本發(fā)明通常涉及基因突變檢測領(lǐng)域，具體地涉及檢測kras基因的突變的方法。
背景技術(shù)：
：kras(k-ras)基因是最重要的腫瘤致病基因之一，其參與egfr信號傳導(dǎo)過程。k-ras基因突變導(dǎo)致egfr信號通路持續(xù)激活進(jìn)而加速腫瘤細(xì)胞增殖，常見的突變包括k-ras基因的第2外顯子的12和13密碼子、第3外顯子的61密碼子。研究表明，k-ras基因突變狀態(tài)與非小細(xì)胞肺癌對易瑞沙(吉非替尼)、特羅凱(厄洛替尼)等靶向治療藥物的原發(fā)性耐藥有關(guān)。另外，對于結(jié)直腸癌患者，k-ras基因突變檢測用于決定患者是否適用egfr單抗藥物如愛必妥(西妥昔單抗)、維克替比(帕尼單抗)的治療。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(nccn)2015年版臨床治療指南指出：k-ras基因突變是egfr酪氨酸激酶抑制劑療效的預(yù)測指標(biāo)，腫瘤患者在接受egfr靶向藥物治療前必須進(jìn)行k-ras基因突變檢測，以幫助決定患者是否接受egfr酪氨酸激酶抑制劑類藥物治療。目前檢測kras基因第二外顯子的密碼子12、密碼子13突變的金標(biāo)準(zhǔn)是arms-qpcr。arms-qpcr(amplificationrefractorymutationsystem)即擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)，又名等位基因特異性pcr(allelespecificpcr)。arms技術(shù)針對引物3’端進(jìn)行等位基因特異性區(qū)分野生型和突變型兩種形式，具有高特異性、高靈敏性(1％)、耗時短、結(jié)果易于判讀等優(yōu)點(diǎn)。目前arms-qpcr檢測kras突變的實(shí)現(xiàn)形式如下所述：需要對kras基因第二外顯子的密碼子12和密碼子13中每個位點(diǎn)構(gòu)建arms-qpcr反應(yīng)體系，即一個樣本的檢測須在八個反應(yīng)管中同時進(jìn)行，其中七個反應(yīng)管分別檢測g12d、g12v、g13d、g12c、g12a、g12s、g12r七種突變，第八孔作為試劑有效性判斷的陽性質(zhì)控孔存在?，F(xiàn)有技術(shù)中，一個待檢測樣本需要通過七個反應(yīng)孔來檢測這其中是否存在基因突變，七個反應(yīng)孔所需要的模板dna量比較多，這樣就使得在dna量較少的情況下，無法判斷待檢測樣本中是否存在基因突變。目前腫瘤組織活檢是靶向基因檢測極其重要的dna來源，但在很多情況下，存在腫瘤組織獲得比較困難、dna獲得量較小的情況。因此，針對某些突變對應(yīng)同種靶向用藥的情況，使用有限量的dna實(shí)現(xiàn)這些突變的同時檢測就變得很有意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決至少部分上述技術(shù)問題，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過使用能夠特異性識別并點(diǎn)對點(diǎn)結(jié)合至野生型kras基因靶序列的結(jié)合物，并通過調(diào)整作為引物的檢測核苷酸和結(jié)合物的識別區(qū)域的位置關(guān)系，并同時調(diào)整反應(yīng)體系中結(jié)合物和檢測核苷酸的濃度比例可以一次性快速確定靶序列中是否存在基因突變，而無需多次檢測反應(yīng)，且提高了用于cfdna檢測的靈敏度。至少基于上述內(nèi)容完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。本發(fā)明的一方面，提供檢測樣品中kras基因的突變的方法，其包括：構(gòu)建dna擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述dna擴(kuò)增反應(yīng)體系包含能夠特異性識別并結(jié)合至野生型kras基因的待測靶序列的結(jié)合物，和檢測核苷酸；利用所述dna擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行dna擴(kuò)增反應(yīng)；判斷是否獲得包含所述待測靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，若獲取所述擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述靶序列中存在突變，反之，則所述靶序列中不存在突變；其中所述結(jié)合物由下式(1)的重復(fù)單元構(gòu)成，其中，n為6-20的整數(shù)，b為選自由a、t、g和c組成的組；且所述結(jié)合物與所述野生型kras基因的待測靶序列結(jié)合后的解鏈溫度為70℃及以上，當(dāng)所述待測靶序列中包含突變時，則所述結(jié)合物不能與所述待測靶序列結(jié)合；其中所述檢測核苷酸能夠特異性識別并結(jié)合kras基因，且其結(jié)合序列與所述待測靶序列中突點(diǎn)位點(diǎn)對應(yīng)的位置不重疊。