本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種基于明膠和氨基酸的復(fù)合膜及在膜上培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

角膜是存在于眼球前端的一層透明膜，在空間上具有一定的曲率半徑。從生理學(xué)的角度上來說，角膜的外層包含了位于中間的連續(xù)光滑的上皮層細(xì)胞和位于邊緣的角膜緣干細(xì)胞(lscs)，中間存在一層基質(zhì)層，占角膜厚度的90％，主要由一型、五型膠原蛋白，粘合物和角化細(xì)胞構(gòu)成。內(nèi)皮層則由一層六角形內(nèi)皮細(xì)胞所形成，與房水直接相連。角膜緣干細(xì)胞能不斷向角膜中心分化角膜上皮細(xì)胞，對角膜透明、視力的維持起重要作用，而lscs缺乏是世界性、災(zāi)難性的眼科疑難病癥，嚴(yán)重威脅人類視覺質(zhì)量，目前缺乏有效治療手段。lscs缺乏的傳統(tǒng)的治療方法包括羊膜移植和lscs移植。但羊膜移植可導(dǎo)致角膜上皮表型改變，而傳統(tǒng)的lscs移植需要組織多、醫(yī)源性損傷較大，臨床治療效果均不理想。自體角膜緣組織移植不適合雙眼角膜緣病變的患者，異體角膜緣組織移植則存在排斥反應(yīng)。因此，采用體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植聯(lián)合穿透性角膜移植治療嚴(yán)重的角膜病變，近年來成為人們關(guān)注的熱點。

對于角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)，目前方法主要采用酶消化法和組織切塊法從角膜緣組織上取得原代細(xì)胞后滋養(yǎng)在人源羊膜、纖維蛋白膠、等離子聚合物圖層，人重組膠原基底物等上。因受限于技術(shù)水平，體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞都存在厚度過厚，外源性細(xì)胞容易引起免疫反應(yīng)等缺點，使得移植效果并不良好。因此，尋找一種能良好支撐角膜緣干細(xì)胞，并使培養(yǎng)的細(xì)胞層具有一定的空間曲率，為進一步角膜緣干細(xì)胞移植提供條件是一件十分迫切的事情。

組織工程支架材料是指能與組織活體細(xì)胞結(jié)合并植入生物體的細(xì)胞支架。它能支持細(xì)胞在其特定的三維構(gòu)象中增殖和分化。目前組織工程支架材料應(yīng)用廣泛，囊括了骨，軟骨，血管，神經(jīng)，皮膚等各種器官。因此，結(jié)合組織工程設(shè)計一種支撐材料作為角膜緣干細(xì)胞的體外培養(yǎng)基質(zhì)是一個十分可行的設(shè)想。同時，支架材料有以下幾點要求：1、支架材料可以控制再生組織的結(jié)構(gòu)，尺寸和外形，引導(dǎo)細(xì)胞組織生長分化成特定的形態(tài)。2、作為信號分子的載體，攜帶并緩慢釋放生長因子，為細(xì)胞分化提供模擬的微環(huán)境。3、作為細(xì)胞分化代謝的場所，為細(xì)胞生長輸送營養(yǎng)。4、具有一定的韌性和可加工性，可以適應(yīng)各組織不同的生理特點。5、具有生物親和性，并且能隨時間在生物體內(nèi)逐步降解。因此，如何獲得具有以上5點技術(shù)要求的生物支架材料成為組織工程迫切需要解決的課題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，創(chuàng)造了一種能支撐角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)的復(fù)合膜，并在此基礎(chǔ)上發(fā)明了一種在復(fù)合膜上培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的方法。所得到的角膜緣干細(xì)胞能形成一層致密的上皮層，易于與材料分離，為進一步的臨床移植創(chuàng)造了條件。

