專利名稱：磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種利用磁性納米固定化酶生物催化超臨界流體萃取富集的大豆異黃酮 糖苷轉化為大豆異黃酮苷元的方法。
背景技術：
大豆異黃酮是大豆生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，共12種，由金雀異黃素、大 豆黃素、黃豆黃素3種大豆異黃酮苷元，見圖l，以及它們和葡萄糖、乙酰葡萄糖、丙二酰 葡萄糖以e-糖苷鍵連接形成的9種糖苷型異黃酮(大豆異黃酮糖苷)組成，見圖2。研究證 明，大豆異黃酮苷元是大豆異黃酮發(fā)揮藥理功能的活性形式，它們是活性苷元，以金雀異 黃素活性最強。但活性苷元含量極低，僅占大豆異黃酮總量的2-3%。大豆異黃酮主要是以 糖苷形式存在，這些糖苷幾乎不被吸收，它們只有轉化為大豆異黃酮苷元才能被吸收進入 體內發(fā)揮作用。盡管大豆異黃酮對人體健康的功效受到高度關注，但由于活性苷元在大豆 異黃酮中所占比例少，分離純化難度大、產(chǎn)率低、成本高，所以當前大豆異黃酮加工仍是 以從脫脂大豆粕中提取生產(chǎn)40-80%含量的粗提物用作食品添加劑為主，加工水平初級，產(chǎn) 品附加值不高，因為主要是糖苷形式，常因人群個體差異保健效果不明顯，生物利用率低， 嚴重限制了大豆異黃酮在醫(yī)藥和化妝品等領域的開發(fā)應用。
國內外竟相開展將大豆中含量多的異黃酮糖苷轉化為活性苷元的研究。目前，轉化大 豆異黃酮糖苷為活性苷元的方法主要有酸水解法和酶水解法兩種。酸水解法要求溫度高， 水解反應缺乏專一性，除水解糖苷鍵外也能破壞異黃酮上的其它基團，造成異黃酮苷元結 構不穩(wěn)定引起活性消失，并且酸水解會對環(huán)境產(chǎn)生污染，所以酸水解法研究雖多，但應用
效果并不理想。酶水解法是用e -葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮糖苷的e -糖苷鍵生成活性苷
元，水解反應具有e-糖苷鍵專一性，條件溫和，效率高，異黃酮活性苷元結構穩(wěn)定。目前 酶水解法研究還停留在研究游離酶水解異黃酮糖苷階段，酶穩(wěn)定性差、不能回收重復使用、 殘留酶增加產(chǎn)物分離難度，加之酶本身昂貴，生產(chǎn)成本高，尚沒有實用價值。因此，當前 急需解決限制大豆異黃酮加工水平與應用領域的關鍵問題是如何高效、穩(wěn)定、低成本生產(chǎn) 異黃酮活性苷元。
固定化酶將為工業(yè)化生產(chǎn)大豆異黃酮活性苷元提供新技術。固定化酶是指固定在適合 載體上并在一定的空間范圍內能連續(xù)進行催化反應的酶。固定化酶不僅保持了酶的催化特 性，而且克服了游離酶的不足，具有增加酶的穩(wěn)定性，酶可反復或連續(xù)使用以及酶和反應 產(chǎn)物易于分離的優(yōu)點，因而效率高、成本低。自從20世紀60年代日本首次固定化氨基酰化 酶工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸以來，固定化酶技術為酶的工業(yè)化應用開辟了廣闊的發(fā)展空間。 2002年《美國化學學會會刊》報道，美國西北太平洋國家實驗室的研究人員成功利用納米 材料將酶固定化，而且能夠同時保留它的活性、穩(wěn)定性，這項成就為納米材料酶學應用開 啟了可能性，也為酶固定化帶來了技術突破。至今，磁性納米固定化酶在催化糖苷型大豆異黃酮原料轉化為大豆異黃酮苷元方面的應用尚未見相關專利和報道。

發(fā)明內容
針對以上研究中的空白，本發(fā)明提供一種工藝簡單、操作方便、環(huán)保、能提供高純度 大豆異黃酮苷元的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法。 本發(fā)明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現(xiàn)的 磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法包括以下操作步驟
