本發(fā)明涉及無細(xì)胞dna作為癌癥免疫藥物療效評價的分子靶標(biāo)及其應(yīng)用，屬于醫(yī)藥生物檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：腫瘤免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)治療、放射治療和化療藥物治療之后的第四大腫瘤治療療法,也是目前最熱門的腫瘤治療手段。免疫治療完全顛覆了人們以往對于腫瘤治療的觀念,從原先的依靠外界方式殺死腫瘤,到依靠自身免疫系統(tǒng)殺死腫瘤。目前腫瘤免疫治療主要包括免疫疫苗、免疫檢查點抑制劑治療、過繼性免疫細(xì)胞治療、細(xì)胞因子治療等,其中免疫檢查點抑制劑治療以其顯著的臨床療效而備受矚目。fda在2015年四月批準(zhǔn)了sipuleucel-t治療性疫苗用于前列腺癌，proveng是它的商用名，由美國dendreon公司生產(chǎn)。sipuleucel-t作用原理不同于pd-1和pd-l1抑制劑。它用病人的自體外周血單核細(xì)胞在體外與融合蛋白pa2024進(jìn)行孵育生長，再注射回病人體內(nèi)；外周血單核細(xì)胞的產(chǎn)物會激活t細(xì)胞來抗癌細(xì)胞。fda在2015年十月批準(zhǔn)了pembrolizumab單克隆抗體的pd-1抑制劑，作為治療晚期黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌。pembrolizumab由美國默沙東公司生產(chǎn)，keytruda為它的商用名。它對鉑類化療無效，或針對alk或egfr基因變異的靶向療法無效的癌癥病人，有效率達(dá)到41％。在2016年五月fda又批準(zhǔn)了pd-l1免疫療法藥物atezolizumab，用于治療最常見的膀胱癌，即局部晚期或轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌。它由羅氏公司生產(chǎn)，商用名為tecentriq。atezolizumab是一種與pd-l1蛋白結(jié)合的單克隆抗體，阻斷人體免疫pd-l1通路，使t細(xì)胞活激活打碎癌細(xì)胞。雖然靶向免疫檢查點的藥物靶點明確，但基于目前的前期臨床結(jié)果，即使在研究較為成熟的晚期黑色素瘤和肺癌中，其藥物有效率也參差不齊。一般來說，腫瘤抗原的數(shù)量和類型與免疫治療的耐藥性有關(guān)，高突變負(fù)荷的腫瘤通過釋放大量的腫瘤特異性新抗原，使得免疫系統(tǒng)更容易識別，在這種情況下免疫檢查點抑制劑的療效較佳，例如，晚期黑色素瘤、肺癌和泌尿系統(tǒng)腫瘤等。例如，有研究表明表達(dá)pd-l1的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等腫瘤浸潤面細(xì)胞可以預(yù)測pd-l1單抗的治療反應(yīng)，但是即使是對于目前研究較多的pd-l1單抗而言，其生物標(biāo)記物仍然存在較大爭議。并且目前所考慮的免疫檢查點療效預(yù)測相關(guān)的生物標(biāo)記物，檢測方法過于復(fù)雜，對于免疫檢查點抑制劑的無效患者組與有效患者組之間，兩者生物標(biāo)記物含量數(shù)值可信區(qū)間過于接近，很難獲得可信閾值以用于臨床。因此尋找免疫檢查點抑制劑相關(guān)療效預(yù)測標(biāo)記物對于指導(dǎo)其臨床用藥具有重要意義。無細(xì)胞dna又稱循環(huán)dna，是指一種無胞狀態(tài)的胞外dna，存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，腫瘤臨床的早期診斷、鑒別診斷、有效觀察及預(yù)后檢測越來越受益于腫瘤分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)及其檢測方法的完善。目前認(rèn)為無細(xì)胞dna是一種無侵襲性的潛在用途較大的腫瘤標(biāo)志物。