本發(fā)明涉及堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物制備方法和應(yīng)用，屬于海洋防污材料制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

一般來說，一旦把表面潔凈的載玻片等附著基浸入海洋中，在數(shù)分鐘到數(shù)小時內(nèi)，該附著基的表面將迅速形成微生物被膜。海洋附著細(xì)菌和底棲硅藻是微生物被膜的重要構(gòu)成生物。海洋微生物被膜存在于船舶、養(yǎng)殖網(wǎng)箱以及發(fā)電廠的冷卻水系統(tǒng)等設(shè)施的水下表面，加速金屬材料腐蝕和非金屬材料的降解，影響后續(xù)貽貝、藤壺等大型污損生物的附著，從而引起嚴(yán)重后果，易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2008年以來國際海事組織決定在全球禁止使用三丁基錫等有機錫類涂料，因而，研發(fā)新型環(huán)境友好型防污材料顯得尤為重要。

聚二甲基硅氧烷(sylgard184；dowcorning,usa)是一種無毒、化學(xué)惰性的硅膠，具有表面光滑、疏水性好、耐腐蝕等特點，有文獻(xiàn)(micro-fabricatedpolydimethylsiloxane(pdms)surfacesregulatethedevelopmentofmarinemicrobialbiofilmcommunities)報道聚二甲基硅氧烷可以在海洋環(huán)境中影響海洋微生物被膜的形成，從而在海洋防污方面具有開發(fā)的潛能，但其在海洋環(huán)境中發(fā)揮的作用與時間和微貌結(jié)構(gòu)相關(guān)，且隨著時間的推移，其作用效果呈現(xiàn)減弱的趨勢。

蛋白酶具有良好的生物降解作用，在海洋防污方面具有很大的應(yīng)用價值，可在海水中自然降解，無任何污染，不會增加海洋環(huán)境負(fù)面影響。alcalase酶是一種堿性蛋白酶(novozymes,denmark)，由重量比為約41％水、50％甘油和9％枯草菌素組成的活力為2.4au-a/g、密度為1.17g/ml的褐色液態(tài)物質(zhì)。alcalase酶在抑制海洋微生物被膜形成方面尚無報道，但其在藤壺附著方面有報道(theeffectsofaserineprotease,ontheadhesivesofbarnaclecyprids(balanusamphitrite))，能在短時間內(nèi)有效的清除藤壺的足跡，但其直接應(yīng)用在海洋環(huán)境中容易變性而失去活力。

但是，現(xiàn)有技術(shù)中的堿性蛋白酶(即alcalase酶)在抑制海洋微生物被膜形成方面的使用條件苛刻，無法產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)無法產(chǎn)業(yè)化的問題，提供了堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物，堿性蛋白酶包埋在硅膠彈性體中，所述硅膠彈性體是重量比為8-12:1的主劑與固化劑的混合物，主劑為聚二甲基硅氧烷，固化劑為硅油，堿性蛋白酶包括重量比為35-45％的水、50％的甘油和5-15％的枯草菌素，堿性蛋白酶與所述硅膠彈性體的重量比為1:5-15。

優(yōu)選的，所述水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41％；

優(yōu)選的，所述枯草菌素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9％；

優(yōu)選的，所述硅膠彈性體是重量比為10:1的主劑與固化劑的混合物；

優(yōu)選的，所述堿性蛋白酶與硅膠彈性體的重量比為1:10。

一種堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法，其包括以下步驟：

1.將堿性蛋白酶、聚二甲基硅氧烷和固化劑攪拌混勻得到混合液體；

2.然后抽真空至真空度達(dá)到0.120mbar以下繼續(xù)攪拌，除去混合液體中的氣泡；

3.將除去氣泡的混合溶液再均勻涂布于玻片表面，并置于溫度為16-20℃、濕度為60-80％的環(huán)境中固化，從而得到厚度為0.5-1.0mm的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物。

堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法，所述步驟1中的攪拌速度為80-120rpm，優(yōu)選100rpm，攪拌溫度為20-25℃，步驟2中攪拌速度為80-120rpm，優(yōu)選100rpm，攪拌時間為30-60min，優(yōu)選40-50min，步驟3中涂布為人工手涂或旋轉(zhuǎn)涂膜機涂布，固化時間為20-36h，優(yōu)選的，固化溫度為18℃，優(yōu)選的，固化時的濕度為70～75％，優(yōu)選的，固化時間為24h。

堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的應(yīng)用，其作為海洋微生物被膜形成的抑制劑，在應(yīng)用時，將此復(fù)合物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-10％的洗滌劑浸泡10-60min，隨后用超純水在40khz的條件下超聲洗滌10-60min，洗滌1-5次。

在實際使用過程，將得到的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷(pdms-alcalase)的復(fù)合物材料用洗滌劑浸泡，隨后用超純水洗滌，。最后將此玻片掛在沿海海域中，7天后形成微生物被膜，取回檢測載玻片表面的細(xì)菌密度和硅藻密度。同時以載玻片(glass)和無酶包埋的硅膠彈性體材料作為對照。