(1) 、糖苷型大豆異黃酮原料的超臨界流體萃取富集
取用夾帶劑充分潤濕的糖苷型大豆異黃酮原料，在夾帶劑、萃取壓力20-40 Mpa、萃 取溫度30-50 'C的條件下超臨界二氧化碳(C02)流體萃取2-4h后，從分離釜中放出萃取 物；去除萃取物中的夾帶劑，獲得糖苷型大豆異黃酮原料；
(2) 、大豆異黃酮糖苷水解酶的提取
在由麥麩2.0g/L，硫酸銨((NH4)2S04) lg/L，磷酸二氫鉀(KH2P04) 2 g/L ，硫酸 鎂(MgS04 7H20) 0.2 g/L,硫酸亞鐵(FeS04 7H20) 0.01 g/L組成的培養(yǎng)基上接種黑 曲霉，接種量15%,裝液量70 mL/100 mL三角瓶；在搖瓶轉速200±5 r/min、溫度為30 ±0.5 'C條件下發(fā)酵3天；將發(fā)酵液于10000 r/min， 4 'C條件下離心10 min,取上清液為 e-葡萄糖苷酶粗酶液；用30%~80%飽和度的硫酸銨沉淀0-葡萄糖苷酶粗酶液；將沉淀物 溶于0.1mol/L、 pH5.0的乙酸緩沖液于溫度4。C下離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交換樹 脂DEAE-52樹脂分離柱，用0.2 11101幾、pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集e-葡 萄糖苷酶活性部分得到收集液A，收集液A經(jīng)截留分子量為500-1 OOO道爾頓的超濾膜系 統(tǒng)離心濃縮后，進行葡聚糖凝膠(SephadexG-lOO)柱層析，收集P-葡萄糖苷酶活性部分 得到收集液B;收集液B經(jīng)截留分子量為500-1 OOO道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮，獲得 e-葡萄糖苷酶溶液；用O.l mol/L、 pH5.0的乙酸緩沖液調節(jié)e-葡萄糖苷酶溶液，得到酶 活力為1500-2000U/mL的大豆異黃酮糖苷水解酶溶液即黑曲霉P-葡萄糖苷酶溶液；
(3) 磁性納米固定化酶的制備
取0.5-1.0 g磁性納米粒子加到4.5ml的pH4.0-6.0醋酸緩沖液中，然后加入體積分數(shù) 為2%(體積分數(shù)，v/v)戊二醛溶液0.5ml，中低頻超聲分散；再按照0.5-10 mL/0.5-1.0g 磁性納米粒子的比例加入黑曲霉P-葡萄糖苷酶溶液，放置水浴恒溫震蕩器中，溫度20-30 'C、轉速100-150 r/min條件下固定化2-4h，利用永久磁鐵收集固定化酶粒子；固定化酶粒 子用pH4.0-6.0醋酸緩沖液清洗，直至流出液無蛋白檢出，獲得磁性納米固定化酶；
(4) 、糖苷型大豆異黃酮原料的磁性納米固定化酶催化轉化
將糖苷型大豆異黃酮原料用pH4.5醋酸緩沖液配制成0.5-1.0 mg/mL的溶液，并用1.0 mol/ZL的鹽酸(HC1)調節(jié)所述溶液的pH至4.9-5.1，得到大豆異黃酮糖苷溶液；將上述步 驟(3)中所得的磁性納米固定化酶按照0.8-1.2g/0.8-1.2 mL的比例加入pH5.0醋酸緩沖液中， 充分攪拌使其懸浮均勻，形成磁性納米固定化酶懸浮液；向所述大豆異黃酮糖苷溶液中加 入磁性納米固定化酶懸浮液形成混合液，加入的磁性納米固定化酶懸浮液體積為所述大豆 異黃酮糖苷溶液體積的0.5~1倍；將所述混合液在溫度20-50 'C條件反應20 min-60 min，獲得高大豆異黃酮苷元含量的轉化液； (5)、大豆異黃酮苷元的提取
離心或外加磁場分離高大豆異黃酮苷元含量的轉化液中的磁性納米固定化酶，獲得大 豆異黃酮苷元溶液；大豆異黃酮苷元溶液減壓濃縮得到高純度大豆異黃酮苷元成品。 所述糖苷型大豆異黃酮原料為脫脂大豆粉或大豆胚芽粉或脫脂豆粕。 所述步驟(l)的超臨界流體萃取過程所用的夾帶劑為甲醇或乙醇或乙酸乙酯或甲醇與 水的混合溶劑或乙醇與水混合溶劑，加入量為投入原料量的100-300%。