本發(fā)明的目的是提供一種基于明膠和氨基酸的復(fù)合膜。

本發(fā)明另一目的是提供一種在上述復(fù)合膜上培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的方法。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種基于明膠和氨基酸的復(fù)合膜，是利用明膠、甲基丙烯酸酐，杜氏磷酸緩沖液(dpbs)、蒸餾水在受控條件下制備甲基丙烯酸酐明膠(gelma)；利用聚乙二醇(peg)、苯、三乙胺、丙烯酰氯、冰乙醚在受控條件下制備聚乙二醇雙丙烯酸酯(pegda)；利用甲基丙烯酸酐對氨基酸在受控條件下進行修飾(u-pea)；最后利用上述反應(yīng)產(chǎn)物在光引發(fā)劑的作用下制備得到。

具體地，所述的復(fù)合膜由包括以下步驟的方法制備得到：

s1.合成gelma材料

利用明膠溶液和甲基丙烯酸酐溶液反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物透析干燥后得到白色多孔泡沫產(chǎn)物即為gelma材料；于低溫干燥處儲存；

s2.合成pegda

peg與苯混合，于避光下加入三乙胺和丙烯酰氯冰浴反應(yīng)，反應(yīng)后抽濾除去不溶性鹽，并用冰乙醚對濾液進行后處理，所得固體產(chǎn)物即為pegda，真空干燥后于干燥處避光保存；

s3.合成含有不飽和鍵的氨基酸聚合物

氨基酸、二醇和對甲苯磺酸反應(yīng)制備成單體a，不飽和二酸酰氯與對硝基苯酚制備成單體b，單體a和單體b聚合反應(yīng)，產(chǎn)物沉淀純化即得含有不飽和鍵的氨基酸聚合物；

s4.利用上述步驟s1、s2、s3的產(chǎn)物制備復(fù)合膜

用40～50℃的純水溶解消毒pegda、gelma材料和含有不飽和鍵的氨基酸聚合物后混合，加入光引發(fā)劑，紫外光照即得到gelma/pegda復(fù)合膜。

更具體優(yōu)選地，步驟s1所述合成gelma材料的具體方法為：將質(zhì)量體積濃度為5～15％的明膠pbs溶液在5～15℃水浴中溶解后，以0.1～1ml/min的速度加入體積比為5～30％的甲基丙烯酸酐，在50℃水浴中攪拌反應(yīng)4～24h，加5倍量dpbs停止反應(yīng)；將所得液體置于8～14kd透析袋中，于蒸餾水中透析3，經(jīng)冷凍干燥后得到白色多孔泡沫產(chǎn)物即為gelma材料，于低溫干燥處下儲存。

優(yōu)選地，步驟s1所述明膠的分子量為1萬～30萬，膠強度為50～400gbloom。

優(yōu)選地，步驟s2所述合成pegda的具體方法為：peg加入苯溶劑中，在油浴蒸餾使除去水后冷卻至室溫，于避光加入三乙胺和丙烯酰氯冰浴反應(yīng)4～48h，反應(yīng)后抽濾除去不溶性鹽，并用冰乙醚對濾液進行后處理，所得固體產(chǎn)物即為pegda，真空干燥后于干燥處避光保存；其中，peg在苯溶劑里面的質(zhì)量體積比濃度為3～20％，peg：三乙胺：丙烯酰氯的摩爾比為1：4～10：4～10。

優(yōu)選地，步驟s2中，peg分子量為1000～50000。

優(yōu)選地，步驟s3所述合成含有不飽和鍵的氨基酸聚合物的具體方法為：氨基酸、二醇和對甲苯磺酸在有機溶劑一中反應(yīng)制備成單體a，不飽和二酸酰氯與對硝基苯酚制備成單體b，單體a和單體b溶于有機溶劑二中聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50～150℃，反應(yīng)后于烘箱里保存過夜，產(chǎn)物用乙酸乙酯沉淀純化即得含有不飽和鍵的氨基酸聚合物；其中所述有機溶劑一為苯或者甲苯，所述有機溶劑二為含有三乙胺或其他中和試劑的dmf、dmso及dma等強極性溶劑。

優(yōu)選地，所述氨基酸為精氨酸、苯丙氨酸或者甘氨酸。

優(yōu)選地，步驟s4所述制備復(fù)合膜的具體方法為：用40～50℃的純水溶解消毒過的pegda、gelma材料和含有不飽和鍵的氨基酸聚合物混合，加入光引發(fā)劑，將混合液注入模具紫外光照10～300s即可制成膜。

