本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及利用一種抗干擾液抑制血紅素對實時熒光pcr（real-timepcr）儀信號采集的干擾，可利用預混抗干擾液的全血為模板直接進行real-timepcr擴增。

背景技術：

無論臨床實驗室檢測還是疫情處理，傳染病病原還是轉(zhuǎn)基因動物分型，血液的real-timepcr擴增均需經(jīng)過核酸提取或純化過程。目前常用的酚氯仿抽提法通常需要消耗數(shù)個小時，其它提取dna的試劑盒也常常需要1-2個小時，并且dna提取過程也會增加模板污染或損失的風險。因此，實驗人員急需一種操作簡便、結果準確的real-timepcr方法。

b.mercier等人在1990年探究了利用全血進行直接pcr（direct-pcr）的方法，通過增加一步對全血的預處理步驟，并更換pcrbuffer的成分，從而達到有效的擴增目的基因的目的；1994年j.burckhardt等人利用90℃1min-50℃1min（循環(huán)20次）的預處理方法使白細胞裂解來進行血液的direct-pcr，此方法還依據(jù)血液中抗凝劑的種類來優(yōu)化kcl和mgcl2的濃度，以達到擴增最優(yōu)效果；后續(xù)有學者通過洗去紅細胞，收集白細胞直接進行擴增，或加熱收集的細胞后進行pcr擴增。由于血液中的血紅素卟啉環(huán)在415～430nm的位置上存在著分子吸光，會對real-timepcr儀的信號采集產(chǎn)生強烈的干擾，因此上述direct-pcr方法只適合于用瓊脂糖凝膠電泳進行結果驗證的普通pcr，不適合real-timepcr。因此，需要研究一種試劑可以抑制血紅素的干擾，從而提供一種操作簡便的全血直接real-timepcr的方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種無需提取血液dna的全血直接real-timepcr方法，此方法可以同時處理大量血液樣品，實現(xiàn)高通量的以real-timepcr擴增為基礎的分子操作，快速，簡便，節(jié)省成本，降低模板污染風險。此外，該方法尤其適合少量采血（例如2μl）的標本檢測，節(jié)省樣本。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用下述優(yōu)化的技術方案。

1）取2μl普通干燥管、肝素抗凝管或edta抗凝管收集的全血。

2）加雙蒸水50μl破裂紅細胞，3500rpm離心5min，棄上清。

3）加入總體積為20μl的抗干擾液，混合2min。

4）取5μl混合液進行real-timepcr實驗。

所述的抗干擾液的成份含10mmtris-hcl，0.2mmna2edta，0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)異硫氰酸烯丙酯，ph8.6。其中異硫氰酸烯丙酯0.04%-0.1%，優(yōu)選為0.06%（圖1）。

所述的real-timepcr體系緩沖液（10xpcrbuffer）含160mm(nh4)2so4，750mmtris-hcl，tween-200.1%，甘油50%，ph8.8。其中tris-hcl為10mm、50mm、75mm、100mm，優(yōu)選為75mm（圖2）。

所述的real-timepcr實驗體系為25μl含0.5μlhstaq酶，3μl25mmmg²⁺，2μl2.5mmdntp，2.5μl10xpcrbuffer，0.5μl20μm上下游引物，0.25μl10μm探針，5μl模板，用雙蒸水補足至25μl。

所述的real-timepcr的反應條件如下：95℃預變性3min；95℃變性30sec，50℃-60℃復性30sec，72℃延伸30sec，40-50個循環(huán)，在退火階段采集通道的熒光。熔解曲線設置為：95℃預變性15sec后從40℃開始，升溫速率為0.4℃/步，在40℃至80℃范圍內(nèi)采集相應通道的熒光信號。

本發(fā)明提供的無需提取血液dna的全血直接real-timepcr方法，無同類產(chǎn)品可比，是本研究首創(chuàng)。該方法簡單、快速并能夠降低模板污染風險；該方法特別適用于少量采血（例如2μl）的標本檢測，節(jié)省樣本；該方法可實現(xiàn)高通量的以全血real-timepcr擴增為基礎的分子操作如基因分型、微衛(wèi)星分析、親子鑒定、動物轉(zhuǎn)基因鑒定、疫情處理、病原體分型方面的檢測應用。

附圖說明

圖1、示出本發(fā)明抗干擾液處理血液的效果，其中a為血液稀釋100倍的效果，b為2μl血液直接加18μl抗干擾液的結果。

圖2、示出本發(fā)明干擾液中異硫氰酸烯丙酯濃度優(yōu)化效果。

圖3、示出本發(fā)明10xpcrbuffer中tris-hcl濃度優(yōu)化效果。

圖4、示出本發(fā)明snp檢測實施案例結果，其中a為擴增曲線，b為溶解曲線，c為測序驗證結果。

圖5、示出本發(fā)明白血病融合基因檢測實施案例結果，其中a為擴增曲線，b為測序驗證結果。

具體實施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明方法，下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說明。本領域技術人員應當理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例1。

血液中的血紅素會干擾real-timepcr擴增時的信號采集，去除血紅素干擾是real-timepcr擴增信號有效采集的基礎。操作步驟如下。

配制抗干擾液：10mmtris-hcl，0.2mmna2edta,0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)異硫氰酸烯丙酯，ph8.6。