目前關(guān)于無細(xì)胞dna產(chǎn)生的生物學(xué)機制尚無定論，但是目前認(rèn)為無細(xì)胞dna可能來源于細(xì)胞凋亡或壞死后釋放的dna片段，這些片段通過毛細(xì)血管壁或淋巴管管壁滲透到血循環(huán)中；也可能來源于有核細(xì)胞裂解釋放的dna片段，外周血中存在結(jié)構(gòu)完整的腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的dna片段占游離dna片段的大部分。研究表明各種腫瘤患者體內(nèi)的循環(huán)血中均存在腫瘤細(xì)胞，但這些細(xì)胞不是轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。這些腫瘤細(xì)胞在外周血中在吞噬細(xì)胞的作用下裂解釋放出dna片段，即無細(xì)胞dna。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種評價癌癥免疫藥物療效的分子靶標(biāo)，無細(xì)胞dna。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，對腫瘤患者施用癌癥免疫藥物后，患者體液中的無細(xì)胞dna含量對癌癥免疫藥物的療效非常敏感，并且具有極佳的預(yù)測性。在施用癌癥免疫藥物后2天，起效患者體液中的無細(xì)胞dna含量大幅提高，而無效患者體液中的無細(xì)胞dna含量則無明顯變化。一般來講，起效患者體液中的無細(xì)胞dna含量是無效患者的3-7倍，這一效果在后續(xù)治療的臨床常規(guī)療效評價中也予以了驗證。因此，我們認(rèn)為將施用癌癥免疫藥物前后的患者體液中無細(xì)胞dna含量是否提升了1倍作為輔助診斷標(biāo)準(zhǔn)是較為合適的。在一個實施方案中，所述癌癥免疫藥物包括但不限于：樹突細(xì)胞疫苗和免疫檢查點抑制劑、具有提高人體內(nèi)cd4+和cd8+t細(xì)胞比例的化合物以及具有免疫激活或免疫增強作用的中藥。進(jìn)一步地，所述癌癥免疫藥物為免疫檢查點抑制劑。在另一個實施方案中，所述免疫檢查點抑制劑選自抗ctla-4抗體、pd1阻斷劑、抗pd1抗體、lag-3抑制劑、pd-l1阻斷劑、抗pd-l1抗體、b7-h3抑制劑、b7-h4抑制劑和/或tim3抑制劑。在一個具體地實施方案中，所述抗ctla-4抗體是曲美木單抗(tremelimumab)或伊匹單抗(mdx-d010)；所述pd1阻斷劑是尼沃魯單抗(nivolumab)、蘭伯麗珠單抗(lambrolizumab)、ct-011和/或amp-224；pd-l1阻斷劑是bms-936559；所述lag-3抑制劑是imp321；所述b7-h3抑制劑是mga271。細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4(ctla-4)是一種下調(diào)t細(xì)胞活化路徑的免疫檢查點蛋白(fong等人,cancerres.69(2):609-615,2009；webercancerimmunol.immunother,58:823-830,2009)。經(jīng)顯示，阻斷ctla-4可增進(jìn)t細(xì)胞活化和增殖。ctla-4抑制劑包括抗ctla-4抗體?？筩tla-4抗體結(jié)合到ctla-4并且阻斷ctla-4與它在抗原呈遞細(xì)胞上表達(dá)的配體cd80/cd86的相互作用，并由此阻斷由這些分子相互作用引起的免疫反應(yīng)的負(fù)面下調(diào)?？筩tla-4抗體的實例描述于美國專利號：5811097、5811097、5855887、6051227、6207157、6682736、6984720及7605238中。一種抗ctla-4抗體是曲美木單抗(替西木單抗(ticilimumab)，cp-675206)。在一個實施方案中，抗ctla-4抗體是伊匹單抗(又稱10d1，mdx-d010)，一種結(jié)合到ctla-4的完全人類單克隆igg抗體。伊匹單抗是以yervoytm的名稱銷售并且已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療無法切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。