所述磁性納米粒子為氮化鋁或四氧化三鐵或氧化鈦，其平均粒徑15-100 nm。 所述步驟(5)的離心條件為5 000-10 000 r/min、 2-8 'C離心15-20 min。 所述外加磁場分離的具體操作方法是，將永久磁鐵條放入上述步驟(4)取得的轉化液中 攪拌l-2分鐘，磁性納米固定化酶被吸附在永久磁鐵條上。 所述大豆異黃酮糖苷水解酶的提取
取發(fā)芽、芽長1-1.5 cro的鷹嘴豆，加液氮研磨成勻漿狀，并在0.1 Mol/L醋酸沖液 (pH5.0，下同)中均質24h，在溫度4 。C、 12000 r/min條件下離心10min，取上清液；向 上清液緩慢加入30%-80%飽和度硫酸銨((NH4)2S04)進行分級；取沉淀溶于0.1Mol/L醋酸 緩沖液中，4 X:冰箱透析18-24小時即得粗酶液；在溫度4X條件，粗酶液離心脫鹽、濃 縮；濃縮液上離子交換樹脂(DEAE-52)樹脂分離柱，用0.2moI/L、 pH6.8的磷酸緩沖液
洗脫樹脂分離柱，收集e-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液C，收集液C經(jīng)截留分子量為
500-1 000道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮后，進行S印hadex G-100柱層析，收集葡萄糖 苷酶活性部分得到收集液D;收集液D經(jīng)截留分子量為500-1 000道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離 心濃縮，濃縮液即為鷹嘴豆P-葡萄糖苷酶溶液。
本發(fā)明將超臨界流體萃取技術與固定化酶技術結合起來，首先用超臨界流體萃取技術 提取富集糖苷型大豆異黃酮原料，用磁性納米粒子將酶進行固定化獲得磁性納米固定化 酶，再用磁性納米固定化酶催化糖苷型大豆異黃酮原料轉化為大豆異黃酮苷元。
采用本發(fā)明方法制備而成的大豆異黃酮苷元產(chǎn)品中大豆異黃酮苷元總含量較高，其中 金雀異黃素含量占絕對優(yōu)勢。具體的方法和數(shù)據(jù)如下用色譜純甲醇準確配制金雀異黃素、 大豆黃素、黃豆黃素濃度各為0.1 mg/mL的標樣溶液和0.2 mg/mL的本方法制備的大豆異 黃酮苷元產(chǎn)品溶液，進行HPLC。
HPLC分析條件色譜柱為美國Merck公司的Purospher STARC18柱(4.6 mm i.d.X250 mm， 5 um)，流動相為甲醇-水-乙酸(體積比，10 : 10 : l)溶液，柱溫25'C，進樣體積20 uL,流速1.0mL/min，檢測波長260nm，靈敏度為3.0AUFS,
計算公式為
錄口出+曰g苗瞎；的令縣苷元標樣濃度x樣品中對應苷元的峰面積
樣品中大旦異黃酮苷兀的含量=-丄一^AA,々^n wavv、+v^血-
標樣的峰面積X樣品溶液濃度
測得本發(fā)明方法生產(chǎn)的大豆異黃酮苷元產(chǎn)品中大豆異黃酮苷元濃度之和為82,7%,金雀異黃素含量為90.3%。
用本發(fā)明的制備方法，超臨界萃取工藝簡單易操作，操作過程二氧化碳無毒、無殘留，
糖苷萃取率高；磁性納米固定化酶制備方法簡單，外加磁場后易分離；制備的產(chǎn)品大豆異
黃酮苷元結構和生理活性不受破壞，含量高。


圖1為大豆異黃酮苷元的分子結構圖。
圖2為大豆異黃酮糖苷的分子結構圖。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步地說明。
實施例1:
磁性納米固定化酶轉化糖苷型大豆異黃酮原料生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法包括下列 操作步驟-
步驟h糖苷型大豆異黃酮原料的超臨界流體萃取富集
取脫脂豆粕100g，用95%乙醇夾帶劑100 mL充分潤濕后放入超臨界流體萃取裝置的萃 取釜中，在萃取壓力30MPa，萃取溫度50 °C， 二氧化碳流量6L/h， 95%乙醇夾帶劑200mL 條件下先靜萃取120min,后動萃取60min。從分離釜中放出萃取物，減壓蒸發(fā)將乙醇夾帶 劑與萃取物分離，得到夾帶劑和萃取液，所得的夾帶劑可重復使用，萃取液經(jīng)冷凍干燥后 為糖苷型為主的大豆異黃酮原料，見圖2。