其中，優(yōu)選地，pegda：gelma材料：含有不飽和鍵的氨基酸聚合物的質(zhì)量比為0.1～75％：0.1～75％：0.1～90％。

優(yōu)選地，光引發(fā)劑的使用量為復(fù)合膜質(zhì)量的0.05～5％。

另外，一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基，配方比例為：100iu青霉素，100μg/ml鏈霉素，10～20ng/ml人重組egf，5～10μg/ml胰島素，1～5×10^-9m3-碘甲狀腺原氨酸，0.2～1μg/ml氫化可的松，1～5×10^-9m霍亂毒素，余量為dmem和/或dmem/f12。

更優(yōu)選地，所述角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基的配方比例為：每500ml培養(yǎng)基含有5ml10×雙抗(青霉素和鏈霉素)、1ml人重組egf、1ml胰島素、1ml3-碘甲狀腺原氨酸、1ml氫化可的松、1ml霍亂毒素，220mldmem、220mldmem/f12、50mlfbs。

另外，在上述制備了所述復(fù)合膜的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了一種不需要滋養(yǎng)層的角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，是將角膜緣組織用pbs清理后，用手術(shù)刀切碎后用iv型膠原蛋白酶進行酶解，酶解后的產(chǎn)物置于權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

其中，優(yōu)選地，所述iv型膠原蛋白酶的濃度為0.1～0.3％。

優(yōu)選地，酶解時間為1～3h。

更優(yōu)選地，所述iv型膠原蛋白酶的濃度為0.2％，酶解時間為2h。

優(yōu)選地，將酶解后的產(chǎn)物置于培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)之前，先加入matrigel和復(fù)合膜，35～38℃孵育5～15分鐘(優(yōu)選37℃孵育10分鐘)，再加入分離后的角膜緣干細(xì)胞。

即更優(yōu)選地，所述不需要滋養(yǎng)層的角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法包括如下步驟：

(1)將角膜緣組織用pbs清理后，用手術(shù)刀切碎后進行酶解；使用的酶為iv型膠原蛋白酶，置于37℃震蕩搖床，酶解時間為2小時；加入含10％fbs的dmem終止酶解，1000rpm離心5min，棄上清；

(3)用上述角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基，將酶解離心得到的角膜緣干細(xì)胞重懸；

(4)將gelma/pegda復(fù)合膜與10％的matrigel溶液平鋪于6孔板中，于37℃溫箱靜置10分鐘后吸干剩余的matrigel溶液；

(5)將重懸的角膜緣干細(xì)胞種植于鋪了復(fù)合膜的6孔板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，并在顯微鏡中觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。

本發(fā)明在尋找一種能提供給角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)使用的復(fù)合膜的制備方法的過程中發(fā)現(xiàn)，角膜中角膜外皮細(xì)胞和角膜緣干細(xì)胞都依托生長于基質(zhì)層上，而基質(zhì)層的主要成分為膠原蛋白；鑒于明膠的成分也主要來自于天然的膠原蛋白，因而將其作為支撐角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)的基底是可行的。但是由于明膠的機械穩(wěn)定性較差，本發(fā)明引入了能在紫外光下固化交聯(lián)的pegda來增強明膠的機械穩(wěn)定性。該方法可制得具有較好物理學(xué)形狀和生物學(xué)功能的承載材料。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首先利用聚乙二醇雙丙烯酸酯(pegda)、甲基丙烯酸酯明膠(gelma)和含有不飽和鍵的氨基酸聚合物在受控的條件下合成了一種復(fù)合膜，除了具備傳統(tǒng)水凝膠便于固型、高生物相容性的優(yōu)點外，其新優(yōu)點在于：

(1)光固化的特性使其在應(yīng)用過程中更加便于對成品參數(shù)的精調(diào)整。在紫外光照射前，可以方便的將材料注入到特定形狀，特定厚度的透明模具中固化。