另一種免疫檢查點蛋白是程序性細(xì)胞死亡蛋白1(pd-1)。pd1在針對感染的發(fā)炎性反應(yīng)時限制周圍組織中的t細(xì)胞活性，并且為了限制自體免疫性，體外pd1阻斷響應(yīng)于特異性抗原靶或混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中的異體細(xì)胞的攻擊而增進(jìn)t細(xì)胞增殖和細(xì)胞激素產(chǎn)生。在pd1阻斷情況下，pd1表達(dá)與反應(yīng)之間顯示出強相關(guān)性(pardoll,naturereviewscancer,12:252-264,2012)。pd1阻斷可以通過多種機制實現(xiàn)，包括了結(jié)合pd1或其配體pdl1的抗體。pd1和pdl1阻斷劑的實例描述于以下各案中：美國專利號7488802、7943743、8008449、8168757、8217149；以及pct公開的專利申請?zhí)杦o03042402、wo2008156712、wo2010089411、wo2010036959、wo2011066342、wo2011159877、wo2011082400及wo2011161699。在某些實施方案中，pd1阻斷劑包括抗pd-l1抗體。在某些其它實施方案中，pd1阻斷劑包括抗pd1抗體及類似結(jié)合蛋白，如尼沃魯單抗(mdx1106、bms936558、ono4538)，一種結(jié)合pd-1并通過其配體pd-l1和pd-l2阻斷pd-1活化的完全人igg4抗體；蘭伯麗珠單抗(mk-3475或sch900475)，一種針對pd-1的人源化單克隆igg4抗體；ct-011，一種結(jié)合pd1的人源化抗體；amp-224，一種b7-dc的融合蛋白；抗體fc部分；用于阻斷pd-l1(b7-h1)的bms-936559(mdx-1105-01)；以及阿特朱單抗(atezolizumab)。其它免疫檢查點抑制劑包括淋巴細(xì)胞活化基因-3(lag-3)抑制劑，如imp321，一種可溶性ig融合蛋白(brignone等,2007,j.immunol.179:4202-4211)。其它免疫檢查點抑制劑包括b7抑制劑，如b7-h3和b7-h4抑制劑。確切地說，抗b7-h3抗體mga271(loo等人,2012,clin.cancerres.(18)3834)。還包括tim3(t細(xì)胞免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和粘蛋白結(jié)構(gòu)域3)抑制劑(fourcade等,2010,j.exp.med.207:2175-86；及sakuishi等,2010,j.exp.med.207:2187-94)。在又一個實施方案中，所述中藥選自人參、黃芪、熟地黃、醋龜甲、女貞子、紅景天、薏苡仁、桑椹、梔子、三七、靈芝、枸杞子、靈芝、猴頭菇、竹蓀、香菇、玄參、黨參、丹參、決明子、銀杏以及決明子中一種或多種。在本發(fā)明中，檢測人體體液中無細(xì)胞dna的方法進(jìn)行，例如采用提取以及純化人體體液無細(xì)胞dna的試劑以及用于精確定量dna的試劑進(jìn)行檢測。例如，市售的用于提取純化人體體液的無細(xì)胞dna試劑盒qiaampdna試劑盒(qiagenusa)，以及用于精確定量dna濃度的picogreen。所述檢測方法如下：(1)抽取受試者血清或血漿，離心制備無細(xì)胞血清或血漿，提取其中的無細(xì)胞dna；(2)測定無細(xì)胞dna的濃度。(3)通過比較給藥前和給藥后，患者體液中無細(xì)胞dna含量變化作為療效評價指標(biāo)。本發(fā)明的目的之二是提供無細(xì)胞dna在制備癌癥免疫藥物療效評價方面試劑盒中的應(yīng)用。基于以上描述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)無細(xì)胞dna在癌癥免疫藥物療效診斷方面具有極大的臨床應(yīng)用價值，尤其是在早期給藥階段的療效判斷以及預(yù)測。這也解決了目前癌癥免疫藥物早期給藥過程中療效診斷及預(yù)測生物標(biāo)記物缺乏的技術(shù)難題。