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法，式(1)中n＝14，且沿從左到右的方向各重復(fù)單元中的b依次為tacgccaccagctc。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述野生型kras基因的待測靶序列包含甘氨酸密碼子。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述待測靶序列包含所述野生型kras基因上第二外顯子中密碼子12和密碼子13所對應(yīng)的序列。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述檢測核苷酸包括第一核苷酸、第二核苷酸和第一探針；其中所述第一核苷酸的結(jié)合序列位于所述待測靶序列的上游，和所述第二核苷酸的結(jié)合序列位于所述待測靶序列的下游。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，其中所述反應(yīng)體系還包括用于擴(kuò)增內(nèi)參序列的第三核苷酸、第四核苷酸和第二探針。優(yōu)選地，所述第三核苷酸和所述第四核苷酸的結(jié)合序列分別位于kras基因上。更優(yōu)選地，所述第三核苷酸和所述第四核苷酸的結(jié)合序列各自們于所述待測靶序列的上游，或者各自位于所述待測靶序列的下游。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述dna擴(kuò)增反應(yīng)為熒光定量pcr，且判斷是否獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟包括：獲取與所述待測靶序列對應(yīng)的所述第一熒光探針的循環(huán)數(shù)值ct1；獲得與第三核苷酸和第四核苷酸列對應(yīng)的所述第二熒光探針的循環(huán)數(shù)值ct2；當(dāng)ct1≤35，ct2≤31，且δct1＝|ct1-ct2|≤8時，所述dna擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生所述擴(kuò)增產(chǎn)物，否則所述dna擴(kuò)增反應(yīng)中未產(chǎn)生所述擴(kuò)增產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述熒光定量pcr的反應(yīng)體系基于20ul總體積包含7-8ng模板，且反應(yīng)條件如下：95℃10min95℃15s，70℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述突變?yōu)辄c(diǎn)突變。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述樣品為組織或血液樣品，例如血漿和/或血清。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述kras基因來源于gdna或cfdna。有益效果：本發(fā)明的檢測方法可以一次性同時檢測kras基因上多種點(diǎn)突變，本方法中利用能夠特異性識別并結(jié)合至野生型kras基因待測靶序列的結(jié)合物，對待測靶序列進(jìn)行dna擴(kuò)增反應(yīng)，通過是否獲得待測靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物判斷待測靶序列中是否存在突變。進(jìn)一步，本方法中僅需要少量待檢測dna，便可以判斷待測靶序列中是否存在突變，且靈敏度高(0.5％)，準(zhǔn)確、快速。附圖說明圖1是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖2是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖3是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖4是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖5是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖6是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖7是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以組織dna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖8是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以血液cfdna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖9是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以血液cfdna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖10是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以血液cfdna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖11是本發(fā)明其中一個實(shí)施例以血液cfdna為樣本檢測kras基因的突變的熒光定量pcr擴(kuò)增曲線；圖12是本發(fā)明所述的檢測kras基因上多種點(diǎn)突變的方法的流程圖。