步驟2:大豆異黃酮糖苷水解酶的制取
將真菌黑曲霉Ois/^g///^ w/ger)接種在由麥麩2.0 g/L，硫酸銨((NH4)2S04) 1 g/L， 磷酸二氫鉀(KH2P04) 2 g/L ，硫酸鎂(MgS04 '7H20) 0.2 g/L,硫酸亞鐵(FeS04 *7H20) 0.01g/L組成的培養(yǎng)基上，接種量15%、裝液量70mL/100mL三角瓶，發(fā)酵條件為搖瓶轉 速200土5r/min、溫度為30土0.5。C,發(fā)酵3天。將發(fā)酵液于轉速10 000 r/min，溫度4 。C 條件下離心10min，取上清液為e-葡萄糖苷酶粗酶液。用30%~80%飽和度的硫酸銨沉淀 e-葡萄糖苷酶粗酶液；將沉淀物溶于乙酸緩沖液(O.l mol/L， pH5.0;下同)后用Millipore 型超濾器于溫度4。C下離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交換樹脂(DEAE-52)樹脂分離柱， ffl0.2mol/L、 pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集e-葡萄糖苷酶活性部分得到收集 液A，收集液A經(jīng)截留分子量為500-1 000道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮后，進行S印hadex G-100柱層析，收集e -葡萄糖苷酶活性部分得到收集液B;收集液B經(jīng)截留分子量為500-1 OOO道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮，獲得e-葡萄糖苷酶溶液。用0.1mol/L、 pH5.0的乙酸 緩沖液調節(jié)e-葡萄糖苷酶溶液得到酶活力為1500-2000U/mL的大豆異黃酮糖苷水解酶溶
液即黑曲霉e-葡萄糖苷酶溶液。
黑曲霉e-葡萄糖苷酶液態(tài)發(fā)酵條件和酶活力測定見文獻(羅建平，王貴娟，潘利華.黑
曲霉發(fā)酵麥麩生產(chǎn)e-葡萄糖苷酶的工藝優(yōu)化及動力學研究.農(nóng)業(yè)工程學報，2007,23(12): 252-257)。
步驟3:磁性納米固定化酶的制備取1.0g氮化鋁磁性納米粒子加到4.5 ml醋酸緩沖液(pH6.0)中，氮化鋁顆粒平均粒 徑為15-100nm，加入體積分數(shù)(v/v)為2°/。的戊二醛溶液0.5 ml (使戊二醛在磁性納米固 定化酶的制備體系中的終濃度為0.1-0.2%),超聲波分散3-5分鐘，加入50mg/mL黑曲霉e -葡萄糖苷酶溶液511^，在溫度20 'C， pH5.0和轉速100r/min條件下固載3.5h，利用永久磁 鐵收集固定化酶粒子。固定化酶粒子用pH4.0-6.0醋酸緩沖液清洗直至流出液無蛋白檢出， 得到磁性納米固定化酶。
磁性納米固定化酶的制備方法見文獻(潘利華，羅建平，王貴娟，徐學玲，宛雯.磁 性納米顆粒氮化鋁顆粒固定化e-葡萄糖苷酶的性質.催化學報，2008， 29(10): 1021-1026)。
步驟4:糖苷型大豆異黃酮原料的磁性納米固定化酶催化轉化
將上述步驟1獲得的糖苷型大豆異黃酮原料用pH4.5醋酸緩沖液配制成0.5 mg/mL的 溶液，并用l.O 11101/凡的鹽酸調節(jié)所述溶液的？11至4.9-5.1，形成大豆異黃酮糖苷溶液即 溶液D;取上述步驟3中所得的磁性納米固定化酶5.0g加入pH5.0醋酸緩沖液(即溶液E) 中，充分攪拌使其懸浮均勻，形成磁性納米固定化酶懸浮液即溶液F;取溶液D5mL，加 入所述溶液F 2.5 mL以及溶液E 2.5 mL,形成反應混合液;將所述反應混合液在溫度45 °C 條件下反應30min，獲得高大豆異黃酮苷元含量的轉化液。
步驟5:大豆異黃酮苷元的提取
