亞硫酸氫鈉溶液在膜分離器中循環(huán)50min將膜分離器各管道清洗干凈，裝入孔徑為0.22μm、過濾面積等于0.12m²的卷式膜膜芯。當步驟1)發(fā)酵液中的丙酸濃度達35g/L時，將發(fā)酵罐與膜分離連接，開機運行，調(diào)節(jié)壓力為0.3Mpa，流量為8L/min，發(fā)酵液進入膜分離器中進行循環(huán)，此時，膜芯的單位面積通量為25L/(h·m²)，濾出發(fā)酵清液，菌體細胞返回步驟1)所述發(fā)酵液；

3)發(fā)酵液的酸化：將H型陽離子交換樹脂1.75L裝填于酸化柱內(nèi)，將步驟2)所得發(fā)酵清液按照速度為2.5BV/h上樣至酸化柱進行陽離子交換，上樣體積為2.5BV，至pH小于等于3.0，收集穿柱液，為酸化發(fā)酵清液；

3’)將濃度為1.5mol/L的HCl溶液按照速率為2.5BV/h上樣至酸化柱，進行再生處理；

4)丁二酸的吸附：將0.6L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第一層析柱內(nèi)，將步驟3)所得酸化發(fā)酵清液按照速度為2.5BV/h上樣至第一層析柱，上樣體積等于10BV，吸附丁二酸至飽和狀態(tài)，同時得到第一透過液；

5)丙酸的吸附：將1L陰離子交換樹脂ZGD630裝填于第二層析柱內(nèi)，步驟4)所得第二透過液按照速度為2.5BV/h上樣至第二層析柱，上樣體積等于2.5BV，吸附丙酸，當?shù)谝煌高^液中丙酸的濃度小于10g/L時，停止吸附，得到第二透過液；第二透過液返回步驟1)發(fā)酵液中；

6)丙酸和丁二酸鈉的收集：用2.8mol/L的NaOH溶液對第一層析柱按照速率為0.45BV/h進行洗脫得到丁二酸鈉；用3.8mol/L的H₂SO₄溶液對第二層析柱進行洗脫得丙酸；

6’)將1.5mol/L的NaOH溶液按照速率為2.5BV/h上樣至第一層析柱和第二層析柱進行再生處理。

對比例1

與實施例5的區(qū)別僅在于：使用南京工業(yè)大學(xué)歐陽平凱院士構(gòu)建的多孔纖維床反應(yīng)器將發(fā)酵過程中產(chǎn)生的丙酸及時分離出來(Journal of Biotechnology,2012,164:202-210)，省去步驟2)，按批次進行發(fā)酵后對發(fā)酵液進行分離，分別提取丙酸和丁二酸。

對比例2

與實施例5的區(qū)別僅在于：使用中科院過程所王云山研究員在Bioresource Technology,2012,104:652-659提出的擴張床原位吸附代替，省去步驟2)，按批次進行發(fā)酵后對發(fā)酵液進行分離，分別提取丙酸和丁二酸。

需要說明的是，本發(fā)明實施例1～5的工藝描述的僅是連續(xù)發(fā)酵的單個周期，一個周期結(jié)束后，收集到的移除丙酸后的穿柱液返回發(fā)酵罐中，并補加營養(yǎng)物質(zhì)，以膜分離得到的濃縮液為種子液繼續(xù)進行步驟1)的發(fā)酵，再按照上述步驟2)～6)的操作繼續(xù)進行菌體細胞在線分離、發(fā)酵清液酸化、丁二酸吸附以及丙酸吸附等操作。每個周期僅需160h。為了方便比較，將實施例1～5生產(chǎn)時間為160h時的產(chǎn)率和生產(chǎn)效率與對比例整理于表1。其中丁二酸鈉折合成等摩爾的丁二酸進行計量，丙酸鈉折合成等摩爾的丙酸進行計量。

表1

從表1可以看出，實施例5中丙酸、丁二酸的產(chǎn)率較對比例1或2而言分別提高了56.61％、36.2％，實施例5中丙酸、丁二酸的生產(chǎn)效率較對比例1或2而言分別提高了56.3％、35.7％?？梢姡景l(fā)明不僅實現(xiàn)了丙酸和丁二酸的聯(lián)產(chǎn)，其半連續(xù)發(fā)酵工藝較傳統(tǒng)批次發(fā)酵工藝相比，大幅提高了發(fā)酵效率和底物轉(zhuǎn)化率，有希望應(yīng)用于丙酸及其鹽和丁二酸及其鹽的工業(yè)化聯(lián)產(chǎn)，降低工業(yè)化難度和成本。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細結(jié)構(gòu)特征才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。

以上詳細描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護范圍。

另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。

此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。