具體實(shí)施方式現(xiàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的多種示例性實(shí)施方式，該詳細(xì)說明不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明的限制，而應(yīng)理解為是對本發(fā)明的某些方面、特性和實(shí)施方案的更詳細(xì)的描述。應(yīng)理解本發(fā)明中所述的術(shù)語僅僅是為描述特別的實(shí)施方式，并非用于限制本發(fā)明。另外，對于本發(fā)明中的數(shù)值范圍，應(yīng)理解為具體公開了該范圍的上限和下限值以及它們之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內(nèi)的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內(nèi)的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立地包括或排除在范圍內(nèi)。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所述領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然本發(fā)明僅描述了優(yōu)選的方法和材料，但是在本發(fā)明的實(shí)施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻(xiàn)通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻(xiàn)相關(guān)的方法和/或材料。在與任何并入的文獻(xiàn)沖突時，以本說明書的內(nèi)容為準(zhǔn)。本發(fā)明中，名詞術(shù)語既包括單數(shù)形式，也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另行明確指出。本發(fā)明中所述的“至少一種”不僅僅指包含“一個”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個”或“多種”的情況。本發(fā)明中，術(shù)語“結(jié)合物”是指可以通過化學(xué)鍵、親和性或堿基互補(bǔ)等方式與基因相結(jié)合的任何物質(zhì)。優(yōu)選地，所述結(jié)合物為由單體經(jīng)固相合成。優(yōu)選地，所述結(jié)合物由重復(fù)單元構(gòu)成。優(yōu)選地，結(jié)合物具有不帶電荷的骨架結(jié)構(gòu)，以便于結(jié)合物以堿基配對的方式與dna結(jié)合。優(yōu)選地，所述結(jié)合物不易被已知的蛋白酶和核酸酶降解，其與dna結(jié)合后具有極強(qiáng)的特異性和熱穩(wěn)定性。在示例性實(shí)施方案中，所述結(jié)合物與dna具有極強(qiáng)的穩(wěn)定性，優(yōu)選地，其解鏈溫度tm值比dna-dna、dna-rna的tm高1-10℃，例如，高2、3、4、5、6、7、8或9℃。在示例性實(shí)施方案中，所述結(jié)合物與所述野生型kras基因的待測靶序列結(jié)合后的解鏈溫度為70℃以上，進(jìn)一步優(yōu)選，所述解鏈溫度為80℃以上；更優(yōu)選，所述解鏈溫度為85℃以上；還優(yōu)選所述解鏈溫度為90℃以下。例如70±5℃，優(yōu)選71±3℃。在示例性實(shí)施方案中，在所述結(jié)合物的骨架結(jié)構(gòu)引入修飾基團(tuán)，以改善結(jié)合物與dna序列結(jié)合的親和力和序列的選擇性。在結(jié)合物進(jìn)行修飾的方法包括在骨架結(jié)構(gòu)中引入修飾或引入堿基衍生結(jié)構(gòu)的修飾，例如，在骨架結(jié)構(gòu)上引入手性和非手性基團(tuán)以獲得與dna的特定方向結(jié)合性；提高骨架結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度；在骨架結(jié)構(gòu)上直接引入陽離子功能基團(tuán)；或與特定的分子結(jié)合使其能夠穿透目標(biāo)細(xì)胞。在示例性實(shí)施方案中，在結(jié)合物的骨架結(jié)構(gòu)中主要通過引入五元或六元環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步在骨架結(jié)構(gòu)中接上反-1,2-環(huán)己烷二胺、吡咯烷或順-環(huán)戊烷；進(jìn)一步地，在結(jié)合物重復(fù)單元上插入堿基修飾，進(jìn)一步地，堿基修飾包括：引入能夠進(jìn)行熒光標(biāo)記的類堿基；對胸腺嘧啶和胞嘧啶進(jìn)行雜環(huán)化修飾；引入胞嘧啶，如，2,6-二氨基嘌呤等天然的堿基類似物；在尿嘧啶的5位引入功能基團(tuán)。