本發(fā)明涉及一種川射干黃酮苷元的提取工藝及其分離純化方法，屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

川射干為鳶尾科植物鳶尾iristectorummaxim.的干燥根莖，為藥典收載品種，具有清熱解毒，祛痰，利咽的功效。用于熱毒痰火郁結(jié)，咽喉腫痛，痰涎壅盛，咳嗽氣喘。研究證明，川射干中的主要活性成分為鳶尾苷、野鳶尾苷、鳶尾苷元、野鳶尾黃素等黃酮類成分，具有抗炎、抗病毒、解毒等藥理活性，因此從川射干中提取分離黃酮類物質(zhì)具有重要的意義。

然而，由于川射干所含化學(xué)成分復(fù)雜，黃酮類成分的分離純化并不容易。目前多使用對(duì)黃酮分離效果較好的大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行提取物的富集，即便如此，提取物中黃酮的含量最多也只能達(dá)到58％左右，效果并不令人滿意(參見(jiàn)：陳勇等.大孔樹(shù)脂對(duì)川射干異黃酮的分離純化工藝研究[j].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(1)：40～43)。由于所得提取物純度不高，雜質(zhì)含量過(guò)多，難以將其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成制劑。

另外，川射干黃酮中如鳶尾甲黃素a、鳶尾甲黃素b、射干苷元等成分的結(jié)構(gòu)非常類似，黃酮成分之間的分離也較為困難。

目前多通過(guò)柱層析分離得到毫克級(jí)的單體化合物，均為鑒別化學(xué)結(jié)構(gòu)用，未見(jiàn)有大量制備單體化合物的相關(guān)報(bào)道。

因此，亟需提供一種新的川射干黃酮的提取工藝及其分離純化方法，以解決上述問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種川射干黃酮苷元的提取工藝及其分離純化方法。

本發(fā)明提供了一種川射干黃酮苷元的提取工藝，包括如下步驟：取川射干提取物浸膏，加入含4～6％v/vhcl的45～55％v/v乙醇溶液，與川射干原生藥材的料液比為(1：1.8)～(1：2.2)，回流5～7小時(shí)，趁熱過(guò)濾，靜置析出沉淀，過(guò)濾收集沉淀，即得川射干總黃酮苷元提取物。

進(jìn)一步地，加入含5％v/vhcl的50％v/v乙醇溶液，與川射干原生藥材的料液比為1：2，回流6小時(shí)。

進(jìn)一步地，所述的川射干提取物浸膏為川射干的醇提物。

進(jìn)一步地，所述的川射干提取物浸膏為川射干的乙醇提取物。

進(jìn)一步地，所述的川射干提取物浸膏由下述方法制備得到：取川射干原生藥粗粉，用50～80％v/v乙醇溶液加熱回流提取3次，每次1.5小時(shí)，每次料液比為1：4，過(guò)濾，合并濾液，濃縮，即得浸膏。

本發(fā)明提供了一種川射干黃酮苷元的富集方法，包括如下步驟：根據(jù)所述提取工藝得到川射干總黃酮苷元提取物，采用硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁富集，即得高含量的川射干總黃酮苷元提取物。

進(jìn)一步地，取川射干總黃酮苷元提取物，用0.8～1.2倍體積量的90～100％v/v乙醇加熱溶解，溶液中加入1.8～2.2倍重量的硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁，拌勻，干燥，研細(xì)，過(guò)40～80目篩，用氯仿洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得高含量的川射干總黃酮苷元提取物。

進(jìn)一步地，取川射干總黃酮苷元提取物，用1倍體積量的95％的乙醇加熱溶解，溶液中加入2倍重量的硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁，拌勻，干燥，研細(xì)，過(guò)60目篩，用氯仿洗脫，收集洗脫液，濃縮，即得高含量的川射干總黃酮苷元提取物。

本發(fā)明提供了一種川射干黃酮苷元的分離純化方法，包括如下步驟：取高含量的川射干總黃酮苷元提取物，采用硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁進(jìn)行干柱層析，分別收集射干苷元、鳶尾甲黃素a和鳶尾甲黃素b。

進(jìn)一步地，所述射干苷元、鳶尾甲黃素a和鳶尾甲黃素b的純度均大于98％。

進(jìn)一步地，所述干柱層析的方法為：取高含量的川射干總黃酮苷元提取物，用0.4～0.6倍體積量的90～100％v/v乙醇加熱溶解，溶液中加入0.8～1.2倍重量的硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁拌樣，揮干溶劑后用氯仿進(jìn)行干柱層析，待層析完畢，將硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁分段切割，分別收集射干苷元、鳶尾甲黃素a、鳶尾甲黃素b。

進(jìn)一步地，所述干柱層析的方法為：取高含量的川射干總黃酮苷元提取物，用1/2體積量的95％乙醇加熱溶解，溶液中加入1倍重量的硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁拌樣，揮干溶劑后用氯仿進(jìn)行干柱層析，待層析完畢，將硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁分段切割，分別收集射干苷元、鳶尾甲黃素a、鳶尾甲黃素b。