(2)制備過程中修飾過的氨基酸聚合物的加入，使復(fù)合膜能提供促進細(xì)胞分化的微環(huán)境。

(3)明膠作為天然材料雖然與人體組織具有相同或者相近的化成成分，但是由于是非共價鍵交聯(lián)，存在著極不穩(wěn)定的特定，聚乙二醇雙丙烯酸酯具有生物相容性且通過化學(xué)鍵交聯(lián)，在機械性質(zhì)上更加穩(wěn)定。因此，本方法綜合了這兩種材料的優(yōu)點。

另外，在制備了上述復(fù)合膜的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還提供了一種不需要滋養(yǎng)層的角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法，該lscs體外培養(yǎng)的方法無滋養(yǎng)層，細(xì)胞生長在前文所述的復(fù)合膜上，便于運輸。在37攝氏度，5％co2的條件下能形成一層致密的上皮層，易于從復(fù)合材料上分離，為進一步移植創(chuàng)造有利條件。

附圖說明

圖1：a,b為固化之后從模具中取出的復(fù)合膜。

圖2：a,b為封裝好的復(fù)合膜。

圖3：取膜的過程。

圖4：在7.5％gelma+2.5％peg的膜上體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞和角膜上皮細(xì)胞。

圖5：a為膜上體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞lsc標(biāo)記物pax6的染色圖；b為角膜特異性角蛋白基因k3/k12的染色圖；證明lsc能成功適應(yīng)復(fù)合膜的環(huán)境，正常增殖。

圖6：一層取自復(fù)合膜體上外培養(yǎng)的lscs，形成了一片致密的上皮層。

具體實施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。

本發(fā)明制備得到的復(fù)合膜以及利用該復(fù)合膜培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞的結(jié)果如附圖1～6所示，具體實施案例如下所述：

實施例1制備復(fù)合膜

將10％(w/v)的明膠pbs溶液在10℃水浴中溶解后，以0.5ml/min的速度加入體積比為5％的甲基丙烯酸酐，在50℃水浴中攪拌反應(yīng)24h后加5倍量的dpbs停止反應(yīng)。將所得液體置于8～14kd透析袋中，于蒸餾水中透析3d后經(jīng)冷凍干燥后得到白色多孔泡沫產(chǎn)物即為gelma材料，于低溫干燥處下儲存。

peg與苯按照20％(w/v)比例混合，在油浴蒸餾使除去水后冷卻至室溫，于避光加入三乙胺和丙烯酰氯冰浴反應(yīng)48h(peg：三乙胺：丙烯酰氯的摩爾比為1：4：4)，反應(yīng)后抽濾除去不溶性鹽，并用冰乙醚對濾液進行后處理，所得固體產(chǎn)物即為pegda，真空干燥后于干燥處避光保存。

精氨酸、二醇和對甲苯磺酸在有機溶劑(苯或者甲苯)中反應(yīng)制備成單體a，不飽和二酸酰氯與對硝基苯酚制備成單體b，單體a和單體b溶于有機溶劑(含有三乙胺或其他中和試劑的dmf、dmso及dma等強極性溶劑)中聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50～150℃，反應(yīng)后于烘箱里保存過夜，產(chǎn)物用乙酸乙酯沉淀純化即得含有不飽和鍵的氨基酸聚合物。

用50℃的純水溶解消毒過的pegda、gelma和含有不飽和鍵的氨基酸聚合物(各組成成分含量為25％：10％：65％)，加入0.5％(w/w)的光引發(fā)劑，將混合液注入模具紫外光照(100s)即可制成膜，即為gelma/pegda。

實施例2制備復(fù)合膜

將10％(w/v)的明膠pbs溶液在10℃水浴中溶解后，以0.5ml/min的速度加入體積比為5％的甲基丙烯酸酐，在50℃水浴中攪拌反應(yīng)24h后加5倍量的dpbs停止反應(yīng)。將所得液體置于8～14kd透析袋中，于蒸餾水中透析3d后經(jīng)冷凍干燥后得到白色多孔泡沫產(chǎn)物即為gelma材料，于低溫干燥處下儲存。

peg與苯按20％(w/v)比例混合，在油浴蒸餾使除去水后冷卻至室溫，于避光加入三乙胺和丙烯酰氯冰浴反應(yīng)48h(peg：三乙胺：丙烯酰氯的摩爾比為1：4：4)，反應(yīng)后抽濾除去不溶性鹽，并用冰乙醚對濾液進行后處理，所得固體產(chǎn)物即為pegda，真空干燥后于干燥處避光保存。