本發(fā)明中，所述的結(jié)合物的重復(fù)單元中b依次為tacgccaccagctc，在結(jié)合物的堿基中插入修飾-tacgcc*1a*2ccagctc-，其中，c*1表示在胞嘧啶進(jìn)行雜環(huán)修飾，a*2表示在腺嘌呤被二氨基嘌呤替代，提高結(jié)合物穩(wěn)定性和tm值；進(jìn)一步地，在結(jié)合物的序列中至少有一個腺嘌呤被二氨基嘌呤替代；進(jìn)一步地，在結(jié)合物的堿基中插入修飾-t*3acgcc*1a*2ccagctc-，其中，t*1表示胸腺嘧啶由巰基嘧啶替代。本發(fā)明檢測樣品中kras基因的突變的方法中，構(gòu)建dna擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述dna擴(kuò)增反應(yīng)體系包含能夠特異性識別并結(jié)合至野生型kras基因的待測靶序列的結(jié)合物；利用所述dna擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行dna擴(kuò)增反應(yīng)；判斷是否獲得包含所述待測靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，若獲取所述擴(kuò)增產(chǎn)物，則所述靶序列中存在點(diǎn)突變，反之，則所述靶序列中不存在點(diǎn)突變。其中，所述結(jié)合物由下式(1)的重復(fù)單元構(gòu)成，其中，n為6-20的整數(shù)，b為選自由a、t、g和c組成的組；且所述結(jié)合物與所述野生型kras基因的待測靶序列結(jié)合后的解鏈溫度為70℃以上，當(dāng)所述待測靶序列中包含點(diǎn)突變時，則所述結(jié)合物不能與所述待測靶序列結(jié)合。進(jìn)一步地，所述結(jié)合物中n＝14，且沿從左到右的方向各重復(fù)單元中的b依次為tacgccaccagctc。進(jìn)一步其中，至少有一個腺嘌呤被二氨基嘌呤替代，所述解鏈溫度為70℃；進(jìn)一步地，所述解鏈溫度為72℃、74℃、75℃等；進(jìn)一步地，所述解鏈溫度為80℃；進(jìn)一步地，所述解鏈溫度為85℃；進(jìn)一步地，所述解鏈溫度為90℃。在某些實(shí)施方案中，需要調(diào)整反應(yīng)體系中的結(jié)合物和檢測核苷酸的濃度比例為3:1-5:1，優(yōu)選4:1，由此可進(jìn)一步提高檢測靈敏度。在某些實(shí)施方案中，所述野生型kras基因的待測靶序列包含甘氨酸密碼子。進(jìn)一步地，所述野生型kras基因的待測靶序列包含所述野生型kras基因上第二外顯子密碼子中12和密碼子13所對應(yīng)的序列。在某些實(shí)施方案中，所述dna擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括檢測核苷酸，所述檢測核苷酸包括第一核苷酸、第二核苷酸、第一探針。優(yōu)選地，反應(yīng)體系進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增內(nèi)參的第三核苷酸、第四核苷酸和第二探針。在某些實(shí)施方案中，第一核苷酸和/或第二核苷酸的結(jié)合序列與所述待測靶序列不重疊，例如，所述第一核苷酸的結(jié)合序列位于所述待測靶序列的上游，和所述第二核苷酸的結(jié)合序列位于所述待測靶序列的下游。在某些實(shí)施方案中，第一核苷酸的結(jié)合序列不包含待測靶序列中突點(diǎn)位點(diǎn)對應(yīng)的位置。優(yōu)選地，第一核苷酸的結(jié)合序列距待測靶序列中突變位點(diǎn)的位置為1-20bp，更優(yōu)選為1-10bp，例如2、3、4、5、6、7、8、9bp。優(yōu)選地，第二核苷酸位于待測靶序列的下游。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，重疊區(qū)域的長度在特定范圍內(nèi)具有優(yōu)異的技術(shù)效果。因?yàn)槿绻丿B區(qū)域過短，則噪音過大，靈敏度大大降低，甚至降至5％以上。另一方面，如果重疊區(qū)域過長，則本發(fā)明的結(jié)合物影響到作為引物的檢測核苷酸的結(jié)合，不利于pcr中的擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行，最終也會影響到檢測的靈敏度。使用本發(fā)明的結(jié)合物與核苷酸，特別是檢測核苷酸的組合可使靈敏度提高至例如約0.5％，相比現(xiàn)有技術(shù)提高約50％。如果重疊區(qū)域的長度進(jìn)一步延長，例如包含了突變位置的序列，甚至一個堿基，則不能通過一次反應(yīng)特定位點(diǎn)所有類型的突變，可能僅僅檢測一種類型的突變，這是本發(fā)明所不期望的。在某些實(shí)施方案中，第一核苷酸的結(jié)合序列與待測靶序列具有至少重疊區(qū)域，所述重疊區(qū)域的長度為1-10bp，優(yōu)選1-8bp，例如，1、2、3、4、5、6、7bp等。