進(jìn)一步地，層析所用硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁的粒徑為200～300目。

理論上，粒徑越小(目數(shù)越大)，分離效果越好。本發(fā)明試驗(yàn)用過(guò)100～200目的硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁，分離效果不好，射干苷元、鳶尾甲黃素a和鳶尾甲黃素b三個(gè)成分分離不開(kāi)；也用過(guò)300～400目，結(jié)果上述三種成分仍然不能分開(kāi)；只有用200-300目，分離效果能達(dá)到要求。

進(jìn)一步地，將硅膠、聚酰胺或中性氧化鋁分段切割后，采用薄層法檢查川射干黃酮苷元，展開(kāi)劑為氯仿：甲醇：甲酸體積比10：0.5：0.1。

本發(fā)明分別試驗(yàn)過(guò)氯仿、氯仿-甲醇、石油醚-丙酮等展開(kāi)劑，結(jié)果僅有上述展開(kāi)體系能夠?qū)⑸涓绍赵?、鳶尾甲黃素a和鳶尾甲黃素b完全分離。

本發(fā)明提供了一種川射干黃酮苷元的提取工藝，使得提取物中總黃酮苷元含量能夠達(dá)到55.12％。在此基礎(chǔ)上，即使只采用粗硅膠分離等常規(guī)純化手段，也能將黃酮含量提高至70～80％。而且，上述經(jīng)過(guò)富集的高含量川射干總黃酮苷元提取物還可進(jìn)一步進(jìn)行干柱層析，制備得到克級(jí)的鳶尾甲黃素a、鳶尾甲黃素b和射干苷元單體化合物，純度均能達(dá)到98％以上。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為川射干總黃酮提取物hplc譜圖；

圖2為川射干總黃酮苷元提取物hplc譜圖；

圖3為射干苷元對(duì)照品hplc譜圖；

圖4為鳶尾甲黃素a對(duì)照品hplc譜圖；

圖5為鳶尾甲黃素b對(duì)照品hplc譜圖；

圖6為射干苷元?dú)渥V圖；

圖7為鳶尾甲黃素a氫譜圖；

圖8為鳶尾甲黃素b氫譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過(guò)購(gòu)買市售產(chǎn)品獲得。

含量測(cè)定方法

1、總黃酮苷元

對(duì)照品溶液的制備：精密稱定在105℃干燥至恒重的射干苷元對(duì)照品12.5mg，置于50ml容量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。每1ml含射干苷元0.25mg。

供試品溶液的制備：精密稱取105℃干燥至恒重的本品約20mg，置于50ml容量瓶中，加入無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。每1ml含本品0.4mg。

測(cè)定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液1ml，分別置于50ml容量瓶中，用無(wú)水乙醇稀釋并定容至刻度，搖勻。按紫外-可見(jiàn)分光光度法(中國(guó)藥典2015版四部0401)，在267nm波長(zhǎng)處，以無(wú)水乙醇為空白，分別測(cè)定對(duì)照品與供試品溶液的吸收度，計(jì)算，即得。

2、射干苷元

照高效液相色譜法(中國(guó)藥典2015年版四部通則0512)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.2mol/l磷酸二氫鈉水溶液(42:58)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm。理論板數(shù)按射干苷元峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000。

對(duì)照品溶液的制備取在105℃干燥至恒重的射干苷元對(duì)照品適量，加70％甲醇制成每1ml含0.025mg的溶液，即得。

供試品溶液的制備取本品約25mg，精密稱定，置25ml量瓶中，加無(wú)水乙醇適量，超聲處理(功率250w，頻率50khz)10分鐘，放冷，加入無(wú)水乙醇至刻度，搖勻，精密量取1ml溶液于10ml容量瓶中，加70％的甲醇溶液至刻度，搖勻，即得。

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

實(shí)施例1本發(fā)明川射干總黃酮苷元的提取工藝

取川射干原生藥粗粉10kg，用50～80％乙醇加熱回流提取3次，每次1.5小時(shí)，每次溶媒用量為40l，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮得浸膏。將浸膏置于搪瓷反應(yīng)釜中，用含5％hcl的50％乙醇20l，加熱回流水解6小時(shí)，趁熱過(guò)濾，放置過(guò)夜，析出沉淀，過(guò)濾，水洗至中性，60℃減壓干燥，得棕黃色干燥疏松粉末，即川射干總黃酮苷元提取物，收率9.5％，射干苷元含量24.34％，總黃酮苷元含量55.12％。

實(shí)施例2本發(fā)明川射干總黃酮苷元的富集

方法一、粗硅膠吸附富集川射干總黃酮苷元

取總黃酮苷元含量50～65％的川射干總黃酮苷元提取物(如根據(jù)實(shí)施例1制備)1kg，用95％的乙醇1l加熱溶解，溶液加2kg柱層析硅膠(100～200目)拌勻，干燥，研細(xì)，過(guò)60目篩，置于5l自制的圓柱形滲濾桶中，用氯仿進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，回收溶媒得浸膏，60℃減壓干燥，即得高含量的川射干總黃酮苷元提取物，為黃色或棕黃色干燥疏松粉末，收率為50～70％，射干苷元含量30～40％，總黃酮苷元含量70～80％。