將永久磁鐵條放入上述步驟4取得的轉化液中攪拌1-2分鐘，磁性納米固定化酶被吸 附在永久磁鐵條上，取出永久磁鐵條得到大豆異黃酮苷元溶液和吸附在永久磁鐵條上的磁 性納米固定化酶，磁性納米固定化酶可以重復使用。所得大豆異黃酮苷元溶液用反滲透膜 系統(tǒng)離心脫鹽、濃縮后減壓濃縮得到高純度大豆異黃酮苷元成品1.5 mg。
實施例2
取大豆胚芽粉為超臨界流體萃取富集糖苷型大豆異黃酮的原料，采用四氧化三鐵磁性 納米粒子，其他同實施例l。
即得到高純度大豆異黃酮苷元成品l.l mg。 實施例3:
取脫脂大豆粉為超臨界流體萃取富集糖苷型大豆異黃酮的原料，采用氧化鈦磁性納米 粒子，其他同實施例l。
即得到高純度大豆異黃酮苷元成品0.9 mg。 實施例4:
一種磁性納米固定化酶轉化糖苷型大豆異黃酮原料生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法包括
下列操作步驟
步驟2、大豆異黃酮糖苷水解酶的制取
取完整鷹嘴豆種子在墊有四層紗布的培養(yǎng)皿(直徑12cm)中，放在25 'C培養(yǎng)室內萌發(fā)。 每天早、晚用自來水沖洗并維持一定的濕度。待芽長至l 1.5cm后，用自來水漂洗，加液 氮研磨成勻漿狀，并在0.1M醋酸沖液(pH5.0，下同)中均質24h，均質后于4 °C， 12000 r/min 離心10min，取上清液；向上清液緩慢加入30n/Q 80。/。飽和度(NH4)2SO4進行分級；取沉淀溶于0.1M醋酸緩沖液中，4 'C冰箱透析18-24小時即得粗酶液。粗酶液用Mimpore⑧型超 濾器于4 °(:下離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交換樹脂(DEAE-52)樹脂分離柱，用0.2 mol/L、 pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集P-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液C, 收集液C經(jīng)截留分子量為500-1 000道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮后，進行S印hadex G-100 柱層析，收集i0-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液D;收集液D截留分子量為500-1 000道
爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮，濃縮液即為e-葡萄糖苷酶溶液。調節(jié)e-葡萄糖苷酶溶液得
到酶活力為1500-2000 U/mL的大豆異黃酮糖苷水解酶溶液。
鷹嘴豆e-葡萄糖苷酶提取見文獻(潘利華，羅建平.高活性大豆異黃酮糖苷酶的分
離原料篩選、純化及性質研究.食品科學，2009， 30(1): 164 - 168)。 步驟3、磁性納米固定化酶的制備
取0.5磁性納米粒子加到4.5ml的pH5.0醋酸緩沖液中，然后加入體積分數(shù)(v/v)為 2%戊二醛溶液0.5 ml,中低頻超聲分散3-5分鐘；再按照0.5-10 mL/0.5-1.0 g磁性納米粒 子的比例加入鷹嘴豆(3-葡萄糖苷酶溶液5mL，放置水浴恒溫震蕩器中，溫度20-30'C、轉 速100-150 r/min條件下固定化2-4h，利用永久磁鐵收集固定化酶粒子；固定化酶粒子用 pH4.0-6.0醋酸緩沖液清洗，直至流出液無蛋白檢出，獲得磁性納米固定化酶；
其它步驟同實施例l。
即得到高純度大豆異黃酮苷元成品1.4 mg。
實施例5:
步驟4:糖苷型大豆異黃酮原料的磁性納米固定化酶催化轉化
將上述步驟1獲得的糖苷型大豆異黃酮原料用pH4.5醋酸緩沖液配制成0.5 mg/mL的 溶液，并用l.O 11101/1的鹽酸調節(jié)所述溶液的？11至4.9-5.1，形成大豆異黃酮糖苷溶液即 溶液D;取上述步驟3中所得的磁性納米固定化酶5.0g加入pH5.0醋酸緩沖液中，充分攪 拌使其懸浮均勻，形成磁性納米固定化酶懸浮液即溶液F;取溶液D5mL，加入所述溶液 F5mL，形成反應混合液；將所述反應混合液在溫度45 'C條件下反應30 min，獲得高大 豆異黃酮苷元含量的轉化液。