在某些實(shí)施方案中，所述第一探針和所述第二探針均為熒光探針，且所述第一探針和所述第二探針的熒光報告基團(tuán)不同；第三核苷酸和第四核苷酸組成內(nèi)參引物，通過第三核苷酸和第四核苷酸對其對應(yīng)的序列的擴(kuò)增，以判斷待檢測dna序列的完整性。進(jìn)一步地，所述第一探針的熒光報告基團(tuán)為fam或vic，相對應(yīng)地，所述第二探針的熒光報告基團(tuán)為vic或fam，所述第一探針和/所述第二探針上還包括mgb-nfq猝滅基團(tuán)。在某些實(shí)施方案中，所述第一核苷酸序列為：-aattagctgtatcgtcaaggcactctt-，所述第二核苷酸序列為-cattatttttattataaggcctgctgaa-；進(jìn)一步地，所述第三核苷酸序列為-gatgattcgaaagcttcattaatttgt-，所述第四核苷酸序列為-ggtgcatgcagttgattacttcttatt-；進(jìn)一步地，所述第一探針序列為-tgactgaatataaacttg-，第一探針的熒光報告基團(tuán)為fam，所述第一探針的猝滅基團(tuán)為mgb-nfq；所述第二探針序列為-cacaccaacattca-第二探針的熒光報告基團(tuán)為vic，所述第二探針的猝滅基團(tuán)為mgb-nfq。在某些實(shí)施方案中，所述檢測樣品中kras基因的突變的方法中，所述dna擴(kuò)增反應(yīng)為熒光定量pcr，且判斷是否獲得所述擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟包括：獲取與所述待測靶序列對應(yīng)的所述第一熒光探針的循環(huán)數(shù)值ct1；獲得與第三核苷酸和第四核苷酸列對應(yīng)的所述第二熒光探針的循環(huán)數(shù)值ct2；當(dāng)ct1≤35，ct2≤31，且δct1＝|ct1-ct2|≤8時，則所述dna擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)生所述擴(kuò)增產(chǎn)物，否則所述dna擴(kuò)增反應(yīng)中未產(chǎn)生所述擴(kuò)增產(chǎn)物。所述熒光定量pcr的反應(yīng)體系基于20ul總體積包含7-8ng模板，且反應(yīng)條件如下：95℃10min95℃15s，70℃15s，60℃1min，40個循環(huán)。在60℃采集熒光。實(shí)施例在沒有特別說明的情況下，本發(fā)明中使用的任何試劑均為市場購買的一般試劑。1.樣本提取使用dna提取試劑對組織dna進(jìn)行提取，從7個不同的組織樣本中分別提取dna，分別為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、和樣品7，其中樣品7為野生型樣品；dna提取主要步驟如下：將組織樣本暫存于4℃的冰箱中，采用美國qiagen公司的組織dna提取試劑盒進(jìn)行提取，具體步驟參見試劑盒附帶的使用說明書，在此不再贅述。首先對新鮮血液進(jìn)行血漿分離，然后使用qiagen公司的提取試劑盒提取血漿中的cfdna，從4個不同的血液樣本中分別提取血液dna，分別為樣品8、樣品9、樣品10和樣品11，其中，樣品11為健康人樣品。dna提取主要步驟如下：將全血樣本暫存于4℃的冰箱中，采用美國qiagen公司的游離dna提取試劑盒進(jìn)行提取，具體步驟參見試劑盒附帶的使用說明書，在此不再贅述。2.配置熒光定量pcr的反應(yīng)體系，如表1所示：表1dna2.00μm第一核苷酸和第二核苷酸0.25μm第一探針0.25μm結(jié)合物0.90μm第三核苷酸和第四核苷酸0.25μm第二探針0.25μmdntp2.00μmmgcl20.40μmtaq酶10.00μm去離子水3.70μm總計20.00μm3.熒光定量pcr取出預(yù)先保存在-20℃環(huán)境中的dntp、mgcl2、taq酶，和表2所示的結(jié)合物、第一核苷酸、第二核苷酸、第三核苷酸、第四核苷酸、第一探針和第二探針。按照下述pcr反應(yīng)程序，分別對樣品1、樣品2和樣品3進(jìn)行熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)。表2序列名稱序列結(jié)合物tacgccaccagctc第一核苷酸序列aattagctgtatcgtcaaggcactctt第二核苷酸序列cattatttttattataaggcctgctgaa第三核苷酸序列g(shù)atgattcgaaagcttcattaatttgt第四核苷酸序列g(shù)gtgcatgcagttgattacttcttatt第一探針熒光報告基團(tuán)為famtgactgaatataaacttg第二探針熒光報告基團(tuán)為viccacaccaacattcapcr反應(yīng)程序：在60℃采集熒光。ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)所設(shè)定的閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。