方法二、粗聚酰胺吸附富集川射干總黃酮苷元

取總黃酮苷元含量50～65％的川射干總黃酮苷元提取物1kg，用95％的乙醇1l加熱溶解，溶液加2kg柱層析聚酰胺(100～200目)拌勻，干燥，研細(xì)，過(guò)60目篩，置于5l自制的圓柱形滲濾桶中，用氯仿進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，回收溶媒得浸膏，60℃減壓干燥，即得高含量的川射干總黃酮苷元提取物，為黃色或棕黃色干燥疏松粉末，收率為50～70％，射干苷元含量30～40％，總黃酮苷元含量70～80％。

方法三、粗中性氧化鋁吸附富集川射干總黃酮苷元

取總黃酮苷元含量50～65％的川射干總黃酮苷元提取物1kg，用95％的乙醇1l加熱溶解，溶液加2kg柱層析氧化鋁(中性，100～200目)拌勻，干燥，研細(xì)，過(guò)60目篩，置于5l自制的圓柱形滲濾桶中，用氯仿進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，回收溶媒得浸膏，60℃減壓干燥，即得高含量的川射干總黃酮苷元提取物，為黃色或棕黃色干燥疏松粉末，收率為50～70％，射干苷元含量30～40％，總黃酮苷元含量70～80％。

實(shí)施例3本發(fā)明川射干總黃酮苷元的干柱層析分離純化工藝

方法一、硅膠干柱層析分離純化川射干總黃酮苷元

取高含量的川射干總黃酮苷元提取物(如根據(jù)實(shí)施例2制備)100g，用95％的乙醇50ml加熱溶解，溶液加100g100～200目的柱層析硅膠拌樣，揮干溶劑后進(jìn)行干柱層析(干柱層析：中空玻璃柱，直徑6～8cm，柱高100cm，裝填200～300目柱層析硅膠2kg，人工裝填)，用氯仿進(jìn)行層析。待層析完畢，在通風(fēng)柜中抖出硅膠，分段切割，薄層檢查(展開(kāi)劑為氯仿：甲醇：甲酸10：0.5：0.1)，對(duì)照品對(duì)照，合并相同組分，依次分別收集得到射干苷元20g，鳶尾甲黃素a4g，鳶尾甲黃素b2g，(交叉部分合并，可同法進(jìn)行分離或混在下一批上樣樣品中)。經(jīng)uplc檢測(cè)純度：acquityhsst3柱(2.1×100mm，1.8μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：263nm；流速：0.6ml/min；柱溫35℃。流動(dòng)相：水(a)，乙腈(b)：系統(tǒng)梯度：0min：10％b；3min：20％b；4.5min：30％b；5.5min：55％b；6.5min：55％b；7min：10％b。含量(面積歸一法)均大于98％。

方法二、聚酰胺干柱層析分離純化川射干總黃酮苷元

取高含量的川射干總黃酮苷元提取物100g，用95％的乙醇50ml加熱溶解，溶液加100g100～200目的柱層析聚酰胺拌樣，揮干溶劑后進(jìn)行干柱層析(干柱層析：中空玻璃柱，直徑6～8cm，柱高100cm，裝填200～300目柱層析聚酰胺2kg，人工裝填)，用氯仿進(jìn)行層析。待層析完畢，在通風(fēng)柜中抖出聚酰胺，分段切割，薄層檢查(展開(kāi)劑為氯仿：甲醇：甲酸10：0.5：0.1)，對(duì)照品對(duì)照，合并相同組分，分別用乙醇洗脫，回收溶劑，依次分別收集得到射干苷元20g，鳶尾甲黃素a4g，鳶尾甲黃素b2g，(交叉部分合并，可同法進(jìn)行分離或混在下一批上樣樣品中)。所得化合物純度經(jīng)uplc檢測(cè)，色譜條件同實(shí)例1，含量(面積歸一法)均大于98％。

方法三、中性氧化鋁干柱層析分離純化川射干總黃酮苷元

取高含量的川射干總黃酮苷元提取物100g，用95％的乙醇50ml加熱溶解，溶液加100g100～200目的柱層析中性氧化鋁拌樣，揮干溶劑后進(jìn)行干柱層析(干柱層析：中空玻璃柱，直徑6～8cm，柱高100cm，裝填200～300目柱層析中性氧化鋁2kg，人工裝填)，用氯仿進(jìn)行層析。待層析完畢，在通風(fēng)柜中抖出氧化鋁，分段切割，薄層檢查(展開(kāi)劑為氯仿：甲醇：甲酸10：0.5：0.1)，對(duì)照品對(duì)照，合并相同組分，依次分別收集得到射干苷元20g，鳶尾甲黃素a4g，鳶尾甲黃素b2g，(交叉部分合并，可同法進(jìn)行分離或混在下一批上樣樣品中)。所得化合物純度經(jīng)uplc檢測(cè)，色譜條件同實(shí)例1，含量(面積歸一法)均大于98％。