細(xì)菌密度的計數(shù)：先用10ml5％的甲醛溶液固定含有微生物被膜的載玻片。細(xì)菌密度計數(shù)時將固定的微生物被膜先用滅菌的載玻片將生物膜刮下，再用10ml滅菌的過濾海水沖洗，充分震蕩后，取1ml該溶液并用0.22μmgf/c濾膜過濾，然后用吖啶橙(ao,0.1％)染色5min，用熒光顯微鏡(奧林巴斯bx51)在1000倍下隨機選取10個點進(jìn)行計數(shù)，然后乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

硅藻密度的計數(shù)：將微生物被膜用光學(xué)顯微鏡在200倍下隨機選取10個點進(jìn)行計數(shù)，然后除以載玻片的面積。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理表面的細(xì)菌密度分別為：glass表面1230000±43247cellscm^-2、pdms表面1230000±43247cellscm^-2和pdms-alcalase表面1034000±25751cellscm^-2；不同處理表面硅藻密度分別為：glass表面276666±7800cellscm^-2、pdms表面242666±8556cellscm^-2和pdms-alcalase表面122200±3773cellscm^-2；堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料對微生物被膜形成的抑制效果很明顯，其中與玻璃載玻片表面形成的微生物被膜比較，細(xì)菌密度和硅藻密度顯著降低(p<0.05)，降低率分別為16％和58％；與pdms表面相比較，二者的密度顯著降低(p<0.05)，降低率分別為16％和50％。因此可以得出，堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料能夠有效抑制海洋微生物被膜的形成。

本發(fā)明的有益效果為：

1)本發(fā)明將堿性蛋白酶(即alcalase酶)包埋于具有良好化學(xué)惰性、無毒性的聚二甲基硅氧烷中，形成具有抗海洋微生物被膜形成作用的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料。該復(fù)合物材料的使用溫度范圍以及ph值范圍非常之廣，適合于實際投入使用。

2)在本發(fā)明的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法中，在低溫、高濕度的環(huán)境下，將alcalase酶包埋于聚二甲基硅氧烷中形成復(fù)合物，解決了因高溫、干燥條件下包埋alcalase酶而產(chǎn)生的酶活性降低或者失去的難題。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。

圖1是空白載玻片(glass)、無酶包埋的硅膠彈性體材料載玻片(pdms)及堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷(pdms-alcalase)的復(fù)合物材料載玻片上的硅藻密度比較圖；

圖2是空白載玻片(glass)、無酶包埋的硅膠彈性體材料載玻片(pdms)及堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷(pdms-alcalase)的復(fù)合物材料載玻片上的細(xì)菌密度比較圖。

具體實施方式

現(xiàn)在結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。這些附圖均為簡化的示意圖，僅以示意方式說明本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)，因此其僅顯示與本發(fā)明有關(guān)的構(gòu)成。

一種堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物，堿性蛋白酶包埋在硅膠彈性體中，所述硅膠彈性體是重量比為8-12:1的主劑與固化劑的混合物，主劑為聚二甲基硅氧烷，固化劑為硅油，堿性蛋白酶包括重量比為35-45％的水、50％的甘油和5-15％的枯草菌素，堿性蛋白酶與所述硅膠彈性體的重量比為1:5-15。

優(yōu)選的，所述水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41％；

優(yōu)選的，所述枯草菌素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9％；

優(yōu)選的，所述硅膠彈性體是重量比為10:1的主劑與固化劑的混合物；

優(yōu)選的，所述堿性蛋白酶與硅膠彈性體的重量比為1:10。

一種堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法，其包括以下步驟：

1.將堿性蛋白酶、聚二甲基硅氧烷和固化劑攪拌混勻得到混合液體；

2.然后抽真空至真空度達(dá)到0.120mbar以下繼續(xù)攪拌，除去混合液體中的氣泡；

3.將除去氣泡的混合溶液再均勻涂布于玻片表面，并置于溫度為16-20℃、濕度為60-80％的環(huán)境中固化，從而得到厚度為0.5-1.0mm的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物。

堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法，所述步驟1中的攪拌速度為80-120rpm，優(yōu)選100rpm，攪拌溫度為20-25℃，步驟2中攪拌速度為80-120rpm，優(yōu)選100rpm，攪拌時間為30-60min，優(yōu)選40-50min，步驟3中涂布為人工手涂或旋轉(zhuǎn)涂膜機涂布，固化時間為20-36h，優(yōu)選的，固化溫度為18℃，優(yōu)選的，固化時的濕度為70-75％，優(yōu)選的，固化時間為24h。

堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的應(yīng)用，其作為海洋微生物被膜形成的抑制劑，在應(yīng)用時，將此復(fù)合物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-10％的洗滌劑浸泡10-60min，隨后用超純水在40khz的條件下超聲洗滌10-60min，洗滌1-5次。

實施例1

一種堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物，堿性蛋白酶包埋在硅膠彈性體中，所述硅膠彈性體是重量比為10:1的主劑與固化劑的混合物，主劑為聚二甲基硅氧烷，固化劑為硅油，堿性蛋白酶包括重量比為40％的水、50％的甘油和10％的枯草菌素，堿性蛋白酶與所述硅膠彈性體的重量比為1:10。