步驟5:大豆異黃酮苷元的提取
在轉速8 000r/min、溫度4 'C離心15 min條件下，分離高大豆異黃酮苷元含量的轉化 液中的磁性納米固定化酶，獲得大豆異黃酮苷元溶液和磁性納米固定化酶；大豆異黃酮苷 元溶液反滲透膜系統(tǒng)離心脫鹽、濃縮后減壓濃縮得到高純度大豆異黃酮苷元成品(圖l產(chǎn) 品)，磁性納米固定化酶可以重復使用。
其它步驟同實施例l。
即得到高純度大豆異黃酮苷元成品1.5 mg。
權利要求
1、磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)、糖苷型大豆異黃酮原料的超臨界流體萃取富集取用夾帶劑充分潤濕的糖苷型大豆異黃酮原料，在夾帶劑、萃取壓力20-40Mpa、萃取溫度30-50℃的條件下超臨界二氧化碳流體萃取2-4h后，從分離釜中放出萃取物；去除萃取物中的夾帶劑，獲得糖苷型大豆異黃酮原料；(2)、大豆異黃酮糖苷水解酶的提取在由麥麩2. 0g/L，硫酸銨1g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂0.2g/L，硫酸亞鐵0.01g/L組成的培養(yǎng)基上接種黑曲霉，接種量15％，裝液量70mL/100mL三角瓶；在搖瓶轉速200±5r/min、溫度為30±0.5℃條件下發(fā)酵3天；將發(fā)酵液于10000r/min，4℃條件下離心10min，取上清液為β-葡萄糖苷酶粗酶液；用30％～80％飽和度的硫酸銨沉淀β-葡萄糖苷酶粗酶液；將沉淀物溶于0.1mol/L、pH5.0的乙酸緩沖液于溫度4℃下離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交換樹脂DEAE-52樹脂分離柱，用0.2mol/L、pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液A，收集液A經(jīng)截留分子量為500-1000道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮后，進行葡聚糖凝膠柱層析，收集β-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液B；收集液B經(jīng)截留分子量為500-1000道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮，獲得β-葡萄糖苷酶溶液；用0.1mol/L、pH5.0的乙酸緩沖液調節(jié)β-葡萄糖苷酶溶液，得到酶活力為1500-2000U/mL的大豆異黃酮糖苷水解酶溶液即黑曲霉β-葡萄糖苷酶溶液；(3)、磁性納米固定化酶的制備取0. 5-1.0g磁性納米粒子加到4.5ml的pH4.0-6.0醋酸緩沖液中，然后加入體積分數(shù)為2％v/v戊二醛溶液0.5ml，中低頻超聲分散；再按照0.5-10mL/0.5-1.0g磁性納米粒子的比例加入黑曲霉β-葡萄糖苷酶溶液，放置水浴恒溫震蕩器中，溫度20-30℃、轉速100-150r/min條件下固定化2-4h，利用永久磁鐵收集固定化酶粒子；固定化酶粒子用pH4.0-6.0醋酸緩沖液清洗，直至流出液無蛋白檢出，獲得磁性納米固定化酶；(4)、糖苷型大豆異黃酮原料的磁性納米固定化酶催化轉化將糖苷型大豆異黃酮原料用pH4.5醋酸緩沖液配制成0.5-1.0mg/mL的溶液，并用1.0mol//L的鹽酸調節(jié)所述溶液的pH至4.9-5.1，得到大豆異黃酮糖苷溶液；將上述步驟3)中所得的磁性納米固定化酶按照0.8-1.2g/0.8-1.2mL的比例加入pH5.0醋酸緩沖液中，充分攪拌使其懸浮均勻，形成磁性納米固定化酶懸浮液；向所述大豆異黃酮糖苷溶液中加入磁性納米固定化酶懸浮液形成混合液，加入的磁性納米固定化酶懸浮液體積為所述大豆異黃酮糖苷溶液體積的0.5～1倍；將所述混合液在溫度20-50℃條件反應20min-60min，獲得高大豆異黃酮苷元含量的轉化液；(5)、大豆異黃酮苷元的提取離心或外加磁場分離高大豆異黃酮苷元含量的轉化液中的磁性納米固定化酶，獲得大豆異黃酮苷元溶液；大豆異黃酮苷元溶液減壓濃縮得到高純度大豆異黃酮苷元成品。