準備普通干燥管收集的血液10μl（未凝固）。

取2μl血液加入18μl抗干擾液，混勻2min。

取2μl血液加入200μl雙蒸水，混勻2min。

加抗干擾液管內(nèi)的血紅素產(chǎn)生的紅色褪去，而相同條件下用雙蒸水稀釋100倍的稀釋液仍有淡紅色（圖3），實驗結果說明本發(fā)明的抗干擾液可以抑制血紅素產(chǎn)生的紅色。

實施例2。

肝素抗凝管收集的全血樣本snp檢測（foxp2基因）。需要說明的是：血液中含有肝素時，可能抑制taqdna聚合酶的活性，也有可能因為肝素能結合并激活全血中多種蛋白酶原和補體系統(tǒng)，由此引起的一系列酶學效應使dna在提取過程中不斷降解，導致pcr效率降低。本實施例的real-timepcr擴增效果未受肝素影響，且在33個循環(huán)時信號可以超過dna模板（edta抗凝血液純化的dna）的擴增信號（圖4）。

foxp2是第一個證實與語言障礙有關聯(lián)的基因，有報道證實foxp2基因中的rs1456031位點（c/t）在中國人群與語言能力的具有一定的相關性。

本實施例設計上游引物foxp2-qf：5'-gaggtggctaagtgctcatc-3’；下游引物foxp2-qr：5'-cggtaacttattctgctatcctgt-3'；fam標記的探針foxp2-fam-p：

5'-ccatgtgtgattgcacgcctacaaacatgg-3'，3'端標記bhq1，用于檢測rs1456031位點（c/t）。

配制抗干擾液：10mmtris-hcl，0.2mmna2edta,0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)異硫氰酸烯丙酯，ph8.6。

配制10xpcrbuffer：160mm(nh4)2so4，750mmtris-hcl，tween-200.1%，甘油50%，ph8.8。

配制real-timepcr體系：25μl含0.5μlhstaq酶，3μl25mmmg²⁺，2μl2.5mmdntp，2.5μl10xpcrbuffer，0.5μl20μm上下游引物，0.25μl10μm探針，5μl模板，用雙蒸水補足至25μl。

real-timepcr的反應條件如下：95℃預變性3min；95℃變性30sec，52℃復性30sec，72℃延伸30sec，40個循環(huán)，在52℃退火階段采集通道的熒光。熔解曲線設置為：95℃預變性15sec后從40℃開始，升溫速率為0.4℃/步，在40℃至80℃范圍內(nèi)采集相應通道的熒光信號，實驗結果為t/t純合子，與測序結果一致（圖4）。

實施例3。

edta抗凝管收集的全血白血病融合基因檢測（pml-rara融合基因），大約95%的急性早幼粒細胞白血?。╝pl）病人帶有pml-rara融合基因，它產(chǎn)生于染色體易位t(15;17)(q24;q21)，是15號染色體（涉及pml基因）和17號染色體（涉及rara基因）經(jīng)過斷裂和重組形成。pml-rara融合基因使rara靶基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制，阻止髓性細胞的分化，使其停留在不成熟的早幼粒細胞階段。聯(lián)合應用全反式維甲酸（atra）和三氧化二砷（as2o3）的治療方案，可以誘導含pml-rara的apl細胞恢復分化能力，使apl得到治愈。在病人經(jīng)過治療達到緩解后，還可通過定量分析pml-rara的表達水平來預測復發(fā)風險高低。因此，檢測pml-rara將有助于apl病人的診斷、靶向治療方案的確立、預后判斷和復發(fā)風險的預測。

設計上游引物pml-f3：5'-gcttcgacgagttcaaggtg-3'，pml-f7：5'-aggtcttcctgcccaaca-3'。下游引物rara-r2：5'-cttgtagatgcggggtaga-3'。fam標記探針p/r-fam-p：5'-tgaagagatagtgcccagccctc-3'，3'端標記bhq1。

用edta抗凝管收集白血病陽性病人血液（測序結果為pml-rara基因融合s型，北京醫(yī)院）。

配制抗干擾液：10mmtris-hcl，0.2mmna2edta，0.04%(v/v)tritonx-100，0.06%(v/v)異硫氰酸烯丙酯，ph8.6。

配制10xpcrbuffer：160mm(nh4)2so4，750mmtris-hcl，tween-200.1%，甘油50%，ph8.8。

配制real-timepcr體系：25μl含0.5μlhstaq酶，3μl25mmmg²⁺，2μl2.5mmdntp，2.5μl10xpcrbuffer，0.5μl20μm上下游引物（上游引物兩條），0.25μl10μm探針，5μl模板，用雙蒸水補足至25μl。

real-timepcr的反應條件如下：95℃預變性3min；95℃變性30sec，60℃復性30sec，72℃延伸30sec，50個循環(huán)，在60℃退火階段采集通道的熒光。實驗結果為陽性，與測序結果一致（圖5，pml-rara基因融合s型）。本實施例中對照gusb基因是一種管家基因，其上游引物gus-tag-f2:5'-gaaaatacgtggttggagagctcatt-3'，下游引物gus-tag-r2:5'-gccgagtgaagatccccttttta-3'，探針為rox修飾5'-cagcactctcgtcggtgact-3'，3'端標記bhq1。

顯然，本發(fā)明的上述實施例僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。