一種堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法，其包括以下步驟：

1.將堿性蛋白酶、聚二甲基硅氧烷和固化劑攪拌混勻得到混合液體；

2.然后抽真空至真空度達(dá)到0.120mbar以下繼續(xù)攪拌，除去混合液體中的氣泡；

3.將除去氣泡的混合溶液再均勻涂布于玻片表面，并置于溫度為18℃、濕度為70％的環(huán)境中固化，從而得到厚度為0.75mm的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物。

堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的制備方法，所述步驟1中的攪拌速度為100rpm，攪拌溫度為22℃，步驟2中攪拌速度為100rpm，攪拌時間為45min，步驟3中涂布為旋轉(zhuǎn)涂膜機涂布，固化溫度為18℃，固化時的濕度為72.5％，固化時間為24h。

堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物的應(yīng)用，其作為海洋微生物被膜形成的抑制劑，在應(yīng)用時，將此復(fù)合物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的洗滌劑浸泡50min，隨后用超純水在40khz的條件下超聲洗滌20min，洗滌3次。

實施例2

取10g堿性蛋白酶(即alcalase酶)(由41％的水、50％的甘油和9％的枯草菌素組成，novozymes,denmark)、90.9g主劑(聚二甲基硅氧烷，購于道康寧公司)和9.1g固化劑(硅油，購于道康寧公司)在25℃、100rpm下攪拌混勻。然后抽真空至0.12mbar下繼續(xù)攪拌50min。接著以人工涂布方式將除去氣泡后的混合液體涂布于規(guī)格為38mm×26mm載玻片表面，置于溫度為18℃、濕度為65％的培養(yǎng)箱中自然固化24h得到堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料。

實施例3

取10g堿性蛋白酶(由41％的水、50％的甘油和9％的枯草菌素組成，novozymes,denmark)、44.4g主劑(聚二甲基硅氧烷，購于道康寧公司)和5.6g固化劑(硅油，購于道康寧公司)在25℃、100rpm下攪拌混勻。然后抽真空至0.12mbar下繼續(xù)攪拌50min。接著以人工涂布方式將除去氣泡后的混合液體涂布于規(guī)格為38mm×26mm載玻片表面，置于溫度為16℃、濕度為70％的培養(yǎng)箱中自然固化20h得到堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料。

實施例4

取10g堿性蛋白酶(由41％的水、50％的甘油和9％的枯草菌素組成，novozymes,denmark)、138.5g主劑(聚二甲基硅氧烷，購于道康寧公司)和11.5g固化劑(硅油，購于道康寧公司)在25℃、100rpm下攪拌混勻。然后抽真空至0.12mbar下繼續(xù)攪拌50min。接著以人工涂布方式將除去氣泡后的混合液體涂布于規(guī)格為38mm×26mm載玻片表面，置于溫度為20℃、濕度為80％的培養(yǎng)箱中自然固化30h得到堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料。

將實施例2得到的堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷(pdms-alcalase)的復(fù)合物材料用3％的洗滌劑浸泡30min，隨后用超純水在40khz的條件下洗20min，共洗滌三次。最后將此載玻片掛在浙江省嵊泗縣枸杞島的沿海海域中，懸掛深度為1m，7天后形成微生物被膜，取回檢測載玻片表面的細(xì)菌密度和硅藻密度。同時以載玻片(glass)和無酶包埋的硅膠彈性體材料(制備方法同實施例2，不同之處在于：不添加堿性蛋白酶)(pdms)作為對照。

細(xì)菌密度的計數(shù)：先用10ml5％的甲醛溶液固定含有微生物被膜的載玻片。細(xì)菌密度計數(shù)時將固定的微生物被膜先用滅菌的載玻片將生物膜刮下，再用10ml滅菌的過濾海水沖洗，充分震蕩后，取1ml該溶液并用0.22μmgf/c濾膜過濾，然后用吖啶橙(ao,0.1％)染色5min，用熒光顯微鏡(奧林巴斯bx51)在1000倍下隨機選取10個點進(jìn)行計數(shù)，然后乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

硅藻密度的計數(shù)：將微生物被膜用光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯ckx41)在200倍下隨機選取10個點進(jìn)行計數(shù)，然后除以載玻片的面積。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同處理表面的細(xì)菌密度分別為：glass表面1230000±43247cellscm^-2、pdms表面1230000±43247cellscm^-2和pdms-alcalase表面1034000±25751cellscm^-2；不同處理表面硅藻密度分別為：glass表面276666±7800cellscm^-2、pdms表面242666±8556cellscm^-2和pdms-alcalase表面122200±3773cellscm^-2；堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料對微生物被膜形成的抑制效果很明顯，其中與玻璃載玻片表面形成的微生物被膜比較，細(xì)菌密度(如圖2所示)和硅藻密度(如圖1所示)顯著降低(p<0.05)，降低率分別為16％和58％；與pdms表面相比較，二者的密度顯著降低(p<0.05)，降低率分別為16％和50％。因此可以得出，堿性蛋白酶與聚二甲基硅氧烷的復(fù)合物材料能夠有效抑制海洋微生物被膜的形成。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。