2、 根據(jù)權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特 征在于所述糖苷型大豆異黃酮原料為脫脂大豆粉或大豆胚芽粉或脫脂豆粕。
3、 根據(jù)權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特 征在于所述步驟(l)的超臨界流體萃取過程所用的夾帶劑為甲醇或乙醇或乙酸乙酯或甲醇 與水的混合溶劑或乙醇與水混合溶劑，加入量為投入原料量的100-300%。
4、 根據(jù)權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特 征在于所述磁性納米粒子為氮化鋁或四氧化三鐵或氧化鈦，其平均粒徑15-100 nm。
5、 根據(jù)權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特 征在于所述步驟(5)的離心條件為5 000-10 000 r/min、 2-8 。C離心15-20 min。
6、 根據(jù)權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特 征在于所述外加磁場分離的具體操作方法是，將永久磁鐵條放入上述步驟(4)取得的轉化 液中攪拌l-2分鐘，磁性納米固定化酶被吸附在永久磁鐵條上。
7、 根據(jù)權利要求1所述的磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法，其特征在于所述大豆異黃酮糖苷水解酶的提取取發(fā)芽、芽長1-1.5 cm的鷹嘴豆，加液氮研磨成勻漿狀，并在O. 1 Mol/L、 pH5. 0醋 酸沖液中均質24h，在溫度4 。C、 12000 r/min條件下離心10min，取上清液；向上清液 緩慢加入30%-80%飽和度硫酸銨進行分級；取沉淀溶于O. 1Mol/L醋酸緩沖液中，4 'C冰箱 透析18-24小時即得粗酶液；在溫度4。C條件，粗酶液離心脫鹽、濃縮；濃縮液上離子交 換樹脂樹脂分離柱，用0.211101化、pH6.8的磷酸緩沖液洗脫樹脂分離柱，收集e-葡萄糖苷 酶活性部分得到收集液C，收集液C經(jīng)截留分子量為500-1 OOO道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心 濃縮后，進行S印hadex G-100柱層析，收集^-葡萄糖苷酶活性部分得到收集液d;收集液d經(jīng)截留分子量為50o-i ooo道爾頓的超濾膜系統(tǒng)離心濃縮，濃縮液即為鷹嘴豆e -葡萄糖苷酶溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及磁性納米固定化酶催化生產(chǎn)大豆異黃酮苷元的方法。本發(fā)明方法包括以下操作步驟(1)糖苷型大豆異黃酮原料的超臨界流體萃取富集；(2)大豆異黃酮糖苷水解酶的提?。?3)磁性納米固定化酶的制備；(4)糖苷型大豆異黃酮原料的磁性納米固定化酶催化轉化；(5)大豆異黃酮苷元的提取。用本發(fā)明的制備方法，超臨界萃取工藝簡單易操作，操作過程二氧化碳無毒、無殘留，糖苷萃取率高；磁性納米固定化酶制備方法簡單，可以通過外部磁場將酶簡捷的回收、反復使用；制備的產(chǎn)品大豆異黃酮苷元結構和生理活性不受破壞，含量高。本發(fā)明方法生產(chǎn)的大豆異黃酮苷元產(chǎn)品中大豆異黃酮苷元濃度之和為82.7％，金雀異黃素含量為90.3％。
文檔編號C12N11/00GK101532039SQ20091011640
公開日2009年9月16日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權日2009年3月25日
發(fā)明者徐學玲, 查學強, 潘利華, 王貴娟, 羅建平 申請人:合肥工業(yè)大學