其中，樣片1至樣品11的檢測結(jié)果如下：樣品1的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝29.49，ct2＝25.95，δct1＝ct1-ct2＝3.54≤8表明樣品1進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品2的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝31.51，ct2＝26.23，δct1＝ct1-ct2＝5.28≤8表明樣品2進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品3的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝31.03，ct2＝26.25，δct1＝ct1-ct2＝4.78≤8表明樣品3進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品4的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝31.81，ct2＝26.26，δct1＝ct1-ct2＝7.55≤8表明樣品4進(jìn)行熒光定量pcr時，沒有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中不存在突變；樣品5的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝31.11，ct2＝26.48，δct1＝ct1-ct2＝4.63≤8表明樣品5進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品6的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝33.70，ct2＝26.20，δct1＝ct1-ct2＝7.5≤8表明樣品6進(jìn)行熒光定量pcr時，沒有獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中不存在突變；樣品7的反應(yīng)管內(nèi)ct1于小于閾值，無ct1，ct2＝26.27；樣品8的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝31.50，ct2＝27.63，δct1＝ct1-ct2＝3.87≤8表明樣品8進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品9的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝34，ct2＝27.69，δct1＝ct1-ct2＝6.31≤8表明樣品9進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品10的反應(yīng)管內(nèi)ct1＝34.72，ct2＝27.69，δct1＝ct1-ct2＝7.03≤8表明樣品10進(jìn)行熒光定量pcr時，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，則結(jié)合物沒有與kras基因相結(jié)合，kras基因上的特異位點(diǎn)中至少存在一種突變；樣品11的反應(yīng)管內(nèi)無ct1，ct2＝25.68；4.驗(yàn)證為了驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性，利用二代測序技術(shù)(nsg)對樣品1至樣品11進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：樣品1中kras基因存在g12d點(diǎn)突變，且突變概率為5％；樣品2中kras基因存在g12d點(diǎn)突變，且突變概率為1％；樣品3中kras基因存在g12v點(diǎn)突變，且突變概率為5％；樣品4中kras基因存在g12v點(diǎn)突變，且突變概率為1％；樣品5中kras基因存在g13d點(diǎn)突變，且突變概率為5％；樣品6中kras基因存在g13d點(diǎn)突變，且突變概率為1％；樣品7中kras基因第二外顯子中密碼子12和密碼子13所對應(yīng)的序列上無突變；樣品8中kras基因存在g12d點(diǎn)突變，且突變概率為5％；樣品9中kras基因存在g12d點(diǎn)突變，且突變概率為1％；樣品10中kras基因存在g12d點(diǎn)突變，且突變概率為0.5％；樣品11中kras基因第二外顯子中密碼子12和密碼子13所對應(yīng)的序列上無突變。且同時通過數(shù)字pcr技術(shù)對上述樣品進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過上述驗(yàn)證，利用本發(fā)明可以快速檢測出kras基因上的多個點(diǎn)突變，且檢測靈敏度0.5％。在不背離本發(fā)明的范圍或精神的情況下，可對本發(fā)明說明書的具體實(shí)施方式做多種改進(jìn)和變化，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。由本發(fā)明的說明書得到的其他實(shí)施方式對技術(shù)人員而言是顯而易見得的。本申請說明書和實(shí)施例僅是示例性的。當(dāng)前第1頁12