具體實施方式還可進(jìn)一步通過實施例來理解本發(fā)明，其中所述實施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實施例不限制本發(fā)明?，F(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。術(shù)語“抗體”包括提到的任何同型或子類的糖基化和非糖基化免疫球蛋白，或其與完整抗體競爭特異性結(jié)合的抗原結(jié)合區(qū)，包括單克隆抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體、抗體模擬物、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、抗體融合物、抗體偶聯(lián)物、單鏈抗體、抗體衍生物、抗體類似物及其對應(yīng)的片段。還包括抗體的免疫片段(例如，fab、fab’、f(ab’)2或scfv)，不管此類抗體是經(jīng)由免疫法，通過重組技術(shù)，借助于體外合成手段還是其它方法整體或部分產(chǎn)生的。因此，如本文中所使用，術(shù)語“抗體”包括那些通過重組手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體在內(nèi)，如(a)從關(guān)于人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)或由人免疫球蛋白基因制備的雜交瘤分離的抗體；(b)從被轉(zhuǎn)染以表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞(例如由轉(zhuǎn)染瘤(transfectoma))分離的抗體；(c)從重組的組合抗體庫分離的抗體；及(d)通過涉及將免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列上的任何其它手段制備、表達(dá)、產(chǎn)生或分離的抗體。這些抗體具有源自于兩個不同動物種類的生殖系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。然而，在某些實施方案中，這些抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或，當(dāng)使用關(guān)于人免疫球蛋白序列的轉(zhuǎn)基因動物時，體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，并因此，這些抗體的vh區(qū)和vl區(qū)的氨基酸序列是盡管源自于特定物種(例如人類)的生殖系vh和vl序列并且與之相關(guān)，但可能并非在體內(nèi)天然存在于所述物種的抗體生殖系譜系內(nèi)的序列。除非另作指示，否則術(shù)語“抗體”除包含兩個全長重鏈和兩個全長輕鏈的抗體外，還包括其衍生物、變體、片段及突變蛋白。在一些情形中，“抗體”可包括較少鏈，如在駱駝中天然存在的可能僅包含重鏈的抗體。術(shù)語“患者”或“受試者”可互換使用，并且意思指哺乳動物，包括但不限于，人類或非人類哺乳動物，如牛、馬、犬、綿羊或貓。優(yōu)選地，患者是人類。實施例1阿特朱單抗療效評價從醫(yī)院收取50例晚期膀胱癌患者(tnm分期iv期)，男性36例，女性14例，其中pd-l1表達(dá)陽性患者42例，陰性8例。給予阿特朱單抗(atezolizumab，genentech，usa)每3周1200mg，一次靜脈輸注歷時60分鐘，靜脈輸注前需稀釋。在給藥前和頭次給藥后2天抽取患者血液樣本，然后將這些血樣放進(jìn)含5毫升edta的離心管，用離心機3000g常溫10分鐘離心，抽取上清液。qiaampdna試劑盒(qiagenusa)按廠家程序說明提純cell-freedna。部分提純后的dna用quant-ittmdsdnaassaykit(thermofisher，usa)定量其濃度。將給藥2天后，血樣中無細(xì)胞dna含量提高1倍的患者分為起效組，其他患者為無效組，按1979年who制定的療效標(biāo)準(zhǔn)分為：完全緩解(cr)、部分緩解(pr)、進(jìn)展(pd)和穩(wěn)定(sd)對阿特朱單抗療效進(jìn)行評價。