苯丙氨酸、二醇和對甲苯磺酸在有機溶劑(苯或者甲苯)中反應(yīng)制備成單體a，不飽和二酸酰氯與對硝基苯酚制備成單體b，單體a和單體b溶于有機溶劑(含有三乙胺或其他中和試劑的dmf、dmso及dma等強極性溶劑)中聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50～150℃，反應(yīng)后于烘箱里保存過夜，產(chǎn)物用乙酸乙酯沉淀純化即得含有不飽和鍵的氨基酸聚合物

用50℃的純水溶解消毒過的pegda、gelma和含有不飽和鍵的氨基酸聚合物(各組成成分含量為25％：10％：65％)，加入0.5％(w/w)的光引發(fā)劑，將混合液注入模具紫外光照(100s)即可制成膜，即為gelma/pegda。

實施例3制備復(fù)合膜

將10％(w/v)的明膠pbs溶液在10℃水浴中溶解后，以0.5ml/min的速度加入體積比為5％的甲基丙烯酸酐，在50℃水浴中攪拌反應(yīng)24h后加5倍量的dpbs停止反應(yīng)。將所得液體置于8～14kd透析袋中，于蒸餾水中透析3d后經(jīng)冷凍干燥后得到白色多孔泡沫產(chǎn)物即為gelma材料，于低溫干燥處下儲存。

peg與苯按20％(w/v)比例混合，在油浴蒸餾使除去水后冷卻至室溫，于避光加入三乙胺和丙烯酰氯冰浴反應(yīng)48h(peg：三乙胺：丙烯酰氯的摩爾比為1：4：4)，反應(yīng)后抽濾除去不溶性鹽，并用冰乙醚對濾液進行后處理，所得固體產(chǎn)物即為pegda，真空干燥后于干燥處避光保存。

甘氨酸、二醇和對甲苯磺酸在有機溶劑(苯或者甲苯)中反應(yīng)制備成單體a，不飽和二酸酰氯與對硝基苯酚制備成單體b，單體a和單體b溶于有機溶劑(含有三乙胺或其他中和試劑的dmf、dmso及dma等強極性溶劑)中聚合反應(yīng)，反應(yīng)溫度為50～150℃，反應(yīng)后于烘箱里保存過夜，產(chǎn)物用乙酸乙酯沉淀純化即得含有不飽和鍵的氨基酸聚合物

用50℃的純水溶解消毒過的pegda、gelma和含有不飽和鍵的氨基酸聚合物(各組成成分含量為25％：10％：65％)，加入0.5％(w/w)的光引發(fā)劑，將混合液注入模具紫外光照(100s)即可制成膜，即為gelma/pegda。

實施例4角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法

1、一種角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有以下組分：每500ml培養(yǎng)基含有5ml10×雙抗、1ml人重組egf、1ml胰島素、1ml3-碘甲狀腺原氨酸、1ml氫化可的松、1ml霍亂毒素，220mldmem、220mldmem/f12、50mlfbs。

2、角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)方法

(1)將角膜緣組織用pbs清理后，用手術(shù)刀切碎后進行酶解；使用的酶為iv型膠原蛋白酶，置于37℃震蕩搖床，酶解時間為2小時；加入含10％fbs的dmem終止酶解，1000rpm離心5min，棄上清；

(3)用上述角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)基，將酶解離心得到的角膜緣干細(xì)胞重懸；

(4)將gelma/pegda復(fù)合膜與10％的matrigel溶液平鋪于6孔板中，于37℃溫箱靜置10分鐘后吸干剩余的matrigel溶液；

(5)將重懸的角膜緣干細(xì)胞種植于鋪了復(fù)合膜的6孔板中，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，并在顯微鏡中觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。

3、結(jié)果如附圖4～6所示。結(jié)果顯示，lsc能成功適應(yīng)復(fù)合膜的環(huán)境，正常增殖；而且復(fù)合膜體上外培養(yǎng)的lscs形成了一片致密的上皮層。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。