隨后在后續(xù)的電話隨訪確定患者死亡時間，采用kaplan-meier法計算中位存活期。具體結(jié)果如下：1、按照pd-l1表達(dá)陽性患者和陰性患者分組情況下阿特朱單抗療效結(jié)果完全緩解部分緩解進(jìn)展穩(wěn)定陽性組10例8例12例12例陰性組2例2例1例3例2、按照無細(xì)胞dna變化分組情況下阿特朱單抗療效結(jié)果完全緩解部分緩解進(jìn)展穩(wěn)定起效組12例9例12例2例無效組0例1例1例13例3、根據(jù)臨床療效評價分為有效組患者(療效評價為完全緩解、部分緩解的患者)和穩(wěn)定組患者(療效評價為穩(wěn)定和進(jìn)展的患者)，統(tǒng)計分析給藥前和給藥2天后，患者血樣無細(xì)胞dna含量cfdna(ng/ml)有效組穩(wěn)定組給藥前21.6±6.426.3±5.9給藥后95.8±12.1*＊36.2±7.64、按照無細(xì)胞dna變化分組情況下各組患者的中位存活期(os)起效組無效組給藥前14.2個月5.3個月結(jié)果表明，阿特朱單抗作為pd-l1阻斷劑，從理論上來講，pd-l1表達(dá)陽性應(yīng)該是最佳的藥效評價預(yù)測指標(biāo)，而目前的臨床研究也均是圍繞著pd-l1表達(dá)是否陽性作為輔助診斷指標(biāo)，但是無論從文獻(xiàn)中以及本發(fā)明的結(jié)果來看，pd-l1表達(dá)陽性的患者對于阿特朱單抗的應(yīng)答并不理想。而根據(jù)無細(xì)胞dna含量變化來看，有效組患者在給藥2天后，其無細(xì)胞dna含量提高了3倍左右，并且按照無細(xì)胞dna指標(biāo)作為輔助診斷指標(biāo)的分組結(jié)果顯示，阿特朱單抗對無細(xì)胞dna指標(biāo)應(yīng)答率更佳。實施例2尼沃魯單抗(nivolumab)療效評價從醫(yī)院收取50例轉(zhuǎn)移性鱗性非小細(xì)胞肺癌患者，男性43例，女性7例，其中pd-l1表達(dá)陽性患者39例，陰性11例。給予尼沃魯單抗(nivolumab)每2周靜脈內(nèi)注射3mg/kg。在給藥前和頭次給藥后2天抽取患者血液樣本，然后將這些血樣放進(jìn)含5毫升edta的離心管，用離心機3000g常溫10分鐘離心，抽取上清液。qiaampdna試劑盒(qiagenusa)按廠家程序說明提純cell-freedna。部分提純后的dna用quant-ittmdsdnaassaykit(thermofisher，usa)定量其濃度。將給藥2天后，血樣中無細(xì)胞dna含量提高1倍的患者分為起效組，其他患者為無效組，按1979年who制定的療效標(biāo)準(zhǔn)分為：完全緩解(cr)、部分緩解(pr)、進(jìn)展(pd)和穩(wěn)定(sd)對阿特朱單抗療效進(jìn)行評價。隨后在后續(xù)的電話隨訪確定患者死亡時間，采用kaplan-meier法計算中位存活期。具體結(jié)果如下：1、按照pd-l1表達(dá)陽性患者和陰性患者分組情況下阿特朱單抗療效結(jié)果完全緩解部分緩解進(jìn)展穩(wěn)定陽性組9例13例5例12例陰性組3例3例1例4例2、按照無細(xì)胞dna變化分組情況下阿特朱單抗療效結(jié)果完全緩解部分緩解進(jìn)展穩(wěn)定起效組12例14例4例13例無效組0例2例2例3例3、根據(jù)臨床療效評價分為有效組患者(療效評價為完全緩解、部分緩解和進(jìn)展的患者)和穩(wěn)定組患者(療效評價為穩(wěn)定的患者)，統(tǒng)計分析給藥前和給藥2天后，患者血樣無細(xì)胞dna含量4、按照無細(xì)胞dna變化分組情況下各組患者的中位存活期(os)起效組無效組給藥前12.2個月4.6個月另外，采用本發(fā)明的方法對伊匹單抗(ipilimumab，商品名yervoy)在黑色素瘤晚期患者的研究中也發(fā)現(xiàn)了與實施例1和2類似的技術(shù)效果。這充分說明無細(xì)胞dna含量變化對于癌癥免疫藥物療效評價的潛在應(yīng)用價值。本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